張升波，陳紹品，溫貴蘭，伍昌華，李天珍，李　晨，王開功，文　明，龔新勇

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室，貴州貴陽 550025)

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豬繁殖與呼吸綜合征病毒分離株E11105 N基因的序列分析與原核表達(dá)

張升波，陳紹品，溫貴蘭*，伍昌華，李天珍，李晨，王開功，文明，龔新勇

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室，貴州貴陽 550025)

為研究PRRSV N蛋白的結(jié)構(gòu)、功能以及N蛋白在病毒致病中的作用，以臨床分離PRRSV毒株E11105為研究對象，采用Primer Premier 5.0設(shè)計一對特異性引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出N基因片段，利用相關(guān)分子生物學(xué)軟件對N基因序列進(jìn)行分析；將N基因克隆連接到pCold Ⅰ原核表達(dá)載體上，經(jīng)PCR、雙酶切鑒定及序列測定后，得到重組質(zhì)粒pCold Ⅰ-N，將pCold Ⅰ-N轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后用SDS-PAGE蛋白電泳及Western blot驗證分析。結(jié)果顯示，分離株E11105 N基因與北美洲型代表株VR-2332、歐洲型代表株Lelystad virus(LV)、中國2006年暴發(fā)的高致病性PRRSV代表株JXA1、中國代表株CH-1a的核苷酸序列同源性分別為93.3%、34.7%、99.2%、95.4%，氨基酸序列同源性分別為94.4%、15.3%、94.4%、99.2%；系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,E11105株N基因與美洲型代表株VR-2332、中國高致病性JXA1毒株的親緣關(guān)系較近；分離株E11105 N基因所編碼蛋白不存在跨膜區(qū)；二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，分別占20.33%和63.41%；預(yù)測該蛋白可能存在5個較為明顯的B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位。SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果表明，重組N蛋白主要存在于菌體沉淀中，分子質(zhì)量約為16.7 ku；Western blot結(jié)果顯示，帶His標(biāo)簽的重組表達(dá)蛋白能被His單克隆抗體識別，顯色后條帶約為16.7 ku，與SDS-PAGE蛋白電泳的條帶大小一致。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；N基因擴(kuò)增；序列分析；原核表達(dá)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)也稱豬藍(lán)耳病，是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種傳染病[1]。PRRSV既可水平傳播，也可通過胎盤感染胎兒，仔豬及成年豬被PRRSV感染后多表現(xiàn)為呼吸困難、肺炎、生長速度減慢，并可能出現(xiàn)其他病毒或細(xì)菌的繼發(fā)性感染[2-3]。目前將PRRSV分為2個基因型，即歐洲型(代表株為LV株)和美洲型(代表株為VR-2332株)[4]。PRRSV是單股正鏈RNA病毒，其基因組包含至少9個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，其中ORF1a和ORF1b約占整個基因組全長的2/3，編碼14個非結(jié)構(gòu)蛋白，其余基因編碼8個病毒結(jié)構(gòu)蛋白[5-6]。核衣殼蛋白N是PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白之一，由ORF7基因編碼，為堿性蛋白，N蛋白含有5個～7個抗原決定簇，具有良好的抗原性，是功能最為復(fù)雜的蛋白[7-8]。本研究以臨床分離的PRRSV毒株E11105為材料，應(yīng)用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了攜帶E11105毒株N基因的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pCold Ⅰ-N并對其N基因進(jìn)行序列分析，首次對E11105毒株N基因編碼蛋白進(jìn)行預(yù)測分析并實現(xiàn)了E11105毒株N蛋白在大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。本研究結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步研究E11105毒株N蛋白的結(jié)構(gòu)、功能以及PRRSV N蛋白在病毒致病中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1生物材料豬繁殖與呼吸綜合征病毒分離毒株E11105，浙江大學(xué)方維煥教授惠贈(浙江分離株)；pCold Ⅰ質(zhì)粒，上海獸醫(yī)研究所馬永志教授惠贈；大腸埃希菌BL21(DE3)、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、Marc145細(xì)胞，貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室保存。

1.1.2所用試劑RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、dNTP，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；RNasin○R核酸酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV，普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Oligo(dT)15 Primer，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；Primer STAR HS DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ、連接酶Solution Ⅰ、質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、Marker DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；His-tag抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒，碧云天生物公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中已公布的豬繁殖與呼吸綜合征病毒全基因序列進(jìn)行分析(GenBank登錄號：EF112445)，采用Primer Premier 5.0設(shè)計1對引物，引物序列為N-EcoRⅠ-pCold Ⅰ-F：CGGAATTCATGCCAAATAACAACGGC；N-XbaⅠ-pCold Ⅰ-R：GCTCTAGACTATGCTGAG GGTGATGCTG，下劃線處分別為EcoRⅠ、XbaⅠ酶切位點，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為372 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2病毒RNA的提取與RT-PCR擴(kuò)增取成功轉(zhuǎn)染E11105毒株的Marc145細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒操作方法提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：RNA溶液8 μL，Oligo(dT)152 μL，70 ℃的水浴作用5 min后，取出置于冰上，再加入 5×M-MLV buffer 6 μL，RNasin 1 μL，dNTP 2 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，補H2O至20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 1 h，75 ℃ 15 min。用反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為： 5×GC buffer 4 μL，dNTP Mix 2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，PrimerStar 0.5 μL，cDNA 2 μL，補H2O至20μL。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s；50 ℃ 5 s；72 ℃ 1 min，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.3原核表達(dá)載體pCold Ⅰ-N的構(gòu)建及雙酶切鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，參照膠回收純化試劑盒操作方法純化回收PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pCold Ⅰ分別用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，用Solution Ⅰ連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，置于37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h～24 h，挑單個菌落于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取菌液按照1.2.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測。菌液PCR鑒定出陽性重組質(zhì)粒后，用質(zhì)粒提取試劑盒操作方法提取質(zhì)粒，并用EcoRⅠ、XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，鑒定目的片段與質(zhì)粒是否成功連接，將初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送廣州立菲生物公司測序。

1.2.4N基因序列比對分析及生物信息學(xué)分析使用DNA Star7.1生物學(xué)軟件,根據(jù)獲得的N基因序列片段推導(dǎo)其氨基酸序列，對GenBank已發(fā)表的15株P(guān)RRSV N基因序列進(jìn)行比對和分析，參考毒株信息[9-10]見表1，并運用MegAlign軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹；采用SOPMA在線服務(wù)器(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred-sopma.pl)預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；采用TMHMM Server V.2.0在線服務(wù)器(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)；采用DNA Star7.1軟件中Protein程序預(yù)測B細(xì)胞表位參數(shù)。

1.2.5重組N蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE分析 將重組菌按1∶100的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD 600 nm≈0.6，加入IPTG(終濃度為1.0 mmol/L)，于18 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，取誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，離心取沉淀，用PBS懸浮于冰上超聲破碎處理，超聲后的菌體經(jīng)離心后，分別收集上清和菌體，菌體重新加入PBS懸浮，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min～10 min。其他對照組也用同樣方法處理，用150 mL/L的SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)結(jié)果。

1.2.6Western blot分析 蛋白樣品經(jīng)150 mL/L SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用50 g/L脫脂乳PBST(含0.5 mL/L Tween-20)37 ℃封閉1 h，加入His-tag抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗5次，每次8 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶1 000稀釋)，37 ℃搖床孵育1 h；TBST洗膜5次，每次5 min；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)-H2O2避光顯色30 min，去離子水終止反應(yīng)，分析結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1N基因的擴(kuò)增

利用提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增出約372 bp的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期條帶一致。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1,2.N基因的PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000;1,2.PCR products of N gene

圖1N基因的RT-PCR結(jié)果

Fig.1RT-PCR results of N gene

2.2重組表達(dá)載體pCold Ⅰ-N酶切鑒定

提取經(jīng)菌液PCR鑒定陽性菌液的質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示酶切產(chǎn)物呈現(xiàn)兩個條帶(圖2)，一條為目的條帶，大小為372 bp；另一條為質(zhì)粒條帶，大小為4 407 bp。結(jié)果表明目的片段已成功插入質(zhì)粒。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1,2.重組質(zhì)粒pCold Ⅰ-N酶切產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000;1,2.Products of recombinant plasmid pCold Ⅰ-N by enzyme digestion

圖2重組質(zhì)粒pCold Ⅰ-N的酶切鑒定結(jié)果

Fig.2Enzyme digestion results of recombinant plasmid pCold Ⅰ-N

2.3N基因序列測定結(jié)果與分析

將陽性重組質(zhì)粒送廣州立菲生物公司測序。獲得E11105毒株N基因的核苷酸系列，長度為372 bp，編碼123個氨基酸(圖3)。

圖3　E11105株N基因測序結(jié)果

2.3.1N基因同源性比對分析將本次重組得到的N基因序列和推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中公布的PRRSV N基因和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果顯示，分離株E11105 N基因與北美洲型代表株VR-2332(PRU87392)核苷酸序列同源性為93.3%，氨基酸序列同源性為94.4%；而與歐洲型代表株Lelystad virus(M96262)核苷酸序列同源性為34.7%，氨基酸序列同源性僅為15.3%；與中國2006年暴發(fā)的高致病性PRRSV代表株JXA1(EF112445)核苷酸序列同源性高達(dá)99.2%，氨基酸序列同源性為94.4%；與中國代表株CH-1a(AY032626)核苷酸序列同源性為95.4%，氨基酸序列同源性高達(dá)99.2%(圖4和圖5)。

2.3.2N基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析將分離株E11105與GenBank公布的不同毒株N基因的核苷酸序列采用MegAlign軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖6可知，以歐洲型代表株Lelystad virus(M96262)與美洲型代表株VR-2332(PRU87392)在進(jìn)化樹上分為兩個大支，分離株E11105與美洲型代表株VR-2332(PRU87392)屬于同一分支，與中國暴發(fā)的高致病性JXA1處于同一小分支，說明本研究毒株E11105與中國的高致病性PRRSV親緣關(guān)系接近。

圖4　E11105株N基因核苷酸序列同源性比較

圖5　E11105株N基因編碼的氨基酸序列同源性比較

圖6　E11105株N基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4N基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.4.1N基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測采用TMHMM Server V.2.0在線服務(wù)器對N基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測和分析(圖7)。結(jié)果顯示，E11105株N基因編碼蛋白不具有跨膜區(qū)。

2.4.2N基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 在線服務(wù)器預(yù)測N基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)(圖8)。由圖可知，E11105株N基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無規(guī)則卷曲，所占比例分別為20.33%、4.07%、12.19%和63.41%(表2)。整個結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲與α-螺旋區(qū)域出現(xiàn)較多，而此序列中β-轉(zhuǎn)角和β-折疊所占比例相對較少。

2.4.3N基因編碼蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測 采用DNA Star的Protein軟件，綜合分析預(yù)測N基因編碼蛋白B細(xì)胞表位各參數(shù)。Kyte-Doolittle法分析親水性，Karplus-Schulz法分析柔韌性，Jameson-Wolf法分析抗原指數(shù)，Emini法分析氨基酸表面可及性，以高于閾值的氨基酸殘基作為候選參考區(qū)域。1-75位氨基酸區(qū)域有良好的親水性，抗原性和表面可及性都較高，氨基酸柔性區(qū)域分布不均勻，但相對集中。75-123位氨基酸區(qū)域親水性和表面可及性參數(shù)較小，58-123位氨基酸區(qū)域氨基酸柔性區(qū)域分布較均勻，92-102位氨基酸區(qū)域抗原性較高(圖9)，表明N基因編碼蛋白N端肽段各參數(shù)優(yōu)勢相對明顯。根據(jù)對E11105株N基因編碼蛋白的B細(xì)胞抗原表位的親水性、抗原指數(shù)、柔韌性、氨基酸的表面可及性綜合分析，各肽段的優(yōu)勢抗原表位(表3)，預(yù)測N蛋白可能存在5個B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位，綜合各參數(shù)預(yù)測N蛋白可能存在5個優(yōu)勢表位(aa)，分別為5-15、17-19、32-53、59-62、68-71位氨基酸。

2.5重組表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果

取超聲的誘導(dǎo)菌液上清、未誘導(dǎo)的菌液、超聲的誘導(dǎo)沉淀菌體、未超聲誘導(dǎo)的菌液，用150 mL/L SDS-PAGE電泳成像(圖10)，對結(jié)果進(jìn)行分析。由圖10可知，在蛋白分子質(zhì)量15 ku～20 ku之間出現(xiàn)一條大小約為16.7 ku的特異性蛋白條帶，與預(yù)期的蛋白大小一致且主要存在于菌體沉淀中，對照樣品則未見明顯表達(dá)。

圖7　N基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

圖8　N基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

二級結(jié)構(gòu)名Nameofsecondarystructureα-螺旋/%Alphahelixβ-轉(zhuǎn)角/%Betaturnβ-折疊/%Betaextendedstrand無規(guī)則卷曲/%IrregularcoilPRRSV-E11105-N20.33(25/123)4.07(5/123)12.1(15/123)63.41(78/123)

圖9　N基因編碼蛋白B細(xì)胞表位參數(shù)預(yù)測

預(yù)測參數(shù)Predictionparameters預(yù)測結(jié)果Predictionresults親水性Hydrophlicity1-21,30-74,81-85,95-99,105-107,109-113柔韌性Flexibility5-20,32-53,59-62,68-73,77-81,83-88,93-98,107-109,119-121抗原指數(shù)Antigenicindex1-19,31-54,58-74,84-88,92-100,106-108,113-116,118-123表面可及性Surfaceprobabilityplots1-19,32-54,58-63,66-71,107-110,122-123合計Total5-15,17-19,32-53,59-62,68-71

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～3.超聲的誘導(dǎo)菌液上清；4.未誘導(dǎo)的菌液；5～7.超聲的誘導(dǎo)沉淀菌體；8.未超聲的誘導(dǎo)菌液

M.Protein molecular weight Marker;1-3.The supernatants of ultrasound bacteria induced by IPTG；4.Bacteria without induction by IPTG；5-7.The precipitates of ultrasound bacteria induced by IPTG；8.Induced bacteria without ultrasound

圖10重組N蛋白的SDS-PAGE鑒定

Fig.10SDS-PAGE identification of recombinant N protein

2.6Western blot檢測結(jié)果

重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF轉(zhuǎn)移膜上，進(jìn)行Western blot分析(圖11)。由圖11可見,PVDF膜出現(xiàn)了與目的蛋白理論值大小一致的條帶，約16.7 ku。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～3.重組蛋白pCold Ⅰ-N；4.空載體pCold Ⅰ

M.Protein molecular weight Marker;1-3.Recombinant protein pCold Ⅰ-N；4.Empty vector pCold Ⅰ

圖11重組N蛋白的Western blot分析

Fig.11Western blot analysis of recombinant N protein

3　討論

盡管全世界有眾多關(guān)于PRRSV的研究，但迄今為止PRRS的防控仍然不理想。PRRSV含有多個基因，編碼核衣殼蛋白的ORF7基因非常保守，可作為PCR檢測的靶基因[11]。ORF7基因編碼的核衣殼蛋白N為高保守性的非糖基化核衣殼蛋白，該蛋白在病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)豐富，是病毒粒子中含量最高的蛋白，約占病毒蛋白總量的20%～40%[12]。N蛋白是免疫原性最強的蛋白，能刺激機(jī)體產(chǎn)生強烈的免疫應(yīng)答[13-14]，豬感染PRRSV后,7 d即可檢測抗N蛋白抗體，并且針對N蛋白的抗體在體內(nèi)存活時間較長，以N蛋白作為檢測抗原具有較高的敏感性和特異性，是臨床診斷與檢測方法中的首選[15]。

本研究把從臨床分離的毒株E11105 N基因克隆連接到pCold Ⅰ原核表達(dá)載體上，并對N基因序列進(jìn)行了分析。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，分離株E11105與VR-2332、JXA1、CH-1a的N基因核苷酸序列、推導(dǎo)氨基酸序列同源性極高，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示E11105株N基因與VR-2332、JXA1毒株的親緣關(guān)系較近，屬于同一遺傳進(jìn)化分支，可以推測E11105分離株接近與美洲型PRRSV；分離株E11105 N基因所編碼蛋白不存在跨膜區(qū)；二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，分別占20.33%和63.41%；預(yù)測該蛋白可能存在5個較為明顯的B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位，這與張松林等[16]報道相似，但氨基酸區(qū)域有一定的差異，這可能是由于不同毒株變異引起的，有待進(jìn)一步研究。

本研究利用pCold Ⅰ-N重組質(zhì)粒高效表達(dá)出的重組蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽，可以利用親和層析技術(shù)純化蛋白，為今后制備標(biāo)準(zhǔn)化的抗原打下基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究E11105毒株N蛋白的結(jié)構(gòu)、功能以及PRRSV N蛋白在病毒致病中的作用具有重要意義。

[1]馬蘇,李玉峰,段舒怡,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性分析[J].畜牧與獸醫(yī),2007,39(4):1-3.

[2]Collins J E,Benfield D A,Christianson W T,et al.Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2322) in North America and experiment reproduction of the disease in gnotobiotic pigs[J].J Vet Diagn Invest,1992,4(2):117-126.

[3]Salguero F J,Frossard J P,Rebel J M J,et al.Host-pathogen interactions during porcine reproductive and respiratory syndrome virus 1 infection of piglets[J].Virus Res,2015,202:135-143.

[4]Murtaugh M P,Elam M R,Kakach L T.Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus[J].Arch Virol,1995,140:1451-1460.

[5]李成,李六金,谷守林,等.豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒形態(tài)學(xué)特征[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2001,32(6):563-567.

[6]高志強,郭鑫,楊漢春,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒缺失變異株的基因組特征[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2005,36(6):575-584.

[7]Shen S,Wang K,Liu W, et al. Determination of the complete nucleotides sequence of a vaccine strain of PRRSV and identification of the NSP2 gene with a unique msertion[J].Arch Virol, 2000(145): 871-883.

[8]Loemba H D,Mounir S,Mardasi H,et al.Kinetics of humoral immune response to the major structural proteins of the porcine reproductive and respiretory syndrome virus[J].Arch Virol,1996,141:751-761.

[9]王文成,邊少國,舒秀偉,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒國內(nèi)分離經(jīng)典毒株與變異株的全基因組序列分析[J].畜牧與獸醫(yī),2008,40(7):34-37.

[10]劉永宏,趙麗,劉俊峰,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒BJSD株和BJPG株序列分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(12):111-118.

[11]單晶晶,陳天慧,于紅欣,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒熒光定量PCR檢測方法的建立[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報,2016,31(1)：60-63.

[12]Rowland R R,Steffen M,Ackerman T,et al.The evolution of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: quasispecies and emergence of a virus subpopulation during infection of pigs with VR-2332[J].Virology,1999,259(2):262-266.

[13]廖立珊,曾少靈,孫潔,等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒N基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,35(9):25-28.

[14]劉建奎,魏春華,戴愛玲,等.福建地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征ORF7基因遺傳變異分析[J].中國獸醫(yī)雜志,2015(10):17-19.

[15]王鳳雪,劉瑩,楊勇,等.高致病性PRRSVJL-04/12株核衣殼蛋白的表達(dá)與抗原性分析[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(10):60-64.

[16]張松林,沈志強,劉磊,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2012,43(11):1683-1696.

?毒株信息 Table 1The information of

序號№毒株名稱StrainnameGenBank登錄號GenBankaccessionnumber分離地區(qū)Isolatedregion1Lelystadvirus(LV)M96262荷蘭Netherlands2VR2332PRU87392美國American3CH-1aAY032626國China4JXA1EF112445中國China5LV4.2.1AY588319歐洲Europe6RespPRRSMLVAF066183美國American7LNEU109502中國China8WUH2EU678352中國China9BJ-4AF331831中國China10SY0608EU144079中國China11GDEU109503中國China12HN-HWFJ797690中國China13HUB2EF112446中國China14JA142AY424271中國China15F1AF030306中國臺灣TaiwanChina

Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of N Gene of PRRSV E11105 Strain

ZHANG Sheng-bo,CHEN Shao-pin,WEN Gui-lan,WU Chang-hua,LI Tian-zhen,LI Chen,WANG Kai-gong,WEN Ming,GONG Xin-yong

(LaboratoryofPreventiveVeterinaryMedicine,CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou,550025,China)

In order to study the N protein structure,function of PRRSV and its role in the viral pathogenesis,we took the isolated PRRSV strain E11105 as the research object and designed a pair of primers by Primer Premier 5.0.Then we amplified N gene by RT-PCR and analyzed N gene sequences by molecular biology related software.We constructed a recombinant vector pCold Ⅰ-N.The recombinant plasmid pCold Ⅰ-N was confirmed by PCR,double enzyme digestion and sequencing,and was transfected intoEscherichiacoliBL21(DE3) competent cells.N protein induced by IPTG was detected and analyzed by SDS-PAGE and Western blot.The results showed that the N gene nucleotide sequence similarities of the isolated E11105 with North American type strain VR-2332,the European type strain Lelystad virus (LV),highly pathogenic PRRSV strain JXA1 in 2006 in China and Chinese strain CH-1a are respectively 93.3%,34.7%,99.2% and 95.4%,and the amino acid sequence similarities are respectively 94.4%,15.3%,94.4%,99.2%.Phylogenetic tree showed that the N gene of E11105 strain and the American type VR-2332,the highly pathogenic JXA1 strain are closely related.There were no transmembrane domains for N gene encoding protein of E11105.The secondary structure is mainly dominated by alpha helix and irregular coil,which account for 20.33% and 63.41%,and the N protein was predicted that might have five B cell dominant epitopes.SDS-PAGE showed that recombinant N protein has a 16.7 ku molecular weight and mainly distributes in the cell precipitate.Western blot results showed that the recombinan N protein has an immune response with His antibody,and the band is about 16.7 ku,which is coincident with the result that analyzed by SDS-PAGE.

PRRSV; N gene amplification; sequence analysis; prokaryotic expression

2016-03-17

國家自然科學(xué)基金項目(31460668)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目(黔科合J字[2015]2046號)；貴州大學(xué)大學(xué)生“SRT”計劃項目(貴大SRT(2014)121號)；貴州大學(xué)“本科教學(xué)工程”項目(JKSP2013004)

張升波(1992-)，男(苗族)，貴州務(wù)川人，動物醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.6；Q789

A

1007-5038(2016)10-0041-07