李　超，李大軍，鄭　華，張邑帆，曾仁權(quán)，楊　柳*

( 1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶榮昌 402460； 2.西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶榮昌 402460；3.農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶榮昌 402460 )

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研究論文

豬圓環(huán)病毒2b亞型的分離鑒定及基因組序列分析

李超2，李大軍1,3，鄭華1,3，張邑帆1,3，曾仁權(quán)2，楊柳1,3*

( 1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶榮昌 402460； 2.西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶榮昌 402460；3.農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶榮昌 402460 )

為分離鑒定流行于重慶某豬場的豬圓環(huán)病毒2型，本研究從斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征豬的淋巴結(jié)病料中進(jìn)行病毒學(xué)檢測，病毒利用PK-15細(xì)胞增殖，其基因組序列經(jīng)克隆、測序、拼接獲得，并完成對全序列的生物信息學(xué)分析鑒定。結(jié)果獲得了1株豬圓環(huán)病毒2型 (命名PCV-2 CQ1)，該毒株的全序列大小為1 767 bp，同源性分析發(fā)現(xiàn)該病毒與國內(nèi)公布的PCV-2毒株同源性超過了90%，尤其與廣西分離株同源性達(dá)100%；系統(tǒng)進(jìn)化分析本分離病毒與浙江株(EU257511)、黑龍江株(HM038032)聚類到一起，形成一個(gè)進(jìn)化分支，同屬于PCV-2b型；對編碼的衣殼蛋白分析發(fā)現(xiàn)，PCV-2 CQ1 Cap氨基酸發(fā)生了較大變異，與強(qiáng)毒株同源性較高，考慮到本病毒源自PMWS病豬，推測該毒株屬于強(qiáng)毒株。

豬圓環(huán)病毒2型；分離鑒定；序列分析

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV-2)是一種單股環(huán)狀DNA病毒，是引起豬圓環(huán)病毒感染的主要病原。臨床上豬圓環(huán)病毒感染主要表現(xiàn)為仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweanig multisystemic wasting syndrome,PMWS)[1]、豬皮炎與腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、仔豬先天性震顫(Congenital tremors,CT)、呼吸道、消化道癥狀和繁殖障礙等[2]。由PCV-2引起的PMWS是公認(rèn)的危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)性疾病，同時(shí)也是我國養(yǎng)豬業(yè)繼豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征之后的重要傳染病，每年給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的損失[3]。

PCV-2常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)等混合感染。PCV-2可分為PCV-2a、PCV-2b、PCV-2c、PCV-2d、PCV-2e 5個(gè)基因型，有學(xué)者從無PMWS癥狀豬和有明顯PMWS癥狀豬中均分離到了PCV-2，說明了不同型PCV-2之間的毒力不同[4]。PCV-2含11個(gè)開放閱讀框(open reading fame,ORF)，其中ORF1、ORF2為最主要的閱讀框。ORF1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白(replication related protein,Rep)，ORF2編碼病毒衣殼蛋白(capsid protein,Cap)。衣殼蛋白是PCV-2主要的靶抗原，具有較強(qiáng)免疫原性，是目前豬圓環(huán)病毒新型診斷技術(shù)與基因工程疫苗研發(fā)的重要抗原。

本研究從重慶地區(qū)某豬場具有典型PMWS癥狀的豬體中分離鑒定了1株P(guān)CV-2，命名為PCV-2重慶分離株(PCV-2 CQ1)，分析了該毒株的遺傳進(jìn)化情況，并對其致病性進(jìn)行初步預(yù)測，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與細(xì)胞系DNA病毒基因組提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒，OMEGA公司產(chǎn)品；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品；PK-15細(xì)胞，重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。1.1.2引物根據(jù)已發(fā)表的PCV-2序列(AY556475)設(shè)計(jì)3對引物：1st對：F1 5′ -AGTGAGCGGGAAAATGCAGA-3′，R1 5′-TCCTCCGTGGATTGTTCTGT-3′；2nd 對：F2 5′-ATAATCCTTCCGAAGACGAG-3′，R2 5′-TAAGGTTGAATTCTG GCCCT-3′；3rd對：F3 5′-GTGAGGGCTGTGGCCTTTGT -3′，R3 5′-TCGCTTTCTCGATGTGGCAG-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1病毒學(xué)檢查疑似感染PCV-2的發(fā)病豬，源自重慶某養(yǎng)豬場，病豬多為斷奶豬和育肥生長豬。臨床觀察，有明顯皮炎，皮膚上出現(xiàn)大小不等的圓形或不規(guī)則斑塊；病豬表現(xiàn)為生長緩慢、呼吸急迫、消瘦、貧血、出現(xiàn)黃疸等[5]。剖檢后發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)腫大、肝硬變、多灶性黏液性氣管炎、間質(zhì)性肺炎和腎炎。參照文獻(xiàn)[6] ，在無菌環(huán)境下，將淋巴結(jié)加入5倍體積滅菌的磷酸緩沖液研磨，用0.22 μm濾膜過濾后，取一定量的病毒濾液，按照病毒基因組提取試劑盒提取病毒DNA，進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定。

1.2.2病毒的增殖參考文獻(xiàn)[7]，將病毒學(xué)檢測陽性的病料濾液接種至單層PK-15細(xì)胞上， 37 ℃處理2 h，移棄病毒液體，換成含20 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，將培養(yǎng)瓶放入-20 ℃冰箱內(nèi)反復(fù)凍融3次，離心收集病毒液，0.22 μm濾膜過濾，收集病毒液置-80 ℃保存。

1.2.3全基因組DNA序列的測定取0.5 mL細(xì)胞裂解液，提取病毒基因組。取1.5 μL為模板，分別以設(shè)計(jì)的3對引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件與病毒學(xué)檢查的相同。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，陽性PCR產(chǎn)物測序鑒定，DNA測序片段經(jīng)連接成病毒全基因組序列。

1.2.4病毒的生物信息分析所得全序列在NCBI上用Blast進(jìn)行同源性搜索，采用MEGA 4軟件中的鄰接法，基于PCV-2基因組全序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。同時(shí)進(jìn)行序列同源性分析，并將本病毒衣殼蛋白與已知的強(qiáng)毒株和弱毒株衣殼蛋白序列進(jìn)行對比分析。

2　結(jié)果

2.1病毒分離培養(yǎng)

剖檢臨床癥狀為PMWS的病豬，采集腹股溝淋巴結(jié)病料。病料用檢測引物(F1,R1)PCR，其產(chǎn)物經(jīng)電泳顯示，獲得了大約為420 bp的DNA條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。PCR檢測為陽性的病料，用PK-15細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒；細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)反復(fù)凍融裂解，收集PCV-2，并再次檢測確認(rèn)陽性。

2.2病毒PCV-2 基因組全序列測定

對收集的病毒液，用前述3對引物進(jìn)行PCR，其產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2，獲得了明顯的DNA條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)進(jìn)一步測序鑒定，測序顯示各條帶大小分別為417、1 318、750 bp，與預(yù)期值相符。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～3.淋巴結(jié)病料PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000;1-3.PCR products of sample from lymph nodes

圖1樣品淋巴結(jié)含PCV-2 的PCR檢測結(jié)果

Fig.1PCR identification results of sample lymph nodes containing PCV-2

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.用第1對引物的PCR產(chǎn)物;2.用第2對引物的PCR產(chǎn)物;3.用第3對引物的PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000;1.PCR products by the 1st pair of primers;2.PCR products by the 2nd pair of primers;3.PCR products by the 3rd pair of primers

圖2細(xì)胞培養(yǎng)PCV-2 的PCR鑒定結(jié)果

Fig.2PCR identification results of PCV-2 from cell culture

2.3PCV-2 基因組分析

測序的DNA序列經(jīng)過拼接，獲得PCV-2全基因組序列，大小為1 767 bp。經(jīng)分析該序列堿基構(gòu)成為：A為25.58% (452 nt)，G為28.13% (497 nt)，T為25.75% (455 nt)，C為20.54% (363 nt)，A+T為51.33%，G+C為48.67%。將該序列與國內(nèi)各型PCV-2代表株同源性比對分析(圖3)。結(jié)果顯示，該病毒基因組與國內(nèi)各株病毒同源性較高，均在90%以上，尤其與廣西分離株(AY556475)核苷酸同源性高達(dá)100%。

2.4遺傳進(jìn)化分析

基于PCV-2 全基因組序列，采用MEGA 4軟件中的鄰接法，將分離病毒與國內(nèi)各型PCV-2代表序列共20株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCV-2呈現(xiàn)一定的變異，在我國流行的PCV-2主要分為PCV-2a、PCV-2b、PCV-2c、PCV-2d、PCV-2e共5個(gè)基因型，其中PCV-2 CQ1株與浙江株(EU257511)、黑龍江株(HM038032)聚類到一起，形成一個(gè)進(jìn)化分支。這表明本病毒與聚類單元的病毒進(jìn)化關(guān)系最近，同屬于PCV-2b型。

圖3　國內(nèi)各PCV-2代表株同源性比對

圖4　PCV-2 CQ1分離株與參考毒株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5PCV-2 CQ1株衣殼蛋白氨基酸序列變異分析

將本病毒ORF2編碼的氨基酸序列與可導(dǎo)致明顯PMWS病變的強(qiáng)毒株(virulent)PCV-2- 40489 (AF264042)[8]和無PMWS癥狀豬中分離的弱毒株(attenuate) PCV-2-4838 (ABD59 348)[9]衣殼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(圖 5)。本分離株與強(qiáng)毒株的同源性為92.70%，與弱毒株的同源性為91.85%。PCV-2 CQ1分離株的衣殼蛋白75位天冬酰胺(N)、 76位異亮氨酸(I)、 131位異亮氨酸(I)、134位蘇氨酸(T)、206位異亮氨酸(I)與強(qiáng)毒株相同，與弱毒株不同；而59位精氨酸(R)、185位亮氨酸(L)、232位天冬酰胺(N)氨基酸與弱毒株相同，與強(qiáng)毒株不同。

此外，30位由纈氨酸(V)突變?yōu)榱涟彼?L)，57位由纈氨酸(V)突變?yōu)楫惲涟彼?I)，63為突變?yōu)橘嚢彼?K)，77位由天冬氨酸(D)突變?yōu)樘於０?N)，80位由纈氨酸(V)突變?yōu)榱涟彼?L)，86位由蘇氨酸(T)突變?yōu)榻z氨酸(S)，88位由賴氨酸(K)突變?yōu)楦彼?P)、89位由異亮氨酸(I)突變?yōu)榫彼?R)、91位由異亮氨酸(I)突變?yōu)槔i氨酸(V)，121位由蘇氨酸(T)突變?yōu)榻z氨酸(S)，151由脯氨酸(P)突變?yōu)樘K氨酸(T)，191由精氨酸(R)突變?yōu)楦拾彼?G)，210由天冬氨酸(D)突變?yōu)楣劝彼?E)。

下劃線部分為預(yù)測的免疫反應(yīng)區(qū)域，方框內(nèi)為發(fā)生突變的氨基酸，橢圓內(nèi)為PCV-2 CQ1株衣殼蛋白氨基酸與強(qiáng)毒株或弱毒株不同的區(qū)域

The immune reaction regions of the PCV-2 Cap were the underlined parts,the mutated amino acids were showed in the box parts,the different regions of the Cap between the PCV-2 CQ1 strain and virulent strains or attenuated strains were in the elliptic circles

圖5PCV-2 CQ1分離株與PCV-2強(qiáng)毒株或弱毒株衣殼蛋白氨基酸序列的比對

Fig.5The amino acid sequence alignment of capsid proteins between PCV-2 CQ1 strain and PCV-2 virulent strains or attenuated strains

3　討論

本研究從重慶某豬場的疑似PMWS病豬中分離鑒定了1株P(guān)CV-2，該病毒基因組序列與國內(nèi)的分離株同源性較高(超過90%)，尤其與廣西分離株(AY556475)的同源性達(dá)到100%。暗示該毒株可能來源于同一地區(qū)，并可能已經(jīng)在重慶和廣西兩地間相互傳播。近些年來，隨著國內(nèi)省市之間商業(yè)往來密切，生豬交易事件頻繁。因此，迫切需要加強(qiáng)對兩地生豬交易的監(jiān)管，密切注意PCV-2的流行及其的變異，加強(qiáng)和完善對豬圓環(huán)病毒感染的防控，以便及時(shí)地減小經(jīng)濟(jì)損失。

PCV-2 CQ1株全基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，本分離株屬于PCV-2b基因型[10]；而根據(jù)已有的資料顯示，PCV-2b型病毒相比其他型毒株的毒力較強(qiáng)[11]；由此推斷本分離株應(yīng)歸類于強(qiáng)毒株。

此外，由于PCV-2 ORF2編碼衣殼蛋白是PCV-2的主要結(jié)構(gòu)蛋白，為PCV-2主要的靶抗原，具有較強(qiáng)免疫原性。衣殼蛋白與病毒的致病性、組織噬性以及體外的增殖能力密切相關(guān)[12]。PCV-2衣殼蛋白是最易發(fā)生變異的區(qū)域，常導(dǎo)致病毒致病性的改變。PCV-2衣殼蛋白含3個(gè)主要的突變區(qū)域(59-80，121-136和180-191)和2個(gè)主要的免疫反應(yīng)區(qū)域(65-87, 113-147)[12]。比較分析顯示PCV-2 CQ1衣殼蛋白發(fā)生一定程度變異即多個(gè)氨基酸發(fā)生突變，其中有2個(gè)位于免疫反應(yīng)區(qū)域內(nèi)，這種變異是否引起免疫原性的改變，有待進(jìn)一步研究。由于分離毒株與強(qiáng)毒株的同源性(92.70%)高于弱毒株同源性(91.85%)，加上該病毒株源自明顯PMWS臨床癥狀的仔豬。因此，可進(jìn)一步確認(rèn)該分離株屬于強(qiáng)毒株。但是，為了證明該毒株的致病性，還需要進(jìn)行動物攻毒試驗(yàn)。

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Isolation,Identification and Genome Sequence Analysis of PCV-2b

LI Chao2, LI Da-jun1,3,ZHENG Hua1,3,ZHANG Yi-fan1,3,ZENG Ren-quan2,YANG Liu1,3

( 1.ChongqingAcademyofAnimalSciences,Rongchang,Chongqing,402460,China;2.RongchangCampusofSouthwestUniversity,Rongchang,Chongqing,402460,China;3.KeyLaboratoryofPigIndustrySciences,MinistryofAgriculture,Rongchang,Chongqing,402460,China)

The purpose of the study was to isolate and identify a PCV-2 prevalent strain in a farm of Chongqing.The virological examination of PCV-2 was carried out from the lymph nodes of piglets with postweanig multisystemic wasting syndrome,PCV-2 in positive samples were propagated and amplified by PK-15,its genome was obtained by cloning,sequencing,sequence-linking.And the whole genome sequence was further analyzed by bioinformatics.The results showed that a PCV-2 strain including 1 767 bp length was isolated (named PCV-2 CQ1).The homology analysis revealed that the similarity between CQ1 strain and domestic

trains was more than 90%.In particular,our isolated strain has 100% similarity to that of Guangxi isolate.Phylogenetic analysis showed this isolate(PCV-2 CQ1),Zhejiang strain(EU257511)and Heilongjiang strain(HM038032)were clustered together,formed a same clade and belonged to PCV-2b.According to the alignment of the amino acid sequence of Cap from the virulent and attenuated strains,the PCV-2 CQ1 has more similarity to the virulent strain.It is presumed that the strain is a virulent strain.

PCV-2;isolation and identification;sequence analysis

2016-03-08

重慶市前沿與應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2014jcyjA80027)；重慶市基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(15439)

李超(1990-)，男，四川資陽人，碩士，主要從事動物疾病診斷檢測技術(shù)研究。*通訊作者

S852.659.2

A

1007-5038(2016)10-0001-05