章海敏 姜紅強(qiáng) 虞效益

摘要 玻璃化凍存是指利用一種或多種高濃度冷凍保護(hù)劑（即玻璃化液）保護(hù)待冷凍的生物材料，直接投入液氮中進(jìn)行凍存的方法。近年來(lái)，魚(yú)類(lèi)卵細(xì)胞和胚胎的低溫和超低溫保存研究引起人們重視。本文針對(duì)現(xiàn)階段研究進(jìn)展及存在的主要問(wèn)題進(jìn)行綜述，并對(duì)魚(yú)卵細(xì)胞常用活性檢測(cè)方法進(jìn)行匯總。

關(guān)鍵詞 魚(yú)卵細(xì)胞；玻璃化凍存；影響因子；活性檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào) S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）06-0240-03

Research Progress and Prospect of Fish Oocytes Vitrification

ZHANG Hai-min 1 JIANG Hong-qiang 2 YU Xiao-yi 3

（1 Zhejiang Agriculture and Forestry University，Lin′an Zhejiang 311300； 2 Zhejiang Medical Instrument Research Institute；

3 Ningbo Institute of Science and Engineering，Zhejiang University）

Abstract Vitrification means pretecting frozen biological meterials by using one or more of high-concentration cryoprotectants，then crypreserve in liquid nitrogen directly. Cryopreservation of oocyte can provide sources of oocytes for the embryo engineering technology，such as external fertilization，nuclear transfer，transgenosis. It is vital to establish seed bank for breeding stocks，rare animals and endangered species，solve fertility problems for infertile women. So research on oocyte cryopreservation is of great signification.In recent years，researchers attact great importance to the studies on low-temperature of fish oocytes and embryos. This article summarized current research progress and existing main problems，and collected the detection method of fish oocyte.

Key words fish oocyte；vitrification；influential factors；detection methods

生物細(xì)胞、組織、器官、胚胎甚至個(gè)體在超低溫（-196 ℃）狀態(tài)下代謝完全停止，生命因此得以長(zhǎng)期保存。慢速冷卻法作為傳統(tǒng)的低溫保存方式，深受冷卻速率的影響[1-4]，冷卻速率過(guò)快或過(guò)慢，均會(huì)對(duì)保存的細(xì)胞及組織造成損傷[5]。所謂玻璃化凍存，是生物材料低溫凍存中的一種方式，具體指利用一種或多種高濃度冷凍保護(hù)劑（即玻璃化液）保護(hù)待冷凍的生物材料，直接投入液氮中進(jìn)行凍存的方法。在此過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷w的玻璃態(tài)，其內(nèi)部無(wú)晶體或僅少量結(jié)晶形成，從而防止冰晶的形成而減小對(duì)生物材料的損傷[6]。之后，細(xì)胞在一定的復(fù)溫條件下重新復(fù)活，從而達(dá)到種質(zhì)資源保存和應(yīng)用的目的[7-8]。

1 研究進(jìn)展

自1985年小鼠胚胎玻璃化凍存獲得成功之后[9]，哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞、精子、胰島、胚胎神經(jīng)細(xì)胞以及各階段胚泡等也相繼獲得成功[10]。但卵細(xì)胞因體積較大，結(jié)構(gòu)和組分較復(fù)雜，抗凍能力較低，其冷凍保存仍不盡人意[11]。目前僅有一些嚙齒類(lèi)或牛卵細(xì)胞，或是卵巢組織冷凍保存成功的報(bào)道，但各實(shí)驗(yàn)室間的試驗(yàn)結(jié)果有很大的差異[12-15]。由于魚(yú)類(lèi)卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜滲透性低[16-17]及卵母細(xì)胞高度的低溫敏感性[17-19]，大大影響了魚(yú)類(lèi)卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的研究進(jìn)展。目前尚沒(méi)有魚(yú)類(lèi)卵母細(xì)胞成功進(jìn)行低溫保存的報(bào)道[20]。M.Guan等在斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞玻璃化凍存的研究中發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞使用V3、V4玻璃化液、KCl緩沖液中具有較低的毒性和較好的冷凍效果，然而經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)，冷凍復(fù)溫后的卵母細(xì)胞存活率顯著低于冷凍前，因此復(fù)溫方式的優(yōu)化還有待進(jìn)一步解決[21]。目前，魚(yú)類(lèi)卵細(xì)胞和胚胎的低溫和超低溫保存研究已經(jīng)引起人們高度的重視[22]。

2 影響魚(yú)卵細(xì)胞玻璃化凍存的主要因子

2.1 卵膜的通透性、預(yù)平衡時(shí)間及玻璃化液的濃度和種類(lèi)

魚(yú)類(lèi)卵膜的通透性是影響魚(yú)類(lèi)卵細(xì)胞玻璃化凍存的一個(gè)重要限制因子[7]，由于卵膜的通透性差，且有卵黃的存在，將魚(yú)卵細(xì)胞置于玻璃化液中預(yù)平衡時(shí)，如果時(shí)間太短，玻璃化液不能完全進(jìn)入卵細(xì)胞內(nèi)，影響凍存效果，然而如果置于玻璃化液中時(shí)間太久，玻璃化液自身毒性可造成魚(yú)卵細(xì)胞死亡。因此，研究魚(yú)卵細(xì)胞內(nèi)水分分布及提高卵膜通透性、使用合適的玻璃化液濃度和種類(lèi)降低玻璃化液毒性可有力克服障礙，是成功凍存魚(yú)卵細(xì)胞的前提條件。1988年，Agre等在紅細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)水通道蛋白后[23]，Delgado等將水通道蛋白3的cRNA注射于青鳉卵細(xì)胞中并表達(dá)，研究結(jié)果證明注射后卵膜對(duì)水的滲透性提高2倍，甘氨酸達(dá)到（2.20±1.29）cm/min、乙二醇達(dá)到（2.98±0.36）cm/min、腎上腺素達(dá)到（3.93±1.70）cm/min、二甲基亞砜達(dá)到（3.11±0.74）×10-3 cm/min，相比正常卵母細(xì)胞均顯著提高[24]。此外隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，也有研究者將顯微注射技術(shù)[25-27]、飛秒激光脈沖技術(shù)[28]、超聲波空化技術(shù)[29-31]應(yīng)用于玻璃化凍存的研究中，也取得一定成效。

2.2 卵細(xì)胞冷敏感性

在魚(yú)類(lèi)胚胎的冷凍過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，卵黃囊是魚(yú)類(lèi)胚胎的冷敏感性關(guān)鍵部位，卵黃外由卵黃合胞體層包圍，通透性差，阻礙了抗凍劑進(jìn)入卵黃，在冷凍過(guò)程中產(chǎn)生冰晶對(duì)胚胎造成損傷。Liu等利用顯微注射法對(duì)斑馬魚(yú)6體節(jié)期胚胎進(jìn)行部分卵黃去除，冷凍后發(fā)現(xiàn)其存活率及低溫耐受性均顯著高于正常胚胎[25]。武鵬飛等研究了顯微注射抗凍劑種類(lèi)、抗凍劑的注射劑量、注射濃度、以及抗凍劑注射后牙鲆胚胎的冷敏感性影響，發(fā)現(xiàn)顯微注射后胚胎的冷敏感性有一定的降低[32]。同樣，魚(yú)卵細(xì)胞也具有高度的冷敏感性，如果將顯微注射技術(shù)應(yīng)用于魚(yú)卵細(xì)胞中，是否可以降低卵細(xì)胞冷敏感性，這一問(wèn)題亟待解決。

2.3 冷凍后復(fù)溫及玻璃化液洗脫

復(fù)溫是指在魚(yú)卵細(xì)胞置于液氮中凍存后，采用特定方式使其恢復(fù)至正常溫度的過(guò)程，該過(guò)程是降溫的逆步驟，在冷凍降溫中可能出現(xiàn)的一些損傷效應(yīng)，在復(fù)溫過(guò)程中同樣存在（如細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成），目前報(bào)道的主要有快速?gòu)?fù)溫（40～150 ℃/min）和慢速?gòu)?fù)溫（2～8 ℃/min）[7]，但是這2種復(fù)溫方式在不同的細(xì)胞凍存中表現(xiàn)出不同的效果[33-35]。另外，胡軍祥等在大鼠胚腦細(xì)胞玻璃化凍存的研究中，采用微波復(fù)溫和水浴復(fù)溫相比，其結(jié)果表明采用微波復(fù)溫可有效提高細(xì)胞復(fù)溫速率，且對(duì)細(xì)胞的損傷明顯小于水浴復(fù)溫[36]。

此外，魚(yú)卵細(xì)胞在冷凍前預(yù)平衡期，吸收大量的玻璃化液，其細(xì)胞內(nèi)滲透壓極大升高，如果直接將凍存后卵細(xì)胞置于水中，細(xì)胞可能吸水過(guò)多而破裂。因此，采用合適的洗脫液種類(lèi)和濃度梯度也是影響凍存后細(xì)胞活性的重要影響因子。

3 常用的酶活性測(cè)定判斷冷凍效果

3.1 比色法測(cè)定卵母細(xì)胞ATP酶活性

ATP酶可催化ATP水解生成ADP及無(wú)機(jī)磷的反應(yīng)，常通過(guò)測(cè)定反應(yīng)釋放的無(wú)機(jī)磷量或ATP的減少量以及pH值變化等來(lái)測(cè)定ATP酶的活力。酶活力單位定義為每小時(shí)每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無(wú)機(jī)磷的量為1個(gè)ATP酶活力單位（U）。

3.2 鉬酸銨法測(cè)定卵母細(xì)胞肌酸激酶（creatine kinase，CK）

CK催化肌酸和ATP之間高能磷酸鍵轉(zhuǎn)換生成磷酸肌酸和ADP的可逆反應(yīng)。磷酸肌酸生成后很快全部水解為磷酸，此時(shí)三磷酸腺苷和二磷酸腺苷仍穩(wěn)定，加入鉬酸銨形成磷鉬酸，可進(jìn)一步還原成鉬藍(lán)，根據(jù)生成無(wú)機(jī)磷的量可計(jì)算出酶的活力。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出CK活力。

3.3 MTT法測(cè)定琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）

活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠還原MTT，生成甲臜（藍(lán)色或藍(lán)紫色，不溶于水），經(jīng)異丙醇作用顆粒溶解顯色。甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度570 nm處OD值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目。酶活力單位定義為1 mg蛋白1 min使反應(yīng)體系的吸光度降低0.01為1個(gè)比活性單位（U）。

3.4 紫外分光光度法測(cè)定乳酸脫氫酶（llactate dehydroge-nase，LDH）

LDH可催化乳酸與丙酮酸之間的氧化還原反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定NADH的吸光值可以反應(yīng)出LDH酶活力。酶活力單位定義為每克組織蛋白37 ℃與基質(zhì)作用15 min，在反應(yīng)體系中產(chǎn)生1 μmol丙酮酸為1個(gè)單位（U）。

3.5 氮藍(lán)四唑（NBT）顯色法測(cè)定超氧化物歧化酶（supero-xided，SOD）

NBT顯色法，通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生O2-，將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲臜，甲臜在560 nm處有強(qiáng)吸收。而SOD可清除O2-，從而抑制甲臜形成。反應(yīng)液藍(lán)色的深淺可以反映超氧化物岐化酶活性的高低。酶活力單位定義為1 mg組織蛋白在1mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位（U）。

3.6 過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）

CAT屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過(guò)氧化氫分解為水和分子氧，在此過(guò)程中起傳遞電子的作用，過(guò)氧化氫則既是氧化劑又是還原劑?？筛鶕?jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測(cè)定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過(guò)量）的過(guò)氧化氫溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的過(guò)氧化氫，即可求出消耗的H2O2的量?；盍挝欢x為1 mg組織蛋白1 s分解1 μmol的過(guò)氧化氫的量為1個(gè)酶活力單位（U）。

3.7 比色法測(cè)定谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）

GSH-Px的活力以催化GSH氧化的反應(yīng)速度，及單位時(shí)間內(nèi)GSH減少的量來(lái)表示，GSH和5，5-二硫?qū)ο趸郊姿幔―TNB）反應(yīng)在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子，于423 nm波長(zhǎng)有最大吸收峰，測(cè)定該離子濃度，即可算出GSH減少的量，由于GSH能進(jìn)行非酶反應(yīng)氧化，所以最后計(jì)算酶活力時(shí)，必須扣除非酶反應(yīng)所引起的GSH減少。規(guī)定每1 mg蛋白質(zhì)，1 min扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系GSH濃度降低1 μmol/L為1個(gè)酶活力單位。

3.8 硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量

在較高溫度及酸性環(huán)境中，MDA可與TBA反應(yīng)，形成紅色的MDA-TBA加合物，通過(guò)比色法可對(duì)動(dòng)植物組織或細(xì)胞裂解液中MDA進(jìn)行定量檢測(cè)。計(jì)算公式如下：

組織中MDA含量（nmol/mg prot）=（管吸光度-測(cè)定空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)

4 前景展望

中國(guó)是一個(gè)水生生物資源十分豐富的國(guó)家，然而近年來(lái)由于魚(yú)類(lèi)棲息環(huán)境的變化、過(guò)度捕撈、不合理引種、外來(lái)生物等因素影響[37]，我國(guó)魚(yú)類(lèi)生物多樣性處于衰退形勢(shì)。雖然在魚(yú)卵細(xì)胞的玻璃化凍存的研究中，還存在諸多的困難有待解決，但其在防止魚(yú)類(lèi)近親交配、保存魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源、維持生物遺傳多樣性等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值[7]，隨著我國(guó)科技的不斷發(fā)展，相關(guān)研究的不斷深入，不斷優(yōu)化魚(yú)卵細(xì)胞玻璃化凍存途徑和技術(shù)路線，解決魚(yú)卵細(xì)胞自身存在的問(wèn)題，降低各因子的影響作用，成功使用玻璃化方法凍存魚(yú)卵細(xì)胞指日可待。

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