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        基于切刻內(nèi)切酶信號(hào)放大的電致化學(xué)發(fā)光DNA生物傳感器的研究

        2016-10-21 12:36:27海洪黃文剛梁順超李建平
        分析化學(xué) 2016年5期

        海洪 黃文剛 梁順超 李建平

        摘要:利用切刻內(nèi)切酶的酶切作用實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大,結(jié)合量子點(diǎn)高效的電化學(xué)發(fā)光性能,構(gòu)建了一種新型電化學(xué)發(fā)光DNA生物傳感器。將捕獲探針DNA(cDNA)通過自組裝的方式固定到金電極表面,后與目標(biāo)DNA(tDNA)互補(bǔ)雜交形成雙鏈DNA,利用切刻內(nèi)切酶Nt.BstNBI特異性識(shí)別雙鏈上的酶切位點(diǎn)(5′GAGTC3′),然后在cDNA相應(yīng)的切割位點(diǎn)(識(shí)別序列3′端后的4個(gè)堿基處)對(duì)其進(jìn)行剪切,釋放出目標(biāo)鏈,參與下一輪的雜交及酶切,通過目標(biāo)物的循環(huán)利用,實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。利用N羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1乙基33二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC)活化羧基化CdTe量子點(diǎn)表面的羧基,與電極表面殘留的cDNA末端的氨基共價(jià)交聯(lián),通過測(cè)定捕獲的量子點(diǎn)的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)對(duì)目標(biāo)DNA 進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)化后的檢測(cè)條件為:cDNA濃度1 μmol/L, 雜交時(shí)間60 min,Nt.BstNBI濃度0.5 U/μL,酶切反應(yīng)時(shí)間4 h。在優(yōu)化條件下,目標(biāo)DNA濃度在2.0 × 10mol/L范圍內(nèi),其對(duì)數(shù)與電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系,檢出限為7.3×10 mol/L。人體血樣加標(biāo)回收率為96.4%~108.0%。

        關(guān)鍵詞 :DNA生物傳感器;切刻內(nèi)切酶;量子點(diǎn);電致化學(xué)發(fā)光;信號(hào)放大

        1 引 言

        近年來,隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展,低濃度特定DNA序列的超靈敏檢測(cè)在臨床診斷、基因突變檢測(cè)等生物學(xué)研究中顯示出越來越重要的作用和意義[1~4]。與熒光法[5]、石英晶體微天平法[6]、比色法[7]等眾多的DNA檢測(cè)方法相比,電化學(xué)發(fā)光法因其方法簡(jiǎn)單、響應(yīng)速度快、靈敏度高和選擇性好而得到了廣泛應(yīng)用[8~10]。

        目標(biāo)放大和信號(hào)放大是提高DNA檢測(cè)靈敏度的兩種常用方法。傳統(tǒng)的目標(biāo)放大方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[11]、依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(NASBA)[12]等因高的放大效率、靈敏的檢測(cè)效果而被廣泛應(yīng)用[13]。然而這些方法一般都需要特殊的設(shè)備或昂貴的檢測(cè)儀器,存在耗時(shí)、易污染、成本高、操作不便等缺點(diǎn)[14]。相比之下,通過目標(biāo)物提高檢測(cè)靈敏度的信號(hào)放大技術(shù),快速、簡(jiǎn)便,已成為超靈敏檢測(cè)DNA的研究熱點(diǎn)之一[15~18]。切刻內(nèi)切酶信號(hào)放大是近年來逐漸采用的低濃度核酸的檢測(cè)方法[19]。探針DNA與目標(biāo)DNA結(jié)合成雙鏈時(shí),形成切刻內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn),內(nèi)切酶對(duì)探針DNA進(jìn)行剪切,使得目標(biāo)DNA被釋放出來,并進(jìn)行循環(huán)利用,實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大[20~24]。

        電化學(xué)發(fā)光法不僅具有化學(xué)發(fā)光分析的靈敏度高、線性范圍寬和儀器簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),而且電化學(xué)分析控制性強(qiáng),選擇性好[25]。量子點(diǎn)作為一種新興的納米材料,因其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì),如高穩(wěn)定性、不易分解、熒光壽命長(zhǎng)等[26],已被作為生物傳感器的標(biāo)記物和信號(hào)探針[27]。近年來,利用量子點(diǎn)高效及穩(wěn)定的電化學(xué)發(fā)光性能研制的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器備受關(guān)注[28~31]。然而,將量子點(diǎn)優(yōu)異的電化學(xué)發(fā)光性能與切刻內(nèi)切酶的特異性相結(jié)合,進(jìn)行目標(biāo)物測(cè)定的研究至今未見報(bào)道。

        本研究基于切刻內(nèi)切酶的信號(hào)放大和量子點(diǎn)高效的電化學(xué)發(fā)光性能,建立了超靈敏檢測(cè)DNA的方法。通過自組裝方式將捕獲DNA(cDNA)固定在電極表面,靶DAN分子(tDNA)與其特異性雜交形成雙鏈,利用切刻內(nèi)切酶對(duì)形成的雙鏈中的cDNA進(jìn)行識(shí)別和切割,釋放出tDNA序列,參與下一輪的雜交和酶切。本傳感器制作簡(jiǎn)單,靈敏度高,選擇性好,具有良好的應(yīng)用前景。

        2 實(shí)驗(yàn)部分

        2.1 儀器與試劑

        MPIE 型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司),采用三電極系統(tǒng):工作電極為金電極(直徑2 mm),參比電極為Ag/AgCl(飽和KCl)電極,對(duì)電極為鉑絲電極。PGSTAT128N Autolab 電化學(xué)工作站(瑞士萬通有限公司);UV2400PC紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司);F7000 熒光儀(日本日立公司)。

        氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)、碲粉(Te)、硼氫化鈉(NaBH4)、巰基乙酸(TGA)、巰基乙醇(MCH)、N羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1乙基33二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC)購于上海Aladdin公司;切刻內(nèi)切酶Nt.BstNBI(New England Biolabs有限公司);其它試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。DNA序列均購自于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,使用時(shí)用TE緩沖液(10 mmol/L TrisHCl, 1 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, pH 8.0)進(jìn)行配制和稀釋,堿基序列如表1所示。

        2.2 水溶性量子點(diǎn)的制備

        CdTe水溶性量子點(diǎn)合成方式參考文獻(xiàn)[32]的方法并稍做改進(jìn)。將250 mL 0.0025 mol/L CdCl2溶液倒入三口燒瓶中,磁力攪拌,通氮?dú)獬?5 min,接著加入100 μL TGA,并用NaOH調(diào)節(jié)至pH≈10,繼續(xù)通氮?dú)?0 min,封口。

        量取3 mL二次蒸餾水倒入另一個(gè)50 mL 三口燒瓶中,同樣通氮?dú)獬?。稱取0.36 g NaBH4和0.144 g Te粉加入水中,在65℃水浴和磁力攪拌下反應(yīng),直到黑色Te粉完全消失,得到紫色透明的NaHTe溶液。將得到的溶液倒入上述含有CdCl2溶液的三口燒瓶中,95℃水浴中攪拌回流2 h,得顏色透明的CdTe水溶性量子點(diǎn)。

        2.3 電化學(xué)發(fā)光DNA生物傳感器的制備

        將金電極用0.05 μm Al2O3拋光至鏡面,分別置于50% (V/V) HNO3、無水乙醇、水中超聲清洗后,浸入含有1 μmol/L cDNA溶液中過夜,cDNA通過SAu鍵自組裝在電極表面。將修飾電極浸入到巰基乙醇溶液中,避光孵育1 h,封閉其非特異性結(jié)合位點(diǎn),分別用0.1 mol/L PBS緩沖液和0.5 mol/L NaCl溶液清洗,制得電化學(xué)發(fā)光DNA生物傳感器。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 電化學(xué)發(fā)光DNA生物傳感器的檢測(cè)原理

        如圖1所示,巰基化的捕獲探針cDNA通過自組裝方式固定在金電極表面,tDNA與其雜交形成雙鏈,利用切刻內(nèi)切酶特異性識(shí)別酶切位點(diǎn)(5′GAGTC3′),在其相應(yīng)的切割位點(diǎn)(識(shí)別序列3′末端后的4個(gè)堿基處)對(duì)cDNA進(jìn)行剪切,同時(shí)也破壞了雙鏈DNA結(jié)構(gòu),tDNA被釋放出來[4,17],參與下一輪的雜交和酶切,從而循環(huán)利用目標(biāo)物。采用EDC/NHS活化帶有羧基的TGACdTe量子點(diǎn),通過縮合反應(yīng)標(biāo)記在末端氨基化的cDNA鏈上,最后,在共反應(yīng)劑K2S2O8存在下,通過測(cè)定量子點(diǎn)的電化學(xué)發(fā)光信號(hào),實(shí)現(xiàn)DNA的超痕量檢測(cè)。

        3.2 量子點(diǎn)的表征

        由制備的CdTe量子點(diǎn)的掃描電鏡圖(圖2A)可見,量子點(diǎn)均勻分散,粒徑約為10 nm。圖2B為制備的CdTe量子點(diǎn)的吸收曲線和熒光曲線,量子點(diǎn)最大吸收波長(zhǎng)為580 nm,當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為355 nm時(shí),量子點(diǎn)的最大發(fā)射波長(zhǎng)為566 nm,表明所制備的量子點(diǎn)具有一定熒光性質(zhì)。

        3.6 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

        cDNA自組裝在電極表面的量直接影響測(cè)定的靈敏度。按照2.3節(jié)步驟,在一定濃度的tDNA及內(nèi)切酶作用下,考察了cDNA 濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。從圖6a可見,隨著cDNA 濃度增大,ECL信號(hào)明顯增強(qiáng),大約1 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值;濃度繼續(xù)增加,信號(hào)緩慢下降。這可能是由于電極表面探針過多,密度過大,電極表面空間位阻增大[34],阻礙了量子點(diǎn)與cDNA縮合反應(yīng),使得ECL信號(hào)減弱;同時(shí)也影響雜交效率,不利于酶的作用。因此cDNA最佳濃度選用1 μmol/L。

        DNA的雜交時(shí)間的影響如圖6b所示。隨著cDNA與tDNA雜交時(shí)間延長(zhǎng),ECL信號(hào)逐漸減弱并趨向于穩(wěn)定,60 min后基本穩(wěn)定。因此,本實(shí)驗(yàn)雜交時(shí)間選擇60 min。

        切刻內(nèi)切酶是本實(shí)驗(yàn)中一個(gè)重要的影響因素,因此對(duì)酶濃度和酶切反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,在0.2~0.7 U/μL范圍內(nèi),隨著酶濃度增加,ECL信號(hào)逐漸減弱,在0.5 U/μL后信號(hào)基本穩(wěn)定,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇酶濃度為0.5 U/μL。在1~6 h的酶反應(yīng)時(shí)間內(nèi),隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng),ECL信號(hào)逐漸降低,4 h后,ECL信號(hào)達(dá)到基本穩(wěn)定。因此,選擇酶的最佳反應(yīng)時(shí)間為4 h。

        4 結(jié) 論

        在本研究中,基于切刻內(nèi)切酶進(jìn)行目標(biāo)物循環(huán)利用放大檢測(cè)信號(hào),結(jié)合CdTe量子點(diǎn)良好的電化學(xué)發(fā)光性能,成功制備了一種超靈敏檢測(cè)DNA的新型生物傳感器,對(duì)DNA具有較低的檢出限、良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,可應(yīng)用于人血中核酸的靈敏檢測(cè)。

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        Abstract A novel electrochemiluminescence (ECL) DNA biosensor based on nicking endonuclease and the efficient ECL property of quantum dots(QDs) assisted signal amplification was developed. The capture probe DNA(cDNA) was selfassembled on gold electrode via AuS bond, and then hybridized with target DNA (tDNA) to form doublestranded DNA. Then nicking endonuclease Nt.BstNBI recognized a cutting site (5′GAGTC3′) in the double chain and cleaved cDNA strand at 4 bases away from the 3′ end of its recognition site, thus releasing the tDNA and achieving a recycle of tDNA in the next hybridization and signal amplification. Finally, carboxyl groups on the surface of CdTe QDs were activated with 1ethyl3(3dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) and Nhydroxysuccinimide (NHS), and then reacted with amino groups at the terminal of residual cDNA on the electrode surface. So the QDs were fabricated and the tDNA concentration could be determined by measuring the ECL signal of the CdTe QDs. The experimental conditions were optimized and 1 μmol/L cDNA, 60 min of hybridization time, 0.5 U/μL Nt.BstNBI and 4 h of endonuclease reaction time were chosen. The experimental results showed that under optimal conditions, tDNA could be specifically assayed with a linear relationship between the ECL signal intensity and the logarithm of tDNA concentration in the range of 2.0 × 10 mol/L. The biosensor was successfully applied to determine tDNA concentration in human blood sample with recoveries of 96.4%108.0%.

        Keywords DNA biosensor; Nicking endonuclease; Quantum dots; Electrochemiluminescence; Signal amplification

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