張晶晶 康天放 魯理平 程水源

摘要：采用化學(xué)共沉淀法制備四氧化三鐵（Fe3O4）磁性納米粒子（MNPs），依次用3氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS）、丁二酸酐（SAH）對(duì)Fe3O4 MNPs表面進(jìn)行修飾，得到羧基功能化的核殼型磁性納米粒子（Fe3O4@APTS·SAH MNPs），分別采用透射電鏡（TEM）、磁滯回線、X射線光電子能譜（XPS）和傅里葉紅外光譜（FTIR）對(duì)其進(jìn)行了表征。將此納米粒子修飾在自制的磁性玻碳電極（MGCE）表面，用1（3二氨基丙基）3乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化納米粒子表面的羧基，通過(guò)與氨基的共價(jià)交聯(lián)，將抗微囊藻毒素（亮氨酸精氨酸）（MCLR）抗體（antiMCLR）固定于該修飾電極上，用牛血清白蛋白（BSA）封閉非特異性吸附位點(diǎn)，構(gòu)建了一種檢測(cè)MCLR的電流型免疫傳感器。采用直接競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)模式，在標(biāo)記物辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的MCLR（MCLRHRP）存在下，利用差分脈沖伏安法（DPV）測(cè)定溶液中的微囊藻毒素。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，免疫傳感器對(duì)MCLR的線性測(cè)定范圍為0.05～100 μg/L，檢出限為0.01 μg/L（S/N=3）。構(gòu)建的免疫傳感器呈現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和特異性。將本傳感器用于實(shí)際水樣的測(cè)定，加標(biāo)回收率為94.3%～99.5%。

關(guān)鍵詞 ：磁性納米粒子； 微囊藻毒素； 免疫傳感器； 差分脈沖伏安法

1 引 言

微囊藻毒素（MCs）是一種環(huán)狀七肽肝毒素，可破壞人體細(xì)胞內(nèi)的蛋白磷酸化平衡，引起肝臟病變[1，2]。目前， 已發(fā)現(xiàn)80多種MCs的同分異構(gòu)體[3]，其中微囊藻毒素（亮氨酸精氨酸）（MCLR）是已發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的微囊藻毒素之一[4]。世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》[5]中規(guī)定MCLR限量值為1 μg/L，因此檢測(cè)飲用水源中的MCLR對(duì)于保障飲用水安全具有重要意義。目前，檢測(cè)MCLR 的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[6]、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLCMS）[2，7]、蛋白磷酸酶抑制分析法（PPI）[8，9]等，HPLC和HPLCMS雖然靈敏度較高，但分析周期長(zhǎng)、儀器設(shè)備昂貴、樣品前處理耗時(shí)，并且對(duì)操作人員技術(shù)要求較高；而PPI法檢測(cè)MCLR的選擇性不高。因此，研究開(kāi)發(fā)用于水環(huán)境中藻毒素的簡(jiǎn)單、快速、低成本的檢測(cè)技術(shù)具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。

免疫傳感器是將傳感技術(shù)與特異性免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一類分析技術(shù)。應(yīng)用電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)MCLR具有靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便、易實(shí)現(xiàn)微型化等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)備受關(guān)注[10～12]。磁性納米粒子（MNPs）是一種新型納米材料[13～15]，可以用多種物質(zhì)對(duì)其表面修飾，以實(shí)現(xiàn)其表面的功能化[16，17]。在本研究組的前期工作中，利用戊二醛將氨基功能化的四氧化三鐵（Fe3O4）MNPs與MCLR抗體（antiMCLR）上的氨基交聯(lián)，構(gòu)建了檢測(cè)MCLR的免疫傳感器[18]。

本研究采用3氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS）修飾Fe3O4磁性顆粒，得到Fe3O4@APTS，再利用丁二酸酐（SAH）將Fe3O4@APTS羧基化，得到Fe3O4@APTS·SAH，

通過(guò)磁力將復(fù)合物均勻地修飾到自制的磁性玻碳電極（MGCE）表面。利用1（3二氨基丙基）3乙基碳二亞胺（EDC）和N羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化磁性顆粒表面的羧基，將Fe3O4@APTS·SAH和antiMCLR抗體偶聯(lián)，基于直接競(jìng)爭(zhēng)原理，構(gòu)建了檢測(cè)MCLR的免疫傳感器。本免疫傳感器呈現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和特異性，用于實(shí)際水樣的測(cè)定，結(jié)果令人滿意。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

CHI 650d電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；KQ218型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ZHWY103B培養(yǎng)振蕩器（上海智成分析儀器制造有限公司）；JEM1200EX透射電子顯微鏡（TEM，日本電子公司）；7410VSM 振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（美國(guó)Lake Shore公司）；X射線光電子能譜儀（日本ULVACPHI公司）。

石墨粉（320目，光譜純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）；環(huán)形釹鐵硼磁鐵（內(nèi)徑1 mm，外徑5 mm，厚1 mm，北京豐瑞磁性材料中心）；玻碳片（直徑5 mm，厚度2 mm，天津艾達(dá)恒晟科技公司）；MCLR、antiMCLR、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的MCLR（MCLRHRP）、微囊藻毒素精氨酸精氨酸（MCRR）和微囊藻毒素酪氨酸精氨酸（MCYR）（北京伊普瑞斯公司）；APTS和牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司）；其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用超純水由Advantage A10超純水系統(tǒng)（法國(guó)MilliQ公司）制備。

2.2 磁性免疫傳感器的制備與修飾

2.2.1 磁性玻碳電極的制備 參照文獻(xiàn)[18]中的方法制備MGCE（圖1A）。

2.2.2 羧基功能化Fe3O4納米粒子的制備 采用化學(xué)共沉淀方法制備Fe3O4 MNPs[19]。稱取25 mg Fe3O4 MNPs于5 mL乙醇溶液中，超聲分散1 h，向其中加入0.4 mL APTS，室溫下置于搖床中振搖24 h，磁分離，用乙醇和超純水分別清洗，制得核殼型納米粒子Fe3O4@APTS。將所制備的Fe3O4@APTS納米粒子分散于5 mL乙醇中，加入5 mL含有800 mg丁二酸酐（SAH）的二甲亞砜溶液，振搖反應(yīng)24 h，磁分離，并用乙醇和超純水清洗后，以水定容至2.5 mL，于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆肹20]。圖1B為制備羧基功能化Fe3O4（Fe3O4@APTS·SAH）納米粒子的示意圖。

2.2.3 抗體在磁性電極表面的固定 磁性電極修飾過(guò)程如圖1C所示。將MGCE表面拋光，依次在水、無(wú)水乙醇、水中超聲處理3 min，電極表面滴加25 μL Fe3O4@APTS·SAH納米粒子懸濁液，室溫下晾干后，以水沖洗，得到Fe3O4@APTS·SAH/MGCE。將其浸入含0.1 mol/L EDC和0.05 mol/L NHS混合溶液中，反應(yīng)1 h后，滴加10 μL 15 μg/mL antiMCLR于MGCE表面，4℃下反應(yīng)24 h，晾干后用水沖洗，得到antiMCLR/Fe3O4@APTS·SAH/MGCE。電極表面滴加1% BSA，濕盒中反應(yīng)1 h，水沖洗后，于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 MCLR的測(cè)定方法 電化學(xué)測(cè)定采用三電極系統(tǒng)：修飾的MGCE為工作電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。將10.0 μL不同濃度的MCLR 標(biāo)準(zhǔn)溶液或水樣與10.0 μL 20 μg/mL MCLRHRP混合滴加到免疫傳感器表面，孵育40 min，水沖洗，得到MCLR（MCLRHRP）/antiMCLR/Fe3O4@APTS·SAH/MGCE。在含2.4 mmol/L H2O2 和1.2 mmol/L 對(duì)苯二酚（HQ）的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液 （PBS，pH 7.4）中，采用差分脈沖伏安法（DPV）測(cè)量響應(yīng)電流。電位掃描范圍為 ，脈沖振幅50 mV，脈沖寬度50 ms。

3 結(jié)果與討論

3.1 磁性納米粒子的表征

從圖2A可見(jiàn)，F(xiàn)e3O4 MNPs呈球形，分散均勻，粒徑約10～20 nm。Fe3O4和Fe3O4@APTS·SAH的矯頑力（圖2B）分別為9.1399和10.981 G，剩磁分別為1.1569和1.2128 emu/g，比飽和磁化強(qiáng)度十分接近，分別為65.029和64.119 emu/g，說(shuō)明對(duì)Fe3O4進(jìn)行表面羧基功能化后未對(duì)其磁學(xué)性能造成明顯影響。

Fe3O4納米粒子的X射線光電子能譜（XPS）分析全譜圖如圖3A所示，可見(jiàn)其主要組成元素為Fe與O，在材料表面的含量分別為65.89%和34.11%。圖3B中位于723.3和709.5 eV的特征峰為Fe 2p1/2和Fe 2p3/2，說(shuō)明材料中有一定量的Fe和Fe。圖3C中位于528.8 eV的特征峰為O 1s，對(duì)應(yīng)于Fe3O4中的O元素。圖3D所示的 Fe3O4@APTS·SAH全譜分析表明，其主要組成元素為O， C， Fe， Si和N，含量分別為46.55%， 28.21%， 19.93%， 2.95%和2.36%，相對(duì)于圖3A中元素組成和含量有明顯變化，其中C， Si， N元素分別來(lái)自于已連接到Fe3O4的APTS和SAH，圖3E～G中位于398.8， 284和101 eV的特征峰分別對(duì)應(yīng)于N 1s， C 1s和Si 2p。

4 結(jié) 論

Fe3O4@APTS·SAH磁性納米材料具有良好的磁學(xué)性能和生物相容性，將其固載于磁性電極表面，采用直接競(jìng)爭(zhēng)模式，構(gòu)建了檢測(cè)MCLR的免疫傳感器。本方法具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，有望用于微囊藻毒素的現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定。

References

1 Mackintosh C， Beattie K A， Klumpp S， Cohen P， Codd G A. FEBS Lett.， 1990， 264（2）： 187-192

2 Allis O， Dauphard J， Hamilton B， Shuilleabhain A N， Lehane M， James K J， Furey A. Anal. Chem.， 2007， 79（9）： 3436-3447

3 Welker M， Dohren H. FEMS Microbiol. Rev， 2006， 30（4）： 530-563

4 Chang J， Chen Z L， Wang Z， Shen J M， Chen Q， Kang J， Yang L， Liu X W， Nie C X. Water Res.， 2014， 63： 52-61

5 WHO. Guidelines for DrinkingWater Quality， 3rd Edition， Geneva： World Health Organization， 2004： 407-408

6 Lawton L A， Edwards C， Codd G A. Analyst， 1994， 119（7）： 1525-1530

7 Draper W M， Xu D， Perera S K. Anal. Chem.， 2009， 81（10）： 4153-4160

8 Serres M H， Fladmark K E， Doskeland S O. Toxicon， 2000， 38（3）： 347-360

9 Sassolas A， Catanante G， Fournier D， Marty J L. Talanta， 2011， 85 （5）， 2498-2503

10 WANG Ling， KANG TianFang， ZHANG JingJian，LU LiPing， CHENG ShuiYuan. Journal of Instrumental Analysis， 2015， 34（5）： 552-557

王 玲， 康天放， 張晶晶， 魯理平， 程水源. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)， 2015， 34（5）： 552-557

11 ZHANG JinGuo， KANG TianFang， XUE Rui， SUN Xue. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（9）： 1353-1358

張金果， 康天放， 薛 瑞， 孫 雪. 分析化學(xué)， 2013， 41（9）： 1353-1358

12 ZHANG XinAi， SHEN JianZhong， ZHANG Fan， MA HaiLe， HAN En， DONG XiaoYa. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（9）： 1301-1306

張新愛(ài)， 申建忠， 張 帆， 馬海樂(lè)， 韓 恩， 董曉婭. 分析化學(xué)， 2014， 42（9）： 1301-1306

13 Zhou J， Gan N， Li T， Zhou H， Li X， Cao Y， Wang L， Sang W， Hu F. Sens. Actuators， B.， 2013， 178： 494-500

14 Zhou H，Gan N， Li T， Cao Y， Zeng S， Zheng L， Guo Z. Anal. Chim. Acta， 2012， 746： 107-113

15 Nourani S， Ghourchian H， Boutorabi S M. Anal. Biochem.， 2013， 441（1）： 1-7

16 Zhang H， Ying S， Wang J， Zhang J， Zhang H， Zhou H， Song D. Biosens. Bioelectrons.， 2012， 34（1）： 137-143

17 Rossi L M， Quach A D， Rosenzweig Z. Anal. Bioanal. Chem.， 2004， 380（4）： 606-613

18 Wang L， Kang T F， Lu L P， Zhang J G， Xue R， Cheng S Y. Anal. Lett.， 2014， 47（18）： 2939-2949

19 Zhao X，Cai Y， Wang T， Shi Y， Jiang G. Anal. Chem.， 2008， 80（23）： 9091-9096

20 Shen M， Cai H， Wang X， Cao X， Li K， Wang S H， Guo R， Zheng L， Zhang G， Shi X. Nanotechnology， 2012， 23（10）： 105601

Abstract An immunosensor for detection of microcystin（leucinearginine） （MCLR） was constructed. Chemical coprecipitation method was used to synthesize ferriferrous oxide magnetic nanoparticles （Fe3O4 MNPs）. The Fe3O4 MNPs were modified with 3aminopropyltriethoxysilane （APTS） and succinic anhydride （SAH） in turn to generate carboxylfunctionalized coreshell MNPs （Fe3O4@APTS·SAH MNPs）， which were characterized by transmission electron microscope （TEM）， hysteresis loop， Xray photoelectron spectroscopy （XPS） and Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）， respectively. The Fe3O4@APTS·SAH MNPs were modified onto the surface of a homemade magnetic glassy carbon electrode （MGCE）. AntiMCLR antibody （antiMCLR） was immobilized on the modified MGCE by coupling reaction with ethyl3（dimethyl aminopropyl） carbodiimide （EDC） and Nhydroxysuccinimide （NHS）. Subsequently， bovine serum albumin （BSA） was used to block the nonspecific adsorption sites of the electrode. Direct competitive immunoassay format was adopted. In the presence of horseradish peroxidaseconjugated MCLR （MCLRHRP）， MCLR in solution was determined by differential pulse voltammetry （DPV）. Under the optimized conditions， MCLR could be detected within a wide linear range of 0.05-100 μg/L with a detection limit of 0.01 μg/L （S/N=3）. Moreover， the immunosnssoe exhibited good reproducibility， stability and selectivity. The immunosensor was applied for the determination of MCLR in real water samples with the recoveries from 94.3% to 99.5%.

Keywords Magnetic nanoparticles； Microcystin； Immunosensor； Differential pulse voltammetry