蘇秋香，姚波，王旭光，楊麗，張素君，丁曉慧

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽110034；2.沈陽市第四人民醫(yī)院口腔科；3.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理解剖學(xué)教研室；4.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬衛(wèi)生學(xué)?？谇粚W(xué)教研室；5.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)專業(yè)2012級(jí)3班；6.組織與胚胎學(xué)教研室）

8-oxodG在口腔黏膜白斑中的表達(dá)

蘇秋香1，姚波2，王旭光3，楊麗4，張素君5，丁曉慧6*

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽110034；2.沈陽市第四人民醫(yī)院口腔科；3.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理解剖學(xué)教研室；4.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬衛(wèi)生學(xué)校口腔學(xué)教研室；5.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)專業(yè)2012級(jí)3班；6.組織與胚胎學(xué)教研室）

目的：研究8-氧-7，8-二氫-2'-脫氧鳥嘌呤核苷（8-oxo-7，8-dihydro-2'-deoxyguanosine，8-oxodG）在口腔黏膜白斑中的表達(dá)，探討氧化性DNA損傷在口腔黏膜白斑發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。方法：應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)10例正?？谇火つず?0例口腔黏膜白斑中8-oxodG和抑癌基因P53蛋白的表達(dá)。結(jié)果：HE染色可見口腔黏膜白斑中炎性細(xì)胞浸潤，過角化和上皮異型性增生等組織病理學(xué)變化。免疫熒光標(biāo)記顯示8-oxodG在口腔黏膜白斑中生成，并可見抑癌基因P53蛋白的表達(dá)?？谇火つぐ装咧?-oxodG和P53蛋白的陽性表達(dá)率高于正?？谇火つぃ≒＜0.01）；8-oxodG、P53在正?？谇火つぁ⒖谇火つぐ装甙榛虿话楫愋托栽錾年栃员磉_(dá)程度具有相關(guān)性，與病變程度呈正相關(guān)（r=0.773，P＜0.01）。結(jié)論：氧化性DNA損傷在口腔黏膜白斑的發(fā)生過程中起著重要作用，8-oxodG可作為口腔黏膜白斑病變程度的風(fēng)險(xiǎn)性預(yù)測(cè)標(biāo)志物。

口腔黏膜白斑；8-氧-7，8-二氫-2'-脫氧鳥嘌呤核苷；氧化性DNA損傷；P53

［Abstract］Objective：To study the expression of 8-oxo-7，8-dihydro-2'-deoxyguanosine（8-oxodG）in oral leukoplakia for clarifying the role of oxidative DNA damage in the development of oral leukoplakia.Methods：Immunofluorescence labeling method was used to examine the expression of 8-oxodG，a marker of oxidative DNA damage，and the expression of tumor suppressor gene，P53 protein in oral epithelium of normal oral mucosa and biopsy specimens of leukoplakia.Results：In specimens of oral leukoplakia，HE staining showed infiltration of inflammatory cells，hyperkeratosis and epithelial dysplasia.Immunofluorescence labeling study demonstrated that the accumulation of 8-oxodG apparently increased in the oral epithelium of patients with leukoplakia，whereas little or no immunoreactivity was observed in normal oral mucosa.Expression of P53 protein was also observed in oral epithelium of patients with oral leukoplakia.The immunoreactivity of 8-oxodG and P53 was stronger in patients with oral leukoplakia than that in normal oral mucosa（P＜0.01）.Moreover，the immunoreactivity increased with the development of disease（r=0.773，P＜0.01）.Conclusions：The oxidative DNA damage contributes to the development of oral leukoplakia.8-oxodG may be a risk predictive marker for oral leukoplakia.

［Key words］oral leukoplakia；8-oxo-7，8-dihydro-2'-deoxyguanosine；oxidative DNA damage；P53

口腔黏膜白斑是以白斑和過角化為特征的一種癌前病變［1］。5%～15%的口腔黏膜白斑在組織學(xué)上發(fā)生異型性增生。上皮細(xì)胞異型性增生的出現(xiàn)是癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，部分伴有上皮細(xì)胞異型性增生的口腔黏膜白斑可發(fā)展為口腔癌［2］?；钚匝鯀⑴c癌前病變的發(fā)生，抗氧化劑能抑制口腔黏膜白斑等癌前病變損傷的發(fā)生。活性氧通過導(dǎo)致氧化性DNA損傷標(biāo)志物——8-氧-7，8-二氫-2'-脫氧鳥嘌呤核苷（8-oxo-7，8-dihydro-2'-deoxyguanosine，8-oxodG）生成，參與癌的發(fā)生過程［3］。

口腔黏膜白斑常伴有慢性炎癥。發(fā)生口腔黏膜白斑時(shí)，炎癥介質(zhì)COX-2的表達(dá)增加。炎癥發(fā)生時(shí)，一氧化氮合成酶催化一氧化氮的生成，且導(dǎo)致多種活性氮和活性氧的產(chǎn)生。但氧化性DNA損傷是否參與口腔黏膜白斑的發(fā)生及其在口腔黏膜白斑發(fā)生發(fā)展過程中的作用鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過HE染色觀察口腔黏膜白斑患者的組織病理學(xué)改變，利用免疫熒光染色檢測(cè)8-oxodG和抑癌基因P53蛋白在口腔黏膜白斑中的表達(dá)，旨在闡明氧化性DNA損傷在口腔黏膜白斑發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1　材料與方法

1.1樣本收集選取20例口腔黏膜白斑患者的活檢樣本，其中男7例，女13例，平均年齡（63.9± 9.6）歲；10例正?？谇火つ颖咀鳛閷?duì)照，其中男3例，女7例，平均年齡（67.7±10.1）歲。

1.2試劑與儀器鼠單克隆抗8-oxodG抗體（日本Fukuroi公司），Alexa 488-標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（美國Molecular Probes公司），鼠單克隆抗P53抗體（美國Sigma公司），共聚焦熒光顯微鏡（LSM410，德國Zeiss公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣本制備標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制作6μm厚石蠟切片。

1.3.2HE染色石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，切片在蘇木素染液中染色15 min，鹽酸乙醇分化15 s，流水沖洗藍(lán)化1 h，伊紅染色10 min。切片經(jīng)脫水透明，然后封片。

1.3.3免疫熒光染色石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，利用免疫熒光染色檢測(cè)8-oxodG的免疫反應(yīng)性。切片在鼠單克隆抗8-oxodG抗體（5μg/ml）4℃孵育過夜；然后在Alexa 488-標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶400）室溫孵育2 h。染色后的切片在共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

用鼠單克隆抗P53抗體（1∶400）代替8-oxodG抗體，進(jìn)行免疫熒光染色，檢測(cè)P53的免疫反應(yīng)性。

1.4陽性評(píng)價(jià)所有切片采用雙盲法由2位病理學(xué)專業(yè)教師獨(dú)立閱片。根據(jù)8-oxodG和P53免疫染色陽性細(xì)胞數(shù)對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行等級(jí)評(píng)價(jià)：每張切片隨機(jī)觀察3個(gè)高倍視野，根據(jù)陽性細(xì)胞的比率進(jìn)行評(píng)估，陽性細(xì)胞百分率＜10%為陰性（-）；陽性細(xì)胞百分率10%～50%為弱陽性（+），陽性細(xì)胞百分率＞50%為強(qiáng)陽性（++）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，采用Pearson相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1口腔黏膜白斑患者的黏膜上皮組織病理學(xué)改變HE染色顯示口腔黏膜白斑患者口腔黏膜上皮層和上皮下固有層可見炎性細(xì)胞浸潤，部分患者可見過角化，上皮基底層可見異型性增生（不伴異型性增生患者10例，伴異型性增生患者10例），見圖1。

圖1　口腔黏膜白斑患者口腔黏膜活檢標(biāo)本（HE染色，×200）

2.28-oxodG在口腔黏膜上皮的表達(dá)8-oxodG的免疫陽性見于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞主要分布于上皮基底層，上皮組織與結(jié)締組織鄰接處，固有層也可見染成綠色的陽性細(xì)胞核，見圖2；正?？谇火つの匆?-oxodG的表達(dá)。

2.3P53在口腔黏膜上皮的表達(dá)P53免疫反應(yīng)性分布于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞主要分布于上皮基底層，上皮淺層陽性細(xì)胞散在分布，固有層也可見染成綠色的陽性細(xì)胞核，見圖3；正常口腔黏膜未見P53的表達(dá)。

圖2　8-oxodG在口腔黏膜白斑中的表達(dá)（免疫熒光染色，×200）

圖3　P53蛋白在口腔黏膜白斑中的表達(dá)（免疫熒光染色，×200）

2.48-oxodG和P53的生成與口腔黏膜白斑的關(guān)系

8-oxodG、P53在正常口腔黏膜表達(dá)均呈陰性；在口腔黏膜白斑伴或不伴異型性增生患者的口腔黏膜上皮表達(dá)陽性率與正?？谇火つけ容^差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1和表2。Pearson相關(guān)分析顯示8-oxodG、P53在正?？谇火つ?、口腔黏膜白斑伴或不伴異型性增生的陽性表達(dá)程度具有相關(guān)性，與病變程度呈正相關(guān)（r=0.773，P＜0.01）。

表1　8-oxodG在口腔黏膜白斑和正常口腔黏膜中表達(dá)強(qiáng)度的比較

表2　P53蛋白在口腔黏膜白斑和正?？谇火つぶ斜磉_(dá)強(qiáng)度的比較

3　討論

本研究顯示口腔黏膜白斑患者HE染色圖片可見炎性細(xì)胞浸潤和上皮異型性增生等組織病理學(xué)改變，與以前報(bào)道［1］一致。8-oxodG作為氧化性DNA損傷標(biāo)志物在口腔黏膜白斑中生成，免疫陽性細(xì)胞見于上皮基底層細(xì)胞核。炎癥時(shí)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞可產(chǎn)生O2-，一氧化氮合成酶介導(dǎo)一氧化氮（NO）的生成，NO與O2-反應(yīng)生成ONOO-，進(jìn)而導(dǎo)致氧化性DNA損傷，使8-oxodG生成［4］。8-oxodG生成導(dǎo)致DNA中G-T堿基對(duì)轉(zhuǎn)換從而參與癌的發(fā)生［5］。此外，8-oxodG的陽性表達(dá)程度與口腔黏膜白斑患者的病變程度密切相關(guān)，具有上皮異型性增生的口腔黏膜白斑患者8-oxodG均強(qiáng)表達(dá)。因此，我們推測(cè)由活性氧導(dǎo)致的氧化性DNA損傷可能參與口腔黏膜白斑的發(fā)生發(fā)展過程。本研究首次報(bào)道氧化性損傷參與口腔黏膜白斑的發(fā)展過程。

本研究結(jié)果顯示P53在大部分口腔黏膜白斑患者的上皮細(xì)胞呈陽性表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度與口腔上皮異型性增生的發(fā)生密切相關(guān)，具有上皮異型性增生的口腔黏膜白斑患者P53表達(dá)均強(qiáng)陽性，P53蛋白在口腔黏膜白斑患者的表達(dá)與上皮損傷的程度相關(guān)，與以前報(bào)道［6-7］一致。有報(bào)道稱高濃度的NO可導(dǎo)致P53蛋白的表達(dá)［8］，P53蛋白表達(dá)是DNA損傷的重要反應(yīng)［9-10］，P53在基底層淺部的表達(dá)與口腔癌的發(fā)生密切相關(guān)［11-12］。許多研究認(rèn)為p53基因的突變是癌發(fā)生發(fā)展過程中最為普遍的基因現(xiàn)象，免疫組化法檢測(cè)到的P53蛋白即為突變型P53［13］。口腔黏膜白斑的癌病率為0.19%～19.18%［14］。

總之，氧化性DNA損傷在口腔黏膜白斑的發(fā)生過程中起著重要的作用，隨著病變程度上皮異型性增生的出現(xiàn)，8-oxodG和P53的免疫陽性表達(dá)增強(qiáng)。因此，8-oxodG的生成可作為評(píng)價(jià)口腔黏膜白斑癌前病變程度的生物指標(biāo)和口腔癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性預(yù)測(cè)指標(biāo)。

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［14］袁月.口腔粘膜白斑的研究進(jìn)展［J］.大家健康，2015，9

（13）；286-287.

Expression of 8-oxodG in Oral Leukoplakia

SU Qiuxiang1，YAO Bo2，WANG Xuguang3，YANG Li4，ZHANG Sujun5，DING Xiaohui6*
（1.Morphology Laboratory，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Department of Stomatology，The 4th People's Hospital of Shenyang；3.Department of Pathology，Shenyang Medical College；4.Department of Stomatology；5.Grade 2012，Class 3；6.Department of Histology and Embryology）

R329

A

1008-2344（2016）05-0325-03

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.05.002

2016-03-06

（文敏 編輯）

遼寧省教育廳科研課題（No.L2014406）；沈陽醫(yī)學(xué)院大學(xué)生課題（No.20150806）

蘇秋香（1963—），女（漢），高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：形態(tài)學(xué)方面研究.E-mail：2283800016@qq.com

丁曉慧（1971—），女（漢），教授，研究方向：心腦血管缺血性疾病.E-mail：1285448068@qq.com