王鶴潼，宋　婕，崔偉娜，曹　霞，何　蕾，賈春云，惠秀娟，臺(tái)培東，成智博，劉　宛*

（1.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所污染生態(tài)與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110016；2.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng)110163；3.遼寧大學(xué)，沈陽(yáng) 110036；4.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，上海 201418；5.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽(yáng) 110866；6.通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜所，內(nèi)蒙古通遼 028000）

植物位點(diǎn)特異性甲基化研究的引物設(shè)計(jì)及PCR體系優(yōu)化

王鶴潼1，2，宋婕3，崔偉娜4，曹霞5，6，何蕾3，賈春云1，惠秀娟1，臺(tái)培東1，成智博1，劉宛1*

（1.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所污染生態(tài)與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110016；2.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng)110163；3.遼寧大學(xué)，沈陽(yáng) 110036；4.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，上海 201418；5.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽(yáng) 110866；6.通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜所，內(nèi)蒙古通遼 028000）

通過(guò)設(shè)計(jì)大量引物，探索在植物甲基化引物設(shè)計(jì)中長(zhǎng)、短引物的設(shè)計(jì)方法及其相應(yīng)的PCR條件，同時(shí)比較不同Taq酶對(duì)甲基化率影響。結(jié)果表明：17～30 bp短引物適合使用Touch-down程序PCR，但特異性差、成功率低；31～50 bp長(zhǎng)引物使用55℃退火60℃延伸的PCR條件成功率最高，其中反向引物的長(zhǎng)度及Tm小于正向引物較佳；高保真酶因其3′→5′外切酶活性不宜用于甲基化研究，而EpiTaqTMHS在PCR結(jié)果中表現(xiàn)最佳。

植物甲基化；引物設(shè)計(jì)；Taq酶；PCR條件

王鶴潼，宋婕，崔偉娜，等.植物位點(diǎn)特異性甲基化研究的引物設(shè)計(jì)及PCR體系優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（9）：1686-1693.

WANG He-tong，SONG Jie，CUI Wei-na，et al.Primer design and PCR condition optimization for plant site-specific methylation［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（9）：1686-1693.

表觀遺傳修飾是一種不同于核苷酸序列的可遺傳信息，主要包括DNA甲基化和組蛋白修飾，研究發(fā)現(xiàn)其在植物生長(zhǎng)發(fā)育、基因表達(dá)調(diào)控以及抗逆脅迫中起著至關(guān)重要的作用［1-2］。DNA甲基化廣泛存在于多種有機(jī)體中，且多數(shù)發(fā)生在胞嘧啶第5碳原子上形成5-甲基胞嘧啶。在植物中，DNA甲基化是一種普遍現(xiàn)象，20%～30%的基因組胞嘧啶處于甲基化狀態(tài)，并分布于CG、CHG、CHH位點(diǎn)（H代表A、G或T）［3-5］。隨著人們對(duì)植物DNA甲基化研究愈來(lái)愈關(guān)注，開(kāi)發(fā)出眾多檢測(cè)DNA甲基化的方法。根據(jù)研究?jī)?nèi)容和目的的不同，可分為檢測(cè)全基因組甲基化和位點(diǎn)特異性甲基化兩類方法，其中前者主要以高效液相色譜法［6］、基于甲基化敏感內(nèi)切酶（如：Methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP［7］和Methylation-sensitive arbitrarily primed PCR，MSAP-PCR［8-10］等）和基于South ern探針雜交（如：CGI array和cDNA microarray等）［2］的方法為主，由于芯片技術(shù)需要開(kāi)發(fā)大量探針且成本較高，而高效液相色譜法條件優(yōu)化較復(fù)雜，因此在植物研究中多數(shù)使用基于甲基化敏感內(nèi)切酶的方法。

在位點(diǎn)特異性甲基化研究中，以使用重亞硫酸鹽限制酶組合分析［11］（COBRA）、甲基化特異性PCR［12］（MSP）和重亞硫酸鹽測(cè)序法（Bisulfite Sequencing）［13-15］為主。隨著DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展，由于植物基因組CG含量較高而無(wú)法使用焦磷酸測(cè)序，重亞硫酸鹽測(cè)序法的檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性均高于COBRA法和MSP法，目前位點(diǎn)特異性甲基化研究中重亞硫酸鹽測(cè)序法的使用最為廣泛［16-17］。然而，隨著該方法在植物上的不斷應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)其中仍然存在一些較棘手的技術(shù)性問(wèn)題，即DNA目的片段重亞硫酸鹽修飾后擴(kuò)增結(jié)果不理想和測(cè)序后甲基化率不穩(wěn)定，其中涉及引物的設(shè)計(jì)、PCR條件的優(yōu)化和Taq酶的選擇三個(gè)方面［18］。由于植物基因組CG含量與動(dòng)物及人相比較高［19］，基因組修飾后重復(fù)序列過(guò)多，導(dǎo)致應(yīng)用該方法時(shí)在設(shè)計(jì)引物和選擇目標(biāo)區(qū)域上會(huì)受到極大限制，同時(shí)還因所需目的基因區(qū)域的范圍限制，導(dǎo)致所設(shè)計(jì)引物的Tm、特異性和穩(wěn)定性不佳，使其在修飾后的DNA上不易擴(kuò)增。另外，我們還發(fā)現(xiàn)不同的Taq酶對(duì)測(cè)序后的DNA甲基化率有明顯影響，而這些問(wèn)題都讓植物甲基化研究受到阻礙。因此，本研究從完善方法著手，首次通過(guò)分析不同引物設(shè)計(jì)方式和不同引物擴(kuò)增體系對(duì)甲基化結(jié)果的影響，優(yōu)化植物研究中重亞硫酸鹽測(cè)序法的實(shí)驗(yàn)條件，最終建立一個(gè)兼顧實(shí)驗(yàn)操作性和結(jié)果穩(wěn)定性的重亞硫酸鹽測(cè)序法實(shí)驗(yàn)體系，為植物的位點(diǎn)特異性甲基化研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1植物材料的培養(yǎng)與處理

選用哥倫比亞型擬南芥種子，經(jīng)10%次氯酸鈉消毒后，于滅菌超純水中4℃浸種24 h打破春化。浸種后在無(wú)菌臺(tái)上將種子轉(zhuǎn)移至滅菌后0.5×MS培養(yǎng)基（0.5%蔗糖）中，并于21℃、10 h光照培養(yǎng)15 d［9］。

1.2DNA的提取

將不同培養(yǎng)罐中的幼苗混合，使用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒（CW0531）提取混合幼苗地上部DNA，然后使用Eppendorf Biophotometor Plus檢測(cè)DNA含量，根據(jù)測(cè)定結(jié)果上樣50 ng DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，用TaKaRa DL2000 DNA Marker進(jìn)行含量校準(zhǔn)并分裝成每管1 μg，-70℃冰箱保存。

1.3重亞硫酸鹽測(cè)序法

按照說(shuō)明書(shū)使用 EZ DNA Methylation-GoldTMKits（Zymo research）修飾 100 ng DNA。根據(jù)TAIR （www.tair.org）擬南芥DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)，使用Primer 5和Oligo 7自設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1、MSH2、MSH6和MSH7啟動(dòng)子片段（引物序列及PCR條件詳見(jiàn)“結(jié)果與分析”）；擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖（TaKaRa）凝膠電泳檢測(cè)；目的片段使用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit回收純化；純化后的PCR片段連接載體后克隆測(cè)序（上海英駿生物技術(shù)有限公司）。

2　結(jié)果與分析

2.1植物甲基化研究中短引物的設(shè)計(jì)與應(yīng)用

由于植物核基因組CG含量較高，修飾后造成基因組存在大量重復(fù)序列使引物特異性降低，因此本實(shí)驗(yàn)室為研究脅迫誘導(dǎo)擬南芥幼苗錯(cuò)配修復(fù)基因啟動(dòng)子甲基化變異，設(shè)計(jì)了大量長(zhǎng)度在17～30 bp的正、反向引物，發(fā)現(xiàn)其中僅有3對(duì)引物MLH1-1F/MLH1-1R、MLH1-410F/MLH1-410R和MSH6_P6F/MSH6_P6R3（表1）擴(kuò)增出所需目的片段，且擴(kuò)增穩(wěn)定（圖1）。通過(guò)比較引物相關(guān)信息，發(fā)現(xiàn)這3對(duì)成功擴(kuò)增的引物，其正向引物的長(zhǎng)度和Tm均大于反向引物（表1），說(shuō)明在正、反向引物的設(shè)計(jì)上，需要反向引物的長(zhǎng)度短于正向引物，前者可以優(yōu)先退火結(jié)合模板；而正引物較長(zhǎng)，可增加引物的特異性，其Tm高于反向引物利于在反向引物擴(kuò)增后，迅速結(jié)合反向引物所在的模板鏈，最終完成整個(gè)PCR過(guò)程。

圖1表明，在PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化上，通過(guò)使用多種方式擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)，Touch-down對(duì)于這三種甲基化短引物的擴(kuò)增均有較好的效果：引物MLH1-1F/MLH1-1R使用55℃退火30 s，且每個(gè)循環(huán)降0.5℃，運(yùn)行17個(gè)循環(huán)，然后47℃退火30 s運(yùn)行21個(gè)循環(huán)為退火條件；引物MLH1-410F/MLH1-410R使用55℃退火30s，且每個(gè)循環(huán)降1℃，運(yùn)行11個(gè)循環(huán)，然后45℃退火30 s運(yùn)行27個(gè)循環(huán)為退火條件；引物MSH6_P6F/ MSH6_P6R3使用56℃退火30 s，且每個(gè)循環(huán)降0.5℃，運(yùn)行9個(gè)循環(huán)，然后52℃退火30 s運(yùn)行30個(gè)循環(huán)為退火條件。

表1　實(shí)驗(yàn)中自設(shè)計(jì)的甲基化短引物Table 1 Self-designed short primers for methylation in this study

圖1　自設(shè)計(jì)短引物電泳驗(yàn)證Figure 1 Electriphoresis validation of products amplified by 3 pairs of short，self-designed primers

該結(jié)果說(shuō)明，甲基化短引物設(shè)計(jì)的實(shí)現(xiàn)需對(duì)應(yīng)優(yōu)化PCR條件，根據(jù)正、反向引物的Tm決定Touchdown程序的遞降范圍，原則上Touch-down程序退火最高溫度設(shè)定于正、反向引物Tm之間，不可超過(guò)反向引物Tm過(guò)多，最低退火溫度與最高退火溫度之差原則上小于10℃。而且，引物3′端的ΔG需要低于普通PCR引物，更利于甲基化引物退火后快速引發(fā)延伸反應(yīng)。

結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，雖然引物MSH6_P6F/MSH6_P6R3能夠擴(kuò)增出較穩(wěn)定的PCR產(chǎn)物，且與DNA marker比較后其片段大小也與目的片段基本相似，但經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序并與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，所擴(kuò)增的序列與葉綠體DNA高度同源（圖2），并非所需目的基因MSH6的PCR片段。這說(shuō)明甲基化短引物仍存在弊端，無(wú)法避免基因組修飾后導(dǎo)致的引物特異性嚴(yán)重下降。

2.2植物甲基化研究中長(zhǎng)引物的設(shè)計(jì)與應(yīng)用

由于甲基化短引物無(wú)法避免基因組修飾后導(dǎo)致的引物特異性嚴(yán)重下降，致使PCR產(chǎn)物可能為非目的片段。為了克服該問(wèn)題，本研究設(shè)計(jì)了大量長(zhǎng)度為31～50 bp的長(zhǎng)引物。表2中提供了部分該實(shí)驗(yàn)中的自設(shè)計(jì)引物，其中覆蓋了擬南芥MSH2和MSH7基因的啟動(dòng)子區(qū)0～-600，且每個(gè)基因含有2對(duì)有效引物，表2中帶“*”號(hào)引物為有效引物，其中dMSH2-11F/ dMSH2-5R和dMSH2b-7F/dMSH2b-4R為MSH2基因啟動(dòng)子引物，dMSH7-3F/dMSH7-2R和dMSH7b-4F/dMSH7b-2R為MSH7基因啟動(dòng)子引物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果該4對(duì)引物均為有效擴(kuò)增（圖3），且經(jīng)測(cè)序比對(duì)驗(yàn)證是目的片段。

由于引物長(zhǎng)度的加大可以使引物特異性得到很大的提升，正向引物已很難非特異性的結(jié)合非對(duì)應(yīng)模板。根據(jù)短引物設(shè)計(jì)所得經(jīng)驗(yàn)，在設(shè)計(jì)引物中依然盡量保持反向引物的長(zhǎng)度小于正向引物，至少保證絕對(duì)不大于正向引物長(zhǎng)度。結(jié)合表2和圖3結(jié)果分析，表明反向引物僅需不大于正向引物，兩者Tm僅需相差不大，且有較低的3′端ΔG，便可擴(kuò)增出目的片段。在引物的PCR程序選擇上，通過(guò)對(duì)各種方式的嘗試，最終發(fā)現(xiàn)，使用55℃退火30 s、60℃延伸2 min適合甲基化長(zhǎng)引物擴(kuò)增，而且其特異性和穩(wěn)定性較高。

圖2　引物MSH6_P6F/MSH6_P6R3擴(kuò)增產(chǎn)物Blast驗(yàn)證Figure 2 Blast validation of PCR products amplified by primers MSH6_P6F/MSH6_P6R3

表2顯示，隨著引物加長(zhǎng)，不可避免的問(wèn)題便是引物中覆蓋了許多可修飾位點(diǎn)，但這些位點(diǎn)是否被修飾未知，因此只能通過(guò)使用簡(jiǎn)并堿基代替。過(guò)多的簡(jiǎn)并會(huì)導(dǎo)致引物的特異性和穩(wěn)定性下降，因此本實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)引物時(shí)，每個(gè)引物均設(shè)計(jì)成3～6對(duì)簡(jiǎn)并形式（表2）。通過(guò)比較有效引物和無(wú)效引物，在我們成功擴(kuò)增的4對(duì)引物中，發(fā)現(xiàn)并非所有可修飾位點(diǎn)全部簡(jiǎn)并是最佳的，其3′端需要簡(jiǎn)并，尤其是3′端的前1/3部分，然而其前3個(gè)堿基不能出現(xiàn)可修飾位點(diǎn)；其他位置的可修飾位點(diǎn)并無(wú)明顯的規(guī)律，一般情況下非5′端連續(xù)3個(gè)可修飾位點(diǎn)的堿基需要簡(jiǎn)并，同時(shí)連續(xù)可修飾位點(diǎn)應(yīng)避開(kāi)3′端。

2.3不同Taq酶對(duì)甲基化率的影響

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)擬南芥錯(cuò)配修復(fù)基因的甲基化研究發(fā)現(xiàn)，不同的Taq酶對(duì)PCR擴(kuò)增效果和甲基化率有明顯的差別。因此本實(shí)驗(yàn)選用3種不同類型的Taq酶（表3）對(duì)相同DNA的MLH1基因啟動(dòng)子進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)PrimeSTARHS所得結(jié)果的甲基化率遠(yuǎn)大于其他兩種Taq酶，而專為重亞硫酸鹽修飾模板擴(kuò)增開(kāi)發(fā)的EpiTaqTMHS比常規(guī)的TaKaRaTaq的甲基化率略高。該結(jié)果表明，高保真酶PrimeSTARHS由于其結(jié)果過(guò)高并不適合于甲基化研究，而TaKaRaTaq由于其酶能力所限，無(wú)法檢測(cè)出目的片段內(nèi)全部甲基化變異位點(diǎn)。

3　討論

3.1引物設(shè)計(jì)及優(yōu)化在植物位點(diǎn)特異性甲基化研究中的重要性

圖3　自設(shè)計(jì)長(zhǎng)引物電泳驗(yàn)證Figure 3 Electriphoresis validation of products amplified by 4 pairs of short，self-designed primers

隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的高速發(fā)展，對(duì)于一般生物科學(xué)研究而言，實(shí)驗(yàn)中使用的關(guān)鍵技術(shù)已不再是制約，而且各類儀器、技術(shù)服務(wù)以及試劑盒的開(kāi)發(fā)極大地方便了科學(xué)研究并簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程。因此，實(shí)驗(yàn)和研究人員所面臨的難題便是課題或?qū)嶒?yàn)的設(shè)計(jì)，以及方法或技術(shù)的選擇和優(yōu)化［20］。對(duì)于植物位點(diǎn)特異性甲基化研究而言，其特異性位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)、選擇和優(yōu)化便是難點(diǎn)。

表2　實(shí)驗(yàn)中自設(shè)計(jì)的甲基化長(zhǎng)引物Table 2 Self-designed long primers for methylation in this study

表3　本研究所選用的Taq酶Table 3 Taq polymerase used in this study

一方面，由于植物基因組CG含量較高［19］，導(dǎo)致經(jīng)過(guò)重亞硫酸鹽修飾后基因組重復(fù)序列過(guò)多，引物結(jié)合模板的特異性下降，而且胞嘧啶過(guò)多也給設(shè)計(jì)引物造成較大的困難，因?yàn)樵谥付ǖ膮^(qū)域或范圍內(nèi)，很難找到較優(yōu)異的引物。另一方面，由于PCR擴(kuò)增的模板是修飾過(guò)的，與原DNA差異較大，網(wǎng)上并沒(méi)有相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)，也無(wú)法對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行特異性分析（Primer-blast），只有通過(guò)PCR實(shí)踐檢測(cè)驗(yàn)證。這些原因均極大地阻礙了實(shí)驗(yàn)的進(jìn)度和研究的開(kāi)展，導(dǎo)致即使擁有高效的DNA提取、修飾及純化的試劑盒，實(shí)驗(yàn)卻仍然停滯不前。因此，在植物位點(diǎn)特異性甲基化研究中，引物的設(shè)計(jì)和優(yōu)化尤為重要。

3.2植物位點(diǎn)特異性甲基化的引物設(shè)計(jì)

圖4　3種Taq酶擴(kuò)增修飾后擬南芥MLH1基因啟動(dòng)子的甲基化結(jié)果Figure 4 Methylation profile of Arabidopsis MLH1 promoter amplified by 3 Taq polymerase after sodium bisulfite modification

本實(shí)驗(yàn)室主要研究Cd脅迫下擬南芥的遺傳損傷［9-10，21-22］，其中包括對(duì)錯(cuò)配修復(fù)基因表觀遺傳損傷的研究，并為此設(shè)計(jì)了大量的引物。然而經(jīng)PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)的結(jié)果并不理想，約20余對(duì)短引物（17～30 bp）中，僅有3對(duì)成功擴(kuò)增（表1）。通過(guò)整理引物并總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)主要原因在于引物的特異性上，由于引物長(zhǎng)度較短，修飾的DNA重復(fù)序列高，導(dǎo)致引物的非特異性極高，這便使目的片段很難擴(kuò)增。然而根據(jù)這些所設(shè)計(jì)引物，我們對(duì)有效引物和失敗引物進(jìn)行了比較分析，得到了一些有用的經(jīng)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)正向引物的長(zhǎng)度和Tm需要大于反向引物，且3′端ΔG也要保持較低（-6.0 kcal·mol-1左右），這樣引物的成功率會(huì)顯著提升（表1）。該現(xiàn)象是因?yàn)榧谆颬CR與常規(guī)PCR有一重要區(qū)別，便是在實(shí)際擴(kuò)增過(guò)程中只利用了一條鏈作為模板，即單鏈擴(kuò)增，而與該模板鏈對(duì)應(yīng)的引物便是反向引物，故在設(shè)計(jì)引物時(shí)，首先需考慮的便是讓反向引物更易退火且特異性較高。反向引物長(zhǎng)度短于正向引物，便會(huì)先于正向引物退火結(jié)合到模板上；同時(shí)因3′端ΔG較低，會(huì)讓引物退火后快速有效的引發(fā)延伸反應(yīng)，而正向引物盡管Tm高于反向引物，但因引物長(zhǎng)度大導(dǎo)致其引物特異性略高，且沒(méi)有對(duì)應(yīng)模板，不易退火。當(dāng)反向引物擴(kuò)增后，正向引物的高Tm會(huì)迅速讓其退火反向引物擴(kuò)增鏈，并保持高于反向引物的退火能力及延伸能力，這樣可盡量保持兩條引物的同步擴(kuò)增，又不至于單條鏈過(guò)于富集造成PCR效率下降。

在成功擴(kuò)增產(chǎn)物的引物中，經(jīng)測(cè)序比對(duì)驗(yàn)證仍有非目的片段的擴(kuò)增（圖2），因此短引物用作甲基化引物依然存在弊端。為此本實(shí)驗(yàn)室又設(shè)計(jì)了大量長(zhǎng)引物（31～50 bp）。根據(jù)表2發(fā)現(xiàn)，除不同簡(jiǎn)并形式外，長(zhǎng)引物的成功率可在50%以上，其中設(shè)計(jì)引物原則基本與短引物保持一致，即反向引物更易于結(jié)合模板。另外，引物除5′端外要保持較低ΔG，即在引物內(nèi)部穩(wěn)定性上（Internal stability）呈“W”型，并且不能存在ΔG過(guò)低的發(fā)夾或二聚體。另一方面，由于引物過(guò)長(zhǎng)必然導(dǎo)致覆蓋較多的可修飾位點(diǎn)，引物當(dāng)中的可變堿基需要簡(jiǎn)并，然而不同的簡(jiǎn)并形式會(huì)對(duì)PCR擴(kuò)增造成直接影響。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)3′端若有可修飾位點(diǎn)則必須簡(jiǎn)并，但該狀況越少越好，因?yàn)樗苯佑绊懸镅由旆磻?yīng)的引發(fā)，但是3′末端的前3個(gè)堿基不允許存在可修飾位點(diǎn)。另外，需要避免2個(gè)堿基以上的連續(xù)可修飾位點(diǎn)，且不應(yīng)出現(xiàn)在3′端，如含有則須簡(jiǎn)并。終上所述，雖然長(zhǎng)引物依然存在一些不可控因素，但與短引物相比，其引物設(shè)計(jì)成功率已得到極大提升，并且通過(guò)選擇適合的PCR程序和Taq酶也可在一定程度上提高其成功率。

3.3PCR程序和Taq酶的選擇

圖1結(jié)果表明，短引物擴(kuò)增所使用的PCR程序是Touch-down模式。在該方式下，設(shè)定的起始退火溫度高于反向引物的Tm，使反向引物能有較高的特異性，而該溫度低于正向引物Tm，可在反向引物延伸后迅速以其為模板進(jìn)行擴(kuò)增。隨著前幾輪擴(kuò)增，使有義模板富集，此時(shí)退火溫度已下降，可增加PCR擴(kuò)增的整體效率以便得到較高含量的目的片段。但是，因?yàn)橥嘶饻囟戎皇怯绊慞CR效率的次要因素，如果引物特異性差，PCR程序如何優(yōu)化也于事無(wú)補(bǔ)，所以長(zhǎng)引物的選用成必然趨勢(shì)。

表2和圖3結(jié)果表明，通過(guò)多種方式的嘗試和驗(yàn)證，最終發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)引物的PCR程序如下：95℃變性30 s，55℃退火15～30 s，60℃延伸2～3 min。在該P(yáng)CR程序中，選用長(zhǎng)退火或延伸時(shí)間會(huì)造成PCR總時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而引起酶活力下降，因而需要根據(jù)不同Taq酶的擴(kuò)增能力（主要指單位時(shí)間擴(kuò)增片段長(zhǎng)度）和活力的持久度，決定退火及延伸時(shí)間，此PCR條件與Henderson等［18］所用方法相似。該P(yáng)CR條件的優(yōu)點(diǎn)是，對(duì)于Tm較高的長(zhǎng)引物，55℃會(huì)讓引物迅速地在高特異性和穩(wěn)定性的位點(diǎn)上退火，然后在60℃進(jìn)行邊退火邊延伸，這樣可使一些低穩(wěn)定性和可修飾的位點(diǎn)繼續(xù)退火，也可進(jìn)行較穩(wěn)定的延伸。然而缺點(diǎn)便是PCR程序時(shí)間過(guò)長(zhǎng)且對(duì)酶的性能要求較高，因?yàn)?0℃并不是Taq最佳溫度，在該溫度下其延伸效率不足72℃的一半，致使延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，而普通的Taq在2 h后性能會(huì)明顯下降，最終影響PCR的效果。

圖4結(jié)果表明，在Taq酶的選擇上，PrimeSTAR HS并不適合甲基化PCR，因?yàn)樗械母弑Ｕ婷付己?′→5′核酸外切酶活性，而尿嘧啶與胸腺嘧啶相比少一個(gè)甲基，雖然在堿基配對(duì)時(shí)也可形成兩個(gè)氫鍵，但形成雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)并不穩(wěn)定，可能會(huì)影響高保真酶的擴(kuò)增，甚至?xí)`認(rèn)其是錯(cuò)配而將其外切掉，導(dǎo)致已修飾位點(diǎn)不易擴(kuò)增而含甲基化位點(diǎn)的DNA可正常延伸，最終引起結(jié)果中高甲基化的極端現(xiàn)象。而且在部分品牌高保真酶的說(shuō)明書(shū)上，雖然沒(méi)有強(qiáng)調(diào)卻有提示“不宜使用含dUTP或尿嘧啶的模板和引物”。因此，甲基化引物的PCR更注重對(duì)Taq酶的擴(kuò)增能力。相對(duì)于普通的TaKaRaTaq，由于EpiTaqTMHS專為修飾DNA設(shè)計(jì)，其擴(kuò)增能力得到加強(qiáng)，且在保真性能上不依賴外切酶活性，因此其結(jié)果優(yōu)于TaKaRaTaq。

4　結(jié)論

（1）17～30 bp短引物使用Touch-down程序PCR效果較好，但無(wú)法避免其特異性低的弊端；31～50 bp長(zhǎng)引物可解決該問(wèn)題，并以55℃退火60℃延伸PCR程序擴(kuò)增，成功率最高，其中反向引物的長(zhǎng)度及Tm低于正向引物較佳。

（2）高保真酶因其外切酶活性所致的高甲基化現(xiàn)象，并不適宜用于甲基化研究，而EpiTaqTMHS由于專為修飾模板PCR設(shè)計(jì)，其有較強(qiáng)的擴(kuò)增含尿嘧啶模板及不依賴3′→5′外切酶活性的保真能力，在實(shí)際應(yīng)用中效果最佳。

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Primer design and PCR condition optimization for plant site-specific methylation

WANG He-tong1，2，SONG Jie3，CUI Wei-na4，CAO Xia5，6，HE Lei3，JIA Chun-yun1，HUI Xiu-juan1，TAI Pei-dong1，CHENG Zhi-bo1，LIU Wan1*
（1.Key Laboratory of Pollution Ecology and Environmental Engineering，Institute of Applied Ecology，Chinese Academy of Sciences，Shenyang 110016，China；2.Liaoning He University，Shenyang 110163，China；3.Liaoning University，Shenyang 110036，China；4.Shanghai Institute of Technology，Shanghai 201418，China；5.Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；6.Institute of Vegetable Science，Tong Liao Academy of Agricultural Sciences，Tongliao 028000，China）

The present study was to explore design methods for short and long primers in plant methylation research and their corresponding PCR conditions employing large number of designed primers and to analyze the effects on methylation rates using three different Taq polymerases.Results showed：a Touch-down PCR was suitable when using short primers of 17～30 bp，however，low specificity and success rates were observed；PCR performed the best when using long primers of 31～50 bp，provided that length and Tmof forward primers＞those of reverse primers and 55℃and 60℃served as annealing and prolonging temperature，respectively；Super-Fidelity Taq polymerase like Prime STAR Risn′t suitable for methylation research because of its 3′→5′exonuclease activities.However，PCR performed the best when using EpiTaqTMHS.

plant methylation；primer design；Taq polymerase；PCR condition

Q943.2

A

1672-2043（2016）09-1686-08doi：10.11654/jaes.2016-0173

2016－02－02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21347007，41272255，41472237）；國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2012ZX7505-001）

王鶴潼（1985—），男，遼寧沈陽(yáng)人，博士，從事植物分子毒理及表觀遺傳研究。E-mail：tony.w.china@hotmail.com

劉宛E-mail：liuwan63@hotmail.com