魏 瑩 萬傳玲 薛 蓉 李曉晶 章文軍 裴奉奎

摘要基于1H NMR的代謝組學方法結合多變量數(shù)據(jù)分析方法（主成分分析和偏最小二乘判別分析）對灌胃給藥赭石（2， 5和10 g/kg體重劑量）的成年Wistar大鼠尿液進行分析，并對大鼠給藥前1天、給藥后1～5天尿液1H NMR數(shù)據(jù)進行單變量比較分析，篩選出赭石的潛在特征代謝物，對赭石引起的代謝變化進行研究，為赭石的科學用藥提供依據(jù)。結果表明，大鼠體內檸檬酸、牛磺酸、肌酸酐、α酮戊二酸、琥珀酸、二甲基甘氨酸等代謝物濃度發(fā)生明顯變化，隨給藥時間的變化出現(xiàn)恢復趨勢，且恢復趨勢與給藥劑量相關，可作為赭石的潛在特征代謝物。給藥2， 5和10 g/kg體重劑量赭石降低了大鼠機體三羧酸循環(huán)能力，影響了能量、肌酸及二甲基甘氨酸的代謝，且10 g/kg體重劑量赭石對大鼠肝功能造成一定影響。

關鍵詞 核磁共振； 代謝組學； 主成分分析； 偏最小二乘判別分析； 赭石

1引言

赭石（Haematitum）味苦，性寒，主要成分為三氧化二鐵（Fe2O3），并含有Ca， Mn， Ni， Zn， Co， Cu， As等多種礦物元素[1]，具有平肝潛陽、降逆、止血功效。臨床上應用非常廣泛，主要用于治療眩暈耳鳴、嘔吐、噫氣、呃逆、喘息、吐血等癥，其鐵含量大于45%，是良好的補鐵劑，可以用于治療缺鐵性貧血，調節(jié)內分泌平衡。近些年，學者們對赭石的炮制方法、臨床配伍應用等研究廣泛，但對其作用機理和內源性代謝研究還不完全。

代謝組學[2]自提出以來發(fā)展迅速，它通過發(fā)現(xiàn)、識別、定量分析低分子量的代謝物，研究有關個體健康狀況的重要信息[3]。代謝組學可以通過直觀的代謝變化，確定代謝異常的信號（特征性代謝物）、生物標記物[4]。目前，代謝組學已經(jīng)成功運用到疾病的診斷、藥物安全及藥物作用機理、毒理學、食品營養(yǎng)學、植物學等多個研究領域[4～9]。代謝組學的分析技術手段主要有核磁共振（NMR）、質譜（MS）、液相色譜質譜聯(lián)用（LCMS）、氣相色譜質譜聯(lián)用（GC MS）等。

隨著技術的進步，NMR提高了靈敏度和分辨率，被廣泛應用到代謝組學的代謝物識別和定量分析中[4，5]。NMR可對樣品進行快速、高通量的、無偏性地檢測與分析，且樣品處理簡單。本研究采用基于1H NMR的代謝組學方法，結合主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLSDA）方法，對灌胃給藥赭石的成年Wistar大鼠尿液進行分析，研究給藥赭石前后的代謝組特征，找出赭石發(fā)揮作用的潛在特征代謝物，從分子水平上對赭石的急性生物效應進行研究，為赭石的科學用藥提供了依據(jù)。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Bruker AV 600型NMR儀器，質子共振頻率為600.13 MHz，采用預飽和方法壓制水峰采集信號，F(xiàn)ID采集次數(shù)64，數(shù)據(jù)點64k，延遲時間6 s，90°偏轉角為13.5 μs，采樣時間為1.0224 s，譜寬8992.8 Hz。

NaH2PO4、Na2HPO4（分析純，北京化工廠），用于配制緩沖溶液（pH=7.38）；3（三甲基硅基）氘代丙酸鈉（TSP，98%氘代，美國Aldrich公司）；重水（D2O，99.9%，美國劍橋同位素實驗室），用于配制0.5 mmol/L TSP；羧甲基纖維素鈉（CMCNa，國藥集團化學試劑有限公司），配制0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；赭石（長春某藥房），配制質量分數(shù)為33.3%，55.6%和71.4%的赭石懸濁液（羧甲基纖維素鈉作溶劑）。

2.2實驗方法

20只成年雄性Wistar大鼠（購于吉林大學基礎醫(yī)學院），隨機分為4組，每組5只，1組為對照組，3組為實驗組。嚴格按照要求飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在（22±2）℃，濕度保持在50%±10%，晝夜循環(huán)，自由攝食飲水。大鼠在飼養(yǎng)籠內適應7天后，實驗組灌胃給藥2、5和10 g/kg體重（Body Weight，BW）劑量的赭石，對照組灌胃給藥同體積0.5% CMCNa。赭石給藥劑量參考其半致死量[10]。利用代謝籠集尿裝置收集給藥前1天及給藥1， 2， 3， 4， 5天后的大鼠尿液，于

Symbolm@@ 80℃保存。

測樣時于室溫下解凍，取0.4 mL尿液，加入0.2 mL緩沖溶液，4℃靜置20 min，以4000 r/min離心5 min；取上層清液0.55 mL于5 mm NMR 樣品管中，加入0.06 mL內含0.5 mmol/L TSPD2O，25℃進行測試。

使用MestReC版本軟件（http：//qobrue.usc.es/jsgroup/MestReC，共享軟件）進行手動相位調整和基線校正。以TSP為內標，除去殘余水峰以及因交叉弛豫變寬的尿素峰（δ=4.50～6.10），譜圖按δ=0.01分段積分，并進行概率商歸一化（PQN），所得數(shù)據(jù)用SIMCAP 11.0（Umetrics ， Sweden）進行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLSDA），Par（Pareto scaling）中心化方式，PCA得分圖數(shù)據(jù)導出進行作圖，PLSDA模型進行排列驗證。單變量分析采用的統(tǒng)計分析方法為單尾雙樣本異方差t檢驗，涉及多重比較采用邦費羅尼（Bonferroni correction）法校正p值。

3結果與討論

3.1尿液 1H NMR譜峰歸屬及多元統(tǒng)計

尿液極易收集，可以反映機體的代謝狀況，對機體疾病的診斷有重要意義。根據(jù)文獻[11，12]對譜圖（圖1）進行譜峰歸屬。從圖1可見，大鼠尿液主成分中有糖酵解終端產物乙酸；檸檬酸、琥珀酸、α酮戊二酸等三羧酸循環(huán)中間體；二甲基甘氨酸、N乙酰谷氨酸等大鼠體內的代謝中間體；同時還有大量代謝終產物： N氧三甲胺、?；撬帷⒓∷狒?、甲酸、馬尿酸等，大鼠尿液中代謝物組成及濃度的變化能夠反映給藥赭石對其機體功能狀態(tài)的影響。

對3個劑量組的1H NMR譜圖數(shù)據(jù)進行PCA分析，得到PCA得分圖（圖2）。從圖2可見，3個劑量組隨時間變化的軌跡，給藥后第1天，3個劑量組均與對照組分開（將PCA得分圖坐標進行ANOVA檢驗，p<0.025視為分開）；給藥后第3天和第4天，2和5 g/kg BW劑量組未能與對照組分開，而10 g/kg BW劑量組仍與對照組分開（ANOVA，p<0.025）；給藥5天后，3個劑量組均未能與對照組分開。說明大鼠體內代謝物含量在給藥赭石后，第1天變化較大，使不同劑量組PCA得分圖均能與對照組完全分開，2和5 g/kg BW劑量組在給藥第4天后有明顯恢復趨勢，10 g/kg BW劑量組在給藥第5天后有明顯恢復趨勢。

為了找出3個劑量組與對照組分類貢獻最大的代謝物，分別對3個劑量組給藥第1天尿液的1H NMR譜圖數(shù)據(jù)進行PLSDA分析，得到得分圖和載荷圖（圖3）。從圖3可見，第1天給藥組與對照組完全分開。

3.2潛在特征代謝物篩選及其單變量分析

對尿液PLSDA載荷圖中VIP>1的數(shù)據(jù)進行分析，得到對分類貢獻最大的代謝物有檸檬酸、?；撬帷⒓∷狒?、α酮戊二酸、琥珀酸、二甲基甘氨酸。對檸檬酸、?；撬?、肌酸酐、α酮戊二酸、琥珀酸、二甲基甘氨酸的1H NMR譜圖積分面積進行單變量比較，得到給藥組與對照組積分面積百分比隨時間變化圖（圖5），所有數(shù)據(jù)進行t檢驗， p<0.025認為具有統(tǒng)計學意義。

如圖5所示，對照組檸檬酸、?；撬?、肌酸酐、α酮戊二酸、琥珀酸、二甲基甘氨酸的含量與給藥前相比均無顯著性變化，可以排除上述代謝物含量變化是由于溶劑羧甲基纖維素鈉引起的。從圖5可見，給藥赭石后，大鼠尿液中檸檬酸、α酮戊二酸含量降低（p<0.025），?；撬?、二甲基甘氨酸含量升高（p<0.025），隨給藥時間的變化出現(xiàn)恢復趨勢，且恢復趨勢與給藥劑量相關。琥珀酸不同給藥劑量組變化不同，2 g/kg BW組先降低（p<0.025）后恢復，而5和10 g/kg BW組出現(xiàn)不同程度升高（p<0.025）趨勢。不同給藥劑量尿液中肌酸酐含量變化也不同，2和5 g/kg BW組升高（p<0.025）后恢復，而10 g/kg BW組降低（p<0.025）后未能恢復。不同給藥劑量組大鼠體內代謝物含量變化趨勢的差異，說明赭石給藥劑量不同，對大鼠體內代謝的影響也可能發(fā)生變化。

3.3特征代謝物生物學分析

三羧酸循環(huán)反應部位在細胞的線粒體中，反應產生高能磷酸鍵（ATP或GTP），是重要的能量代謝途徑，體內鐵過載對機體損傷的靶向性是線粒體[13～15]，Bacon等[15]在對大鼠口服過量的羰基鐵實驗中觀察到肝鐵濃度過高可以引發(fā)線粒體過氧化損傷。3個劑量組觀察到的尿液中檸檬酸、α酮戊二酸含量降低，2 g/kg BW 組琥珀酸含量降低，三羧酸循環(huán)能力降低，可能是由于赭石引發(fā)了線粒體過氧化損傷，抑制了三羧酸循環(huán)。三羧酸循環(huán)中琥珀酸在琥珀酸脫氫酶的作用下生成延胡索酸。文獻[16]報道，在大鼠鐵過載模型中，琥珀酸脫氫酶的活性受到抑制。在5和10 g/kg BW組觀察到琥珀酸含量升高，可能是由于較高劑量的赭石抑制了琥珀酸脫氫酶的活性而造成的。在給藥赭石后觀察到尿液中檸檬酸、α酮戊二酸和琥珀酸含量發(fā)生變化，說明赭石抑制了三羧酸循環(huán)，影響了能量代謝。

肌酸酐在肌酸酐水解酶的作用下水解生成肌酸，反應可逆。肌酸酐在肌酸酐脫氨酶和胞嘧啶脫氨酶的作用下生成N甲基乙內酰脲。肌酸酐水解酶、肌酸酐脫氨酶和胞嘧啶脫氨酶的活性受到金屬離子濃度的影響，F(xiàn)e2+， Co2+， Zn2+等在一定的濃度范圍內可以抑制肌酸水解酶活性，激活肌酸酐脫氨酶和胞嘧啶脫氨酶的活性[17]。在給藥組觀察到的肌酸酐含量發(fā)生明顯變化，可能是由于赭石影響了肌酸酐水解酶、肌酸酐脫氨酶和胞嘧啶脫氨酶等肌酸代謝酶的活性造成的。

?；撬崤c自由金屬離子（如Fe2+， Cu2+等）形成螯合物使其活性降低[18]，從而保護肝臟免受損害[19]。有研究表明，大鼠喂食?；撬幔梢愿纳埔掖己汪驶F引起的肝損傷和肝臟纖維化[18]。在給藥組觀察到牛磺酸含量升高，可能是由于在赭石的刺激下，大鼠機體的應激行為，促進機體內?；撬岷铣?，降低赭石對肝臟的影響。2和5 g/kg BW組隨后恢復，說明較低劑量赭石對肝臟的影響程度較低；而10 g/kg BW組牛磺酸含量保持在較高水平，到給藥后第5天仍未恢復，說明高劑量赭石對肝臟具有較大影響。

二甲基甘氨酸和水在電子轉移黃素蛋白作用下生成肌氨酸和甲醛，電子轉移黃素蛋白存在于細胞線粒體膜上。有研究表明，SPIO（超小型超順磁氧化鐵粒子）具有膜毒性，可以改變膜的溶透性和完整性[12]。體內鐵過載會造成線粒體損傷[13～15]。因此，藥組觀察到的二甲基甘氨酸水平顯著升高，可能是由于赭石影響了電子轉移黃素蛋白的活性，使得二甲基甘氨酸生成肌氨酸的代謝途徑受阻。

4結 論

實驗結果表明，赭石能夠引起大鼠體內檸檬酸、?；撬?、肌酸酐、α酮戊二酸、琥珀酸、二甲基甘氨酸等代謝物濃度變化，可作為赭石的潛在特征代謝物。赭石降低三羧酸循環(huán)能力，影響了能量代謝、肌酸的代謝和二甲基甘氨酸代謝，并在一定程度上影響了肝功能。通過大鼠尿液軌跡圖可知，給藥3個劑量組在給藥后第1天對大鼠具有較大影響，隨后3個劑量組均有隨時間恢復的趨勢，但10 g/kg BW劑量組恢復緩慢。因此，基于1H NMR的代謝組學方法可以有效運用到赭石的研究中，為赭石的研究提供新思路，同時也為赭石的安全用量提供了理論依據(jù)。

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