劉永利 王常順 王曉蕾 楊抒楠 劉興國 馮麗

摘要：建立了二維柱切換超高效液相色譜法同時(shí)測定明目地黃丸中莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚含量的方法。一維色譜柱為Thermo Accucore XL C18（250 mm × 2.1 mm， 4 μm），二維色譜柱為DIONEX Acclaim phenyl1（150 mm × 4.6 mm， 3 μm），一維分析流動(dòng)相為乙腈水，梯度洗脫，二維分析流動(dòng)相為乙腈水，等度洗脫，14.5 min進(jìn)行閥切換；檢測波長：0～14.5 min為240 nm，14.5～30 min為275 nm，流速： 0.5 mL/min，柱溫： 30℃。30 min即可完成明目地黃丸中莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚的含量測定，并有效地將莫諾苷同分異構(gòu)體分離。莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚的線性范圍分別為7.6～377 mg/L， 9.2～459 mg/L， 8.4～419 mg/L和8.2～409 mg/L，相關(guān)系數(shù)為0.9999，加樣回收率為98.3%～100.2%。本方法快捷高效，可對控制明目地黃丸質(zhì)量提供參考。

關(guān)鍵詞 ：在線二維柱切換超高效液相色譜法； 明目地黃丸； 莫諾苷； 馬錢苷； 芍藥苷； 丹皮酚； 同分異構(gòu)體

1 引 言

明目地黃丸由熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、枸杞子、當(dāng)歸、白芍、山藥、茯苓、澤瀉、菊花、蒺藜、煅石決明等12味藥組成，具有滋腎、養(yǎng)肝、明目之功效。方中熟地黃滋補(bǔ)腎陰，填精益髓，為君藥，約占處方比例的18%，山藥、酒萸肉、煅石決明各占處方的9%，其余8味分別占處方的7%，由于各味藥成分復(fù)雜，其質(zhì)量較難控制。《中國藥典》2015年版一部分別采用了3種色譜系統(tǒng)測定酒萸肉、白芍、牡丹皮三味藥材中所含主要活性成分[1～3]馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚等3種成分的含量，操作費(fèi)時(shí)。由于馬錢苷與丹皮酚等成分極性相差較大，文獻(xiàn)報(bào)道也多采用不同色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離測定[4～6]。莫諾苷（C17H26O11）是一種環(huán)烯醚萜苷化合物，為酒萸肉的主要活性成分，對缺血性腦損傷具有保護(hù)和修復(fù)作用，對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用較強(qiáng)，根據(jù)7位的羥基朝向不同，有7α和7β 兩種異構(gòu)體（圖1），文獻(xiàn)對其分析方法研究較少[7，8]。近年來，二維液相色譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于復(fù)雜體系的分離[9，10]，大大提高了分離效率，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)測定成分的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用在線二維柱切換技術(shù)，使用了兩種不同類型的色譜柱，同時(shí)對莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚進(jìn)行分析測定，還將莫諾苷兩種異構(gòu)體進(jìn)行了分離，為更好地控制明目地黃丸的質(zhì)量，研究其物質(zhì)基礎(chǔ)提供了參考依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Ultimate 3000超高效液相色譜儀， 配雙三元梯度泵、帶有一個(gè)十通閥的柱溫箱、二極管陣列檢測器；AE240電子天平（瑞士Mettler公司）；Integral 10 MilliQ超純水儀（德國Millipore公司）。

對照品：莫諾苷（北京市藥品檢驗(yàn)所提供，批號(hào)：201304，含量以100%計(jì)），馬錢苷（中國食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：111640200503），芍藥苷（中國食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：110736201438，含量以96.4%計(jì)），丹皮酚（中國食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：110708200505）。

試劑：乙腈為色譜純；水為超純水；其它試劑均為分析純。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取莫諾苷9.44 mg、馬錢苷11.48 mg、芍藥苷10.87 mg、丹皮酚10.24 mg，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，作為對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液的配制

取本品水蜜丸適量（浙江某藥業(yè)，批號(hào)：110305），研細(xì)（過4號(hào)篩），準(zhǔn)確稱取0.7 g，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇25 mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理30 min，放置至室溫，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)濾膜過濾，待測。

2.3 色譜條件

一維色譜柱為Thermo Accucore XL C18（250 mm×2.1 mm，4 μm），左泵：乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，梯度洗脫： 0～5 min，6%A；5～12 min， 6%～10% A；12～15 min， 10%～70% A；15～20 min，70% A；20～26 min，70%～90% A。二維色譜柱為DIONEX Acclaim phenyl1（150 mm×4.6 mm，3 μm），右泵：流動(dòng)相：乙腈水（30∶70， V/V）等度洗脫；柱溫：30℃；檢測波長： 0～14.5 min，240 nm；14.5～30 min，275 nm；流速： 0.5 mL/min；閥切換時(shí)間：0 min，1→2； 14.5 min，1→10； 26 min，1→2。進(jìn)樣量： 2 μL。系統(tǒng)連接見圖2。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜柱的選擇

莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚極性相差較大，而且明目地黃丸成分復(fù)雜，在一根色譜柱上對4種組分進(jìn)行分離，保留時(shí)間長，芍藥苷、丹皮酚與雜質(zhì)峰分離度差，峰形拖尾嚴(yán)重。本研究采用二維色譜柱進(jìn)行分離，考察了3種不同類型的C18色譜柱，在Accucore XL C18色譜柱上，目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰分離較好，Accucore XL C18色譜柱是基于Core Enhanced TechnologyTM （表面多孔增強(qiáng)核技術(shù)）結(jié)合相鍵合與柱填充技術(shù)的新一代色譜柱，對非極性分析物具有強(qiáng)保留，還很好地區(qū)分了莫諾苷的兩種同分異構(gòu)體。在Accucore XL C18色譜柱上，丹皮酚有較多雜質(zhì)峰干擾，遂采用閥切換將其轉(zhuǎn)移到二維的苯基柱上進(jìn)行分離。苯基柱對于含有苯環(huán)和共軛結(jié)構(gòu)的丹皮酚的分離非常適合，與干擾峰得到很好的分離（圖3）。

3.2 流動(dòng)相及閥切換的選擇

分別選擇乙腈0.1%磷酸、乙腈水與甲醇水等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明，乙腈水各目標(biāo)化合物峰形好，基線平穩(wěn)。借助Ultimate 3000雙三元的閥切換技術(shù)，采用兩種不同類型的色譜柱，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷在一維色譜進(jìn)行分離，在芍藥苷出峰后，即切換到二維色譜上對丹皮酚進(jìn)行分離，最終達(dá)到好的分離度與較高的柱效。

3.3 檢測波長的選擇

分別稱取莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚對照品適量，用50%甲醇配制成適宜濃度的對照品溶液，在200～400 nm進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果表明，莫諾苷＼，馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚的最大吸收峰分別位于240， 237， 230和275 nm處。在確保準(zhǔn)確測定的基礎(chǔ)上，選擇240 nm作為莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷的測定波長，275 nm作為丹皮酚的測定波長。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別準(zhǔn)確移取2.2.1節(jié)制備的對照品儲(chǔ)備液適量，加50%甲醇稀釋成5個(gè)不同濃度的混合對照品溶液，進(jìn)樣測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

3.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取線性中間點(diǎn)混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果表明，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚峰面積RSD分別為0.6%， 0.5%， 0.8%. 0.7%，表明儀器精密度良好。

3.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：20130713），研細(xì)，分別準(zhǔn)確稱取0.35， 0.70和1.05 g各3份，按2.2.2節(jié)方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定。莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚含量分別為0.672， 0.521， 1.376和0.464 mg/g，RSD分別為0.6%， 0.2%， 0.2%和0.3%，表明本方法重復(fù)性良好。

3.4.4 回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：20130713），研細(xì)，精密稱取9份，每份約0.35 g，每3份為一組，分別精密加入用50%甲醇溶液配制的低、中、高三個(gè)濃度的混合對照品溶液25 mL，按2.2.2節(jié)項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚回收率分別為98.37%， 99.50%， 100.24%和100.22%，RSD分別為0.80%， 0.70%， 0.53%和0.96%。結(jié)果表明，本方法回收率良好。

3.4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別在0， 1， 3， 5， 9和24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚峰面積RSD分別為1.07%， 1.47%， 0.81%和0.28%，表明供試品溶液至少可穩(wěn)定24 h。

3.5 樣品測定結(jié)果

取不同企業(yè)樣品10批，按2.2.2節(jié)制備供試品溶液，在2.3節(jié)色譜條件下測定，結(jié)果見表2。各企業(yè)樣品含量差距較大，可能是由于藥材產(chǎn)地、采收期等原因造成。

分析結(jié)果表明，本方法有效地減少了明目地黃丸中雜質(zhì)對目標(biāo)化合物的干擾，提高了樣品檢測效率，具有較普遍的適用性。

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Abstract An online Twodimensional column switching ultra performance liquid chromatography （2DUPLC） method was established for simultaneous quantification of morroniside， loganin， peoniflorin， paeonol in Mingmudihuang Pill. The firstdimensional column was Thermo Accucore XL C18 （250 mm ×2.1 mm， 4 μm） while the seconddimensional column was DIONEX Acclaim phenyl1 （150 mm×4.6 mm， 3 μm）. Acetonitrile and water were used as mobile phase with a gradient elution in the firstdimensional analysis and the seconddimensional analysis used acetonitrilewater as mobile phase with a isocratic elution. The valve switching time was 14.5 min， the detection wavelength was set at 240 nm in 0-14.5 min and 275 nm in 14.5-30 min. The flow rate was 0.5 mL/min， and the column temperature was 30℃. The determination of four compounds in Mingmudihuang Pill was completed in 30 min and it could effectually segregate the isomer of morroniside. The linear ranges of morroniside， loganin， peoniflorin and paeonol were 7.6-377 mg/L， 9.2-459 mg/L， 8.4-419 mg/L and 8.2-409 mg/L， respectively， and all the correlation coefficients （r） were>0.9999. The recoveries of the four compounds were 98.3%-100.2%. It was proved that this method could greatly improve the sufficiency of sample analysis and could control the quality of Mingmudihaung Pill efficiently.

Keywords Online twodimensional column switching ultra performance liquid chromatography； Mingmudihuang pill； Morroniside； Loganin； Peoniflorin； Paeonol； Isomer