叢漢卿 龍婭麗 齊堯堯 張振文 陳松筆 喬飛

摘 要 為研究木薯中調(diào)控支鏈淀粉合成的DBE和SBE基因如何被茉莉酸信號(hào)調(diào)控，首先對(duì)木薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的MeDBE和MeSBE2.1基因進(jìn)行序列分析，二者都具有α淀粉酶催化結(jié)構(gòu)域且啟動(dòng)子區(qū)都具有茉莉酸響應(yīng)元件等多種響應(yīng)元件。以木薯品種‘華南八號(hào)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為材料，利用qRT-PCR檢測(cè)木薯MeDBE和MeSBE2.1基因在茉莉酸甲酯處理后的表達(dá)特性。結(jié)果顯示：MeDBE基因的表達(dá)在最初短暫上調(diào)后持續(xù)下調(diào)，而MeSBE2.1則持續(xù)上調(diào)后又恢復(fù)最初水平，說(shuō)明MeDBE和MeSBE2.1基因可被茉莉酸信號(hào)調(diào)控，進(jìn)一步推測(cè)表明，其受到不同激素信號(hào)整合后的綜合調(diào)控，以影響支鏈淀粉的生物合成。

關(guān)鍵詞 木薯 ；DBE基因 ；SBE基因 ；茉莉酸 ；表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S533 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.010

木薯（Manihot esculenta Crantz） 屬大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot Miller）植物，原產(chǎn)熱帶南美洲[1]，是世界三大薯類作物之一，也是第六大糧食作物，具有重要的食用和工業(yè)價(jià)值。木薯作為一種高光效、高淀粉含量和高水分利用率的熱帶作物，研究其淀粉合成過(guò)程并進(jìn)一步改善其品質(zhì)，具有重要的科學(xué)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

在高等植物中，淀粉是儲(chǔ)藏碳水化合物的主要形式，一般由直鏈淀粉和支鏈淀粉2種葡萄糖多聚體組成。直鏈淀粉主要由顆粒結(jié)合的淀粉合成酶 （Granule-bound starch synthase， GBSS） 催化合成[2]，而支鏈淀粉的合成非常復(fù)雜，在可溶性淀粉合成酶 （Soluble starch synthase， SSS） 的作用下通過(guò)α-1，4糖苷鍵進(jìn)行葡聚糖鏈的延伸達(dá)到一定長(zhǎng)度后，在淀粉分支酶 （Starch branching enzyme， SBE） 作用下，在線性糖鏈的內(nèi)部引入α-1，6糖苷鍵形成分支，并進(jìn)一步在SSS催化下延長(zhǎng)分支，最后淀粉去分支酶（Starch debranching enzyme， DBE）對(duì)分支進(jìn)行修飾，最終合成具有一定結(jié)構(gòu)特性的淀粉結(jié)晶體[2]。植物中DBE和SBE都有多種同工酶。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系SBE可以分為SBEI和SBEII 2種類型，它們不僅結(jié)構(gòu)有差異，而且作用于特異的底物：SBEI傾向作用于直鏈淀粉，主要催化轉(zhuǎn)移相對(duì)較長(zhǎng)的多糖鏈，而SBEII傾向作用于支鏈淀粉，催化轉(zhuǎn)移較短的多糖鏈[3]。DBE同樣存在2種類型，一種為水解普魯藍(lán)（Pullulan）和極限糊精的α-1，6糖苷鍵的普魯藍(lán)酶或稱極限糊精酶（Pullulanase；Limit dextirnase），但對(duì)糖原和變性支鏈淀粉的α-1，6糖苷鍵無(wú)活性或弱活性；另一種為以變性支鏈淀粉、糖原和支鏈淀粉類似物為底物，催化α-1，6糖苷鍵的水解的異淀粉酶（Isoamylase），但不能水解普魯藍(lán)。

茉莉酸（jasmonic acid， JA）是植物逆境響應(yīng)的信號(hào)分子，在涉及植物對(duì)生物性和非生物性逆境脅迫和植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的基因調(diào)控上發(fā)揮著重要的作用。JA作為一種逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，具有對(duì)非生物脅迫反應(yīng)的功能[4-5]。江月玲和潘瑞熾[6]發(fā)現(xiàn)，不同濃度茉莉酸甲酯處理后，花生幼苗中的淀粉、還原糖和可溶性糖降低。Sarkar[7]發(fā)現(xiàn)，在離體條件下，茉莉酸甲酯與馬鈴薯塊莖中淀粉的積累相關(guān)，脅迫信號(hào)可直接影響到淀粉合成酶的活性，并會(huì)使淀粉的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[8-10]。然而，相關(guān)分子機(jī)制迄今尚不清楚，為進(jìn)一步探索茉莉酸信號(hào)如何影響木薯淀粉的生物合成，本研究選取了木薯DBE和SBE基因，初步研究其受茉莉酸信號(hào)的影響情況。于JGI的木薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)v6.1中獲得淀粉去分支酶DBE基因序列MeDBE（Manes.05G073400）[11]，和一個(gè)淀粉分支酶MeSBE2.1（Manes.09G059400）同時(shí)進(jìn)行分析[12]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MeDBE啟動(dòng)子區(qū)具有一個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件；MeSBE2.1具有2個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件。同時(shí)利用木薯懸浮培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)其茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）誘導(dǎo)表達(dá)特性分析中也發(fā)現(xiàn)，MeDBE和MeSBE2.1基因可受JA信號(hào)調(diào)控，并呈現(xiàn)不同的表達(dá)趨勢(shì)。本研究旨在通過(guò)序列分析和表達(dá)分析，確定JA信號(hào)能對(duì)MeDBE和MeSBE基因表達(dá)造成影響，并探索表達(dá)變化特性及其機(jī)制，為進(jìn)一步研究逆境信號(hào)通過(guò)MeDBE和MeSBE在木薯支鏈淀粉合成過(guò)程中所發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯品種‘華南八號(hào)（‘SC8） 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，該細(xì)胞通過(guò)葉片愈傷組織建立。現(xiàn)保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院熱帶作物品種資源研究所。吸取處于指數(shù)增長(zhǎng)期的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞1 mL于離心管中并置于搖床25℃穩(wěn)定 30 min，分為2組并分別以濃度400 μL/L茉莉酸甲酯（Sigma-Aldrich） 處理，另一組不進(jìn)行任何處理作為對(duì)照。選取0 h未處理和處理后0.5、1、2、4、8 h共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品，微離心后棄上清液氮速凍-80℃冰箱保存。此步驟重復(fù)3次，獲得3批生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 SBE和DBE基因及啟動(dòng)子區(qū)序列分析

使用JGI的木薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias=Org_Mesculenta_er）獲得MeDBE及MeSBE_2的CDS序列（coding sequence）和DNA序列（genomic sequence）[11]。用Spidey（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/）和NetGene2 V2.4（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/）分析基因結(jié)構(gòu)[13-14]。用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）分析內(nèi)含子相位[15]。用TSSP（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=tssp&group=programs&subgroup=promoter）分析轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)[16]，用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）綜合分析啟動(dòng)子區(qū)序列，尋找順勢(shì)作用元件位點(diǎn)[17]。

1.2.2 SBE和DBE基因的蛋白分析

使用BLAST工具對(duì)預(yù)測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，用PortParam（http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)其蛋白分子量和等電點(diǎn)[18]，使用InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域[19]。用TMHMM Server在線工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)[20]，使用SubLoc（http：//www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/）和WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)[21-22]。使用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽[23]。使用PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)[24]。利用Swiss-model（http：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)三維結(jié)構(gòu)[25]。使用PFP（http：//kiharalab.org/web/pfp.php）預(yù)測(cè)蛋白功能[26]。

1.2.3 序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析

鑒于Pei等已對(duì)木薯SBE基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析[17]，故本研究只對(duì)DBE基因做進(jìn)化樹分析，選取了與木薯DBE蛋白序列同源性較高的13種其它作物DBE蛋白序列共同進(jìn)行進(jìn)化樹分析，它們分別來(lái)自：蓖麻（Ricinus communis，XP_002533079.1）、可可（Theobroma cacao，XP_007050677.1）、野生大豆（Glycine soja，KHN19871.1）、馬鈴薯（Solanum tuberosum，NP_001274804.1）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，XP_013449701.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_171830.1）、豌豆（Pisum sativum，AAZ81836.1）、樹棉（Gossypium arboreum，KHG10947.1）、玉米（Zea mays，ACG48178.1）、籽粒莧（Amaranthus cruentus，BAQ22171.1）、小麥（Triticum aestivum，AEV92948.1）、水稻（Oryza sativa，BAD

19754.1）、大麥（Hordeum vulgare，BAD89532.1）。使用MEGA6對(duì)其氨基酸進(jìn)行序列比對(duì)，并構(gòu)建鄰接（neighbor-joining，N-J）聚類進(jìn)化樹，使用bootstrap方法1 000次重復(fù)對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 誘導(dǎo)表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè)

使用Axygen 總RNA小量制備試劑盒（Axygen）提取總RNA；使用PrimeScriptTM Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）合成cDNA；使用SYBR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）實(shí)時(shí)定量試劑盒（Takara）進(jìn)行qRT-PCR；以檢測(cè)DBE和SBE基因在懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中受茉莉酸甲酯誘導(dǎo)表達(dá)情況，所有的qRT-PCR反應(yīng)均來(lái)自同一批反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物，18S rRNA為內(nèi)參。所用目的基因及18s rRNA的引物為Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，序列如表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，MeDBE基因僅有一個(gè)外顯子，無(wú)內(nèi)含子存在，而MeSBE2.1具有22個(gè)外顯子（圖1）。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示：MeDBE基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子上游565 bp處，而MeSBE2.1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子上游457 bp處。順勢(shì)作用元件位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)：MeDBE基因啟動(dòng)子區(qū)域包含2個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件和1個(gè)乙烯響應(yīng)元件ERE，同時(shí)，還有可受缺氧環(huán)境誘導(dǎo)的ARE元件及受高溫誘導(dǎo)的HSE和受低溫誘導(dǎo)的LTR；而MeSBE2.1也有2個(gè)可受茉莉酸誘導(dǎo)的元件CGTCA-motif和TGACG-motif，此外，還有1個(gè)可受脫落酸（abscisic acid，ABA）誘導(dǎo)的ABRE、1個(gè)可受赤霉素（gibberellin，GA）誘導(dǎo)的GARE-motif和1個(gè)可受水楊酸（salicylic acid，SA）誘導(dǎo)的TCA-element（表2）。

2.2 蛋白分析

MeDBE有883個(gè)氨基酸，分子量為99.057 3 ku，理論等電點(diǎn)為5.73。MeSBE2.1有827個(gè)氨基酸，分子量為94.851 4 ku，理論等電點(diǎn)為5.72?？缒^(qū)分析顯示，2個(gè)蛋白可能無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，2個(gè)蛋白都可能定位在葉綠體上。信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)，二者無(wú)明顯的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，MeDBE有12個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)和31個(gè)折疊結(jié)構(gòu)，MeSBE2.1則有14個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)和28個(gè)折疊結(jié)構(gòu)，可參考其三維預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)（圖2）。MeDBE具有DBE典型的保守結(jié)構(gòu)域，如AmyAc_plant_IsoA、E_set_GDE_Isoamylase_N、glgX_debranch等；而MeSBE2.1具有SBE典型的保守結(jié)構(gòu)域，如AmyAc_bac_euk_BE、E_set_GBE_euk_N、Alpha-amylase_C等。蛋白功能預(yù)測(cè)顯示：MeDBE和MeSBE2.1基因皆最符合Gene Ontology（GO）中的GO：0003824條目，具有催化酶活性。

2.3 基因進(jìn)化樹分析

通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)中的DBE是以變性支鏈淀粉、糖原和支鏈淀粉類似物為底物的異淀粉酶。從進(jìn)化樹可以看出，同一科植物的DBE基因基本聚為一類，木薯作為大戟科植物，與同一科的蓖麻處于相同分支（圖3）；豌豆、野生大豆、蒺藜苜蓿3種豆科植物處于同一分支；大麥、小麥和水稻作為禾本科植物同處一分支，且連同莧科的籽粒莧4種作物處于一個(gè)獨(dú)立的大分支上。較為有趣的是，梧桐科的可可和錦葵科的樹棉處于同一分支；且禾本科的玉米并沒(méi)有與其它3 種禾本科作物在另一大分支上；其余作物都單獨(dú)分支。另外研究已知，MeSBE2.1和MeSBE2.2與蓖麻等作物SBEII有很高的同源性，可歸于雙子葉SBEII家族[12]。

2.4 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的MeDBE和MeSBE2.1表達(dá)水平變化

MeDBE在MeJA處理0.5 h后先上升到本底水平的1.5倍，后持續(xù)下降，到8 h時(shí)已降到接近只有本底水平一半（圖4）。而MeSBE2.1在MeJA處理0.5 h后表達(dá)量出現(xiàn)了約1.4倍的上升，并在4 h處繼續(xù)上升達(dá)到高于3倍后，又在8 h快速下降至最初水平。可以看出，MeDBE和MeSBE2.1呈現(xiàn)出較大差異，二者在處理0.5 h內(nèi)都呈現(xiàn)出略微上調(diào)，但之后MeDBE表達(dá)繼續(xù)上升后又下降，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而MeSBE2.1則呈現(xiàn)出持續(xù)下調(diào)。鑒于前面的啟動(dòng)子區(qū)分析中，兩基因都有茉莉酸響應(yīng)元件，可能是造成0.5 h之內(nèi)上調(diào)的原因，而后期二者完全不同的表達(dá)趨勢(shì)，則說(shuō)明必然有其它的調(diào)控途徑的參與。

3 討論與結(jié)論

有學(xué)者認(rèn)為，SSS和SBE的相互作用影響了淀粉的分支頻率和鏈長(zhǎng)[27]。雖然有觀點(diǎn)認(rèn)為，SBE和DBE能直接催化淀粉分子中分枝鏈的形成或去除，但這2個(gè)酶可能只影響支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)，而不影響支鏈淀粉占總淀粉的比例[28]。但大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DBE和SBE功能的缺失將嚴(yán)重影響淀粉顆粒的形成和支鏈淀粉的比例。如擬南芥中DBE1基因的突變限制了葉內(nèi)淀粉的正常積累，水稻中DBE同工的su1基因突變后會(huì)產(chǎn)生畸形淀粉粒[29]。而SBE的缺失則導(dǎo)致如豌豆、玉米、小麥和馬鈴薯植株中極高的直鏈淀粉含量且淀粉顆粒的形態(tài)和組成均有改變[30]。這些結(jié)果都表明，DBE和SBE基因的變化改變了支鏈淀粉的生物合成過(guò)程。

MeJA處理后，2個(gè)基因各自呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)趨勢(shì)，表明雖同為逆境信號(hào)物質(zhì)，卻對(duì)2個(gè)基因有不同的調(diào)控作用。在啟動(dòng)子區(qū)元件分析時(shí)已知，MeDBE和MeSBE2.1都具有茉莉酸響應(yīng)元件，這在一定程度上說(shuō)明了為何MeJA處理后這2個(gè)基因在0.5 h內(nèi)出現(xiàn)了一定程度的上調(diào)；Pei等[12]在研究木薯MeSBE家族基因在不同脅迫條件下的表達(dá)特性時(shí)，選擇了5、15 min，0.5、1、2 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，其中MeSBE2.1在MeJA處理后的2 h內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢(shì)，而本試驗(yàn)中，MeSBE2.1前期表現(xiàn)類似并且表達(dá)水平在4 h達(dá)到最高點(diǎn)后開始下降，并在8 h降至本底水平附近。植物在接受外源信號(hào)后上調(diào)相關(guān)基因表達(dá)時(shí)，往往呈現(xiàn)先上升后下降的特點(diǎn)。因?yàn)樯险{(diào)后基因產(chǎn)物開始積累，達(dá)到滿足自身需求的數(shù)量或濃度后，上調(diào)停止，開始逐漸降低，這一現(xiàn)象在植物中極為普遍。而MeDBE表達(dá)量維持上調(diào)的時(shí)間更短，在0.5 h之后便開始下行。說(shuō)明茉莉酸響應(yīng)元件的作用并不持久，其表達(dá)量會(huì)被其它調(diào)控方式下調(diào)?？偠灾苯邮┘覯eJA無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間維持MeDBE和MeSBE2.1長(zhǎng)期的高表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控木薯支鏈淀粉合成。

另外，MeDBE表達(dá)量在0.5 h后的持續(xù)下調(diào)說(shuō)明，在其上游的茉莉酸響應(yīng)元件發(fā)揮作用引起上調(diào)后，應(yīng)存在其它負(fù)調(diào)控機(jī)制導(dǎo)致上調(diào)趨勢(shì)被扭轉(zhuǎn)，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探索。本研究已知，MeDBE和MeSBE2.1的啟動(dòng)子區(qū)還有一些各自獨(dú)有的其它調(diào)控元件，如赤霉素、脫落酸、水楊酸等響應(yīng)元件。同時(shí)，鑒于2個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)具有大量受逆境信號(hào)調(diào)控的元件，說(shuō)明多種脅迫都可以調(diào)控這2種酶的表達(dá)。植物中茉莉酸與其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的激素的交叉相互作用在整個(gè)生活周期內(nèi)、不同組織器官間、不同類型細(xì)胞中一直存在。不同激素信號(hào)的整合共同介導(dǎo)了植物的生長(zhǎng)發(fā)育、對(duì)環(huán)境的反應(yīng)及衰老死亡。茉莉酸、水楊酸和乙烯之間存在著復(fù)雜的相互作用，既協(xié)作又對(duì)抗[31]，如乙烯和茉莉酸具有協(xié)同作用，而水楊酸對(duì)茉莉酸有拮抗作用。鑒于MeSBE2.1同時(shí)具有茉莉酸響應(yīng)元件和乙烯響應(yīng)元件，而MeDBE則同時(shí)具有茉莉酸響應(yīng)元件和水楊酸響應(yīng)元件，2個(gè)基因后期表達(dá)趨勢(shì)的差異可能源于不同信號(hào)的綜合作用。鑒于調(diào)控方式的復(fù)雜性，推測(cè)2種不同逆境信號(hào)施加后可與其它不同激素綜合作用，產(chǎn)生了迥異的調(diào)控模式，最終造成MeDBE和MeSBE2.1基因不同的表達(dá)特性。同時(shí)，因?yàn)镈BE和SBE基因可以影響淀粉積累、直鏈淀粉的比例以及淀粉顆粒的形態(tài)和組成[29-30]，推測(cè)茉莉酸作為一種逆境信號(hào)，如長(zhǎng)期施加，可能通過(guò)影響這2個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)而影響到植物淀粉的積累。

作為重要的糧食作物及工業(yè)酒精和淀粉來(lái)源，木薯淀粉的合成具有重要的科研意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，DBE和SBE作為控制支鏈淀粉合成的重要基因，研究逆境信號(hào)如何對(duì)其造成影響并探索相關(guān)機(jī)制，有助于更好地理解木薯淀粉合成的分子機(jī)制，對(duì)木薯淀粉品質(zhì)改良具有重要意義，并為培育出品質(zhì)更高的新品種奠定基礎(chǔ)。目前僅知木薯的MeDBE和MeSBE2.1和茉莉酸信號(hào)影響后的表達(dá)特性，但具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑和調(diào)控機(jī)理，仍需進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。

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