王春燕，陳國(guó)華，何小兵，曾　爽，賈懷杰，房永祥，馮　園，李守杰，景志忠

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046)

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豬瘟病毒C株特異的TCR Vα5和Vβ6真核表達(dá)載體的構(gòu)建及共轉(zhuǎn)染研究

王春燕，陳國(guó)華，何小兵，曾爽，賈懷杰，房永祥，馮園，李守杰，景志忠*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046)

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒C株特異的TCR Vα5和TCR Vβ6基因家族，為進(jìn)一步研究其體外表達(dá)情況，應(yīng)用RT-PCR從豬外周血單個(gè)核細(xì)胞中擴(kuò)增其全長(zhǎng)基因序列，并構(gòu)建TCR Vα5-pIRES2-EGFP和TCR Vβ6-pIRES2-EGFP重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。結(jié)果顯示，TCR Vα5和TCR Vβ6全長(zhǎng)基因分別為816 bp和945 bp，雙酶切和核酸序列測(cè)定證實(shí)TCR Vα5-pIRES2-EGFP和TCR Vβ6-pIRES2-EGFP重組質(zhì)粒構(gòu)建正確；轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后熒光顯微鏡下可以看到70%以上的細(xì)胞表達(dá)EGFP蛋白。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR可檢測(cè)到TCR Vα5和TCR Vβ6基因的表達(dá)，單獨(dú)轉(zhuǎn)染組和共同轉(zhuǎn)染組Western blot均可檢測(cè)到EGFP蛋白的表達(dá)，且蛋白雜交帶強(qiáng)度相似。研究結(jié)果表明，CSFV-C株特異性的TCR Vα5-pIRES2-EGFP和TCR Vβ6-pIRES2-EGFP真核表達(dá)質(zhì)?？赏瑫r(shí)轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)體外共表達(dá)。

豬瘟病毒C株；TCR Vα/Vβ基因；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；增強(qiáng)綠色熒光蛋白

豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重的一種高度接觸性傳染病[1]，以豬的高熱稽留、白細(xì)胞減少、出血梗死和高病死率為特征，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，其大范圍的暴發(fā)給我國(guó)和世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。

豬瘟病毒兔化弱毒疫苗(CSFV-C株弱毒苗，簡(jiǎn)稱C株苗)在包括中國(guó)在內(nèi)的全球豬瘟免疫預(yù)防中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其免疫效果得到了世界的認(rèn)可，但其產(chǎn)生有效保護(hù)力的免疫學(xué)機(jī)制還不完全清楚。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，C株弱毒苗免疫后既可產(chǎn)生中和抗體，又可誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。免疫接種后7 d甚至更早便可以抵抗強(qiáng)毒攻擊[5-7]，但2周～3周才可檢測(cè)到中和抗體[8]，免疫接種后9 d能檢測(cè)到誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生的病毒特異的T細(xì)胞，且這些特異的T細(xì)胞在體外具有直接的裂解靶細(xì)胞的效應(yīng)[9]。這說明豬瘟病毒C株弱毒苗在中和抗體出現(xiàn)之前即可產(chǎn)生免疫保護(hù)力，推測(cè)細(xì)胞免疫應(yīng)答在豬瘟病毒的早期免疫保護(hù)中可能扮演著重要角色[8,10]。因此,探究C株弱毒苗產(chǎn)生快速保護(hù)力的免疫學(xué)效應(yīng)機(jī)制將有助于新一代高效疫苗的研發(fā)。

T細(xì)胞免疫是機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要組成部分，其中αβ T細(xì)胞是獲得性免疫最關(guān)鍵的細(xì)胞，其表面的標(biāo)志性異源二聚體,即αβ TCR是與抗原遞呈細(xì)胞(APC)上的Ag-MHC分子識(shí)別、結(jié)合以及被激活的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，決定著T細(xì)胞免疫識(shí)別、免疫應(yīng)答的多樣性和特異性，其中TCR α、β鏈的互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)共同決定了T細(xì)胞識(shí)別抗原的特異性[11]。在機(jī)體正常情況下，αβ TCR CDR3的長(zhǎng)度、序列組成呈高度多態(tài)性和多樣性，具有識(shí)別和結(jié)合各種各樣抗原表位肽的潛能，以應(yīng)對(duì)復(fù)雜的環(huán)境。然而，在病毒感染時(shí)，只有某種TCR發(fā)生反應(yīng)性重排，分化形成識(shí)別該病毒抗原特異性TCR的T細(xì)胞，并大量增殖，這種αβ TCR具有相同的或高度相似的CDR3序列和長(zhǎng)度，具有特異性識(shí)別同類抗原的能力[12]。因此，通過分析病毒抗原刺激T細(xì)胞的TCR基因的CDR3長(zhǎng)度和序列，就可以確定抗原特異的TCR，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒抗原特異的TCR基因至正常T細(xì)胞中，使其強(qiáng)制表達(dá)這種獨(dú)特型TCR，改變T細(xì)胞內(nèi)源性TCR識(shí)別抗原的原有模式，經(jīng)大量擴(kuò)增后，具備分泌細(xì)胞因子的能力或特異性殺傷靶細(xì)胞的功能，完成機(jī)體T細(xì)胞對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。目前在醫(yī)學(xué)上已有對(duì)腫瘤、細(xì)菌和病毒抗原特異性TCR基因的研究，以期應(yīng)用于免疫治療研究中[13-14]。然而，在獸醫(yī)學(xué)中，這方面的研究較少，尚未有公開的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，豬瘟病毒C株疫苗病毒感染能引起豬的某些TCR Vα和Vβ亞家族發(fā)生單克隆或寡克隆擴(kuò)增[15]。本研究將在此基礎(chǔ)上克隆其特異的Vα5和Vβ6亞家族的全長(zhǎng)αβ TCR，構(gòu)建CSFV-C株特異的TCR Vα5-pIRES2-EGFP和TCR Vβ6-pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體。由于293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高，常用作外源基因轉(zhuǎn)染的理想細(xì)胞，且其不表達(dá)TCR，不會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)配現(xiàn)象，因此我們將CSFV-C株特異的TCR Vα5-pIRES2-EGFP和TCR Vβ6-pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，從mRNA和蛋白水平檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄與表達(dá)情況，為進(jìn)一步在豬源T細(xì)胞上研究其免疫學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

Trizol,美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；PrimescriptTM 1st strand cDNA Synthesis kit、LATaq酶、T4 DNA連接酶，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DNA片段凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，Axygen公司產(chǎn)品；pGEM-T easy載體，Promega公司產(chǎn)品；感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；XholⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶、SYBRHT5SS〗○RPremix ExTaqTM Ⅱ試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；小鼠抗人GAPDH單抗、鼠抗人EGFP單抗、兔抗小鼠的IgG二抗，Sigma公司產(chǎn)品；LipofectamineHT5SS〗○R3000轉(zhuǎn)染試劑,美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；293T細(xì)胞、pIRES2-EGFP質(zhì)粒，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2方法

1.2.1CSFV-C株相關(guān)抗原特異TCR基因的全長(zhǎng)克隆在前期研究中，利用RT-PCR和基因掃描-譜型分析技術(shù)分析豬瘟病毒C株免疫后豬外周血單個(gè)核細(xì)胞19個(gè)Vα和20個(gè)Vβ亞家族的表達(dá)情況和T細(xì)胞的克隆性，發(fā)現(xiàn)了Vα5和Vβ6亞家族呈單/寡克隆性增殖趨勢(shì)，根據(jù)TCR Vα5和TCR Vβ6家族的部分已知序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增TCR Vα5亞家族基因全長(zhǎng)的引物，上游：5′-ATGAAGACATCCATTGGACCTT-3′，下游：5′-TCAGCTGGACCACAGCCG-3′；用于擴(kuò)增TCR Vβ6亞家族基因全長(zhǎng)的引物，上游：5′-ATGATCTCTGGTTTTCTCTGCTGG-3′，下游：5′-TCAGGCACCCTTTCTCTTGACCGT-3′ 。PCR總反應(yīng)體積為25 μL：滅菌去離子水17.45 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 μL，cDNA 2μL，上、下游引物(25 μmol/L)各0.4 μL，rTaq酶0.25 μL。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 50 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。利用凝膠DNA回收試劑盒回收TCR Vα5和TCR Vβ6擴(kuò)增的目的產(chǎn)物，與pGEM-T easy載體于16 ℃水浴連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，氨芐青霉素抗性篩選陽性菌落，經(jīng)PCR、酶切鑒定后，將陽性克隆送至北京金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.2全長(zhǎng)基因的序列測(cè)定及分析 利用DNA Star、Signal 4.0 Sever-prediction 軟件對(duì)測(cè)序正確的TCR Vα5和V β6全長(zhǎng)基因序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。

1.2.3真核表達(dá)載體引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增根據(jù)測(cè)序正確的TCR Vα5和TCR Vβ6亞家族的全長(zhǎng)基因序列，設(shè)計(jì)包括信號(hào)肽的表達(dá)引物并在其上、下游各加入酶切位點(diǎn)，TCR Vα5的引物，上游：5′-GC-CTCGAGGCCACCATGAAGACATCCATTGGA

CCTT-3′(下劃線為XholⅠ位點(diǎn))，下游：5′-CCGTCGACTCAGCTGGACCACAGCCG-3′(下劃線為SalⅠ位點(diǎn))；TCR Vβ6的引物，上游：5′-GC-CTCGAGGCCACCATGATCTCTGGTTTTCTCT

GCTGG-3′(下劃線為XholⅠ位點(diǎn))，下游：5′ -CCGTCGACTCAGGCACCCTTTCTCTTGACCGT-3′(下劃線為SalⅠ位點(diǎn))。PCR總反應(yīng)體積為25 μL：滅菌去離子水18.45 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 μL，TCR Vα5-pGEM-T easy和TCR Vβ6-pGEM-T easy載體質(zhì)粒1 μL為模板，帶有酶切位點(diǎn)的上、下游引物(25 μmol/L)各0.4 μL，rTaq酶0.25 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min;94 ℃ 50 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃5 min。

1.2.4真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將純化后的TCR Vα5和TCR Vβ6的PCR產(chǎn)物與pIRES2-EGFP載體質(zhì)粒分別用XholⅠ和SalⅠ雙酶切，純化回收，用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑選菌落培養(yǎng)擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后，將陽性克隆送北京金唯智生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為TCR Vα5-pIRES2-EGFP和TCR Vβ6-pIRES2-EGFP。

1.2.5脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法

1.2.5.1細(xì)胞培養(yǎng)將293T細(xì)胞以5×105個(gè)細(xì)胞接種于50 mL 25 cm2的培養(yǎng)瓶，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)80%瓶壁面積時(shí)收集細(xì)胞，以4×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至貼壁細(xì)胞達(dá)70% ～ 80%。

1.2.5.2轉(zhuǎn)染提取陽性質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒，紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度。試驗(yàn)共分5組：轉(zhuǎn)染TCR Vα5-pIRES2-EGFP 質(zhì)粒組(A組)，轉(zhuǎn)染TCR Vβ6-pIRES2-EGFP質(zhì)粒組(B組)，TCR Vα5-pIRES2-EGFP和TCR Vβ6-pIRES2-EGFP 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組(C組)，轉(zhuǎn)染空載體組(D組)，不加任何DNA的未轉(zhuǎn)染組(E組)，轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 3000 試劑說明書，在6孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.6TCR Vα5和TCR Vβ6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的表達(dá)與鑒定

1.2.6.1熒光顯微鏡觀察 利用熒光顯微鏡于轉(zhuǎn)染后24 h，觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的綠色熒光產(chǎn)生情況。

1.2.6.2RT-PCR和real-time PCR檢測(cè)TCR Vα5和TCR Vβ6基因在mRNA水平的表達(dá)轉(zhuǎn)染后48 h收集每個(gè)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞各2×106個(gè)，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用相應(yīng)的TCR Vα5和TCR Vβ6亞家族引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件同1.2.1。應(yīng)用SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒，SYBR Green熒光染料法檢測(cè)TCR Vα5和TCR Vβ6基因的表達(dá)情況，并以同比例稀釋的RNA作為內(nèi)對(duì)照。總反應(yīng)體積為20 μL，包括10 μL SYBR Premix ExTaqⅡ，6.0 μL 滅菌水，2.0 μL模板，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，0.4 μL ROX Rerference Dye Ⅱ。擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。使用MX3005P熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.6.3Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后EGFP蛋白的表達(dá)情況轉(zhuǎn)染后48 h裂解細(xì)胞提取總蛋白，同時(shí)以轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP空載體組的細(xì)胞蛋白作為陽性對(duì)照，以未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞蛋白作為陰性對(duì)照，以GAPDH蛋白為內(nèi)參檢測(cè)EGFP蛋白的表達(dá)。取15 μL蛋白樣品和5 μL 4×SDS-PAGE Loading buffer進(jìn)行120 g/L的SDS-PAGE電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)NC膜， 用小鼠抗人的GAPDH單抗和兔抗小鼠的IgG二抗進(jìn)行孵育，底物顯色檢測(cè)GAPDH蛋白(內(nèi)參照)的表達(dá)，以明確所提取蛋白的質(zhì)量；同時(shí)，用鼠抗人的EGFP單抗和兔抗鼠的IgG抗體進(jìn)行孵育，底物顯色檢測(cè)EGFP蛋白的表達(dá)，從而推測(cè)目的分子是否表達(dá)。

2　結(jié)果

2.1CSFV-C株抗原特異性豬αβ TCR全長(zhǎng)基因的克隆

利用設(shè)計(jì)的特異性引物，成功擴(kuò)增了CSFV-C株抗原特異性的TCR Vα5和TCR Vβ6亞家族全長(zhǎng)基因序列，長(zhǎng)度分別為800 bp和900 bp左右(圖1)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.TCR Vα5基因PCR產(chǎn)物;2.TCR Vβ6基因PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000;1.PCR product of TCR Vα5 gene;2.PCR products of TCR Vβ6 gene

圖1豬TCR Vα5和TCR Vβ6全長(zhǎng)基因的PCR擴(kuò)增

Fig.1PCR amplification of full-length TCR Vα5 and TCR Vβ6 genes

2.2豬αβ TCR全長(zhǎng)基因的序列分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

測(cè)序結(jié)果表明，克隆得到的豬TCR Vα5和Vβ6全長(zhǎng)基因分別為816 bp和945 bp，均含有完整的開放閱讀框(ORF)。采用ExPASy Proteomics Sever(http://expasy.org)中的Signal 4.0 Sever-prediction 軟件分析表明，其各自含21個(gè)和24個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽(圖2)。

2.3豬αβ TCR真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將構(gòu)建的TCR Vα5-pIRES2-EGFP和TCR Vβ6-pIRES2-EGFP重組表達(dá)質(zhì)粒，利用XholⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，可分別得到800 bp、900 bp的目的片段和5 000 bp的載體片段，表明成功地構(gòu)建了豬αβ TCR真核表達(dá)質(zhì)粒(圖3)。

2.4熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染24 h后，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察293T細(xì)胞的綠色熒光產(chǎn)生情況，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染空載體組(D組)和轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組(A、B、C組)均出現(xiàn)綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率約達(dá)70%。此外，單獨(dú)轉(zhuǎn)染組(A組和B組)與共同轉(zhuǎn)染組(C組)綠色熒光產(chǎn)生情況相似，表明二者的轉(zhuǎn)染效率相似；陰性對(duì)照組(E組)未見明顯的綠色熒光(圖4)。

2.5豬αβ TCR真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后mRNA水平的表達(dá)

RT-PCR 結(jié)果顯示，單獨(dú)轉(zhuǎn)染組(A和B組)分別可以擴(kuò)增到TCR Vα5和Vβ6的目的片段，共轉(zhuǎn)染組(C組)可同時(shí)擴(kuò)增到TCR Vα5和Vβ6基因片段，轉(zhuǎn)染空載體組和陰性對(duì)照組未檢測(cè)到TCR Vα5和Vβ6基因的表達(dá)，因此表明TCR Vα5和Vβ6在mRNA水平上能夠單獨(dú)或者共表達(dá)(圖5)。

圖2　豬TCR Vα5和Vβ6全長(zhǎng)基因編碼蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 8 000;1.陰性對(duì)照;2.TCR Vα5-pIRES2-EGFP質(zhì)粒;3.TCR Vα5-pIRES2-EGFP雙酶切產(chǎn)物;4.TCR Vα5 PCR產(chǎn)物;5.TCR Vβ6-pIRES2-EGFP質(zhì)粒;6.TCR Vβ6-pIRES2-EGFP雙酶切產(chǎn)物;7.TCR Vβ6 PCR 產(chǎn)物;8.pIRES2-EGFP質(zhì)粒;9.pIRES2-EGFP質(zhì)粒酶切

M.DNA Marker DL 8 000;1.Negative control;2.TCR Vα5-pIRES2-EGFP plasmid;3.Products of TCR Vα5-pIRES2-EGFP digested withXhol Ⅰ andSalⅠ;4.PCR product of TCR Vα5 gene;5.TCR Vβ6-pIRES2-EGFP plasmid;6.Products of TCR Vβ6-pIRES2-EGFP digested withXholⅠ andSalⅠ;7.PCR product TCR Vβ6 gene;8.pIRES2-EGFP plasmid;9.Products of pIRES2-EGFP digested withXholⅠ andSalⅠ

圖3TCR Vα5-pIRES2-EGFP和TCR Vβ6-pIRES2-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切及PCR鑒定

Fig.3Identification of TCR Vα5-pIRES2-EGFP and TCR Vβ6-pIRES2-EGFP plasmids by double enzyme digestion and PCR

A.陽性對(duì)照；B.重組質(zhì)粒；C.陰性對(duì)照

A.Positive control;B.Recombinant plasmid;C.Negative control

圖4熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的293 T細(xì)胞的綠色熒光產(chǎn)生情況(200×)

Fig.4Green fluorescence detection of 293T cells transfected with recombined plasmid(200×)

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1,4.轉(zhuǎn)染空載體組;2.轉(zhuǎn)染TCR Vα5-pIRES2-EGFP PCR 產(chǎn)物;3.TCR Vα5-IRES2- EGFP和TCR Vβ6-IRES2-EGFP共同轉(zhuǎn)染PCR產(chǎn)物;5.轉(zhuǎn)染TCR Vβ6-pIRES2-EGFP PCR產(chǎn)物;6.TCR Vα5-IRES2- EGFP和TCR Vβ6-IRES2-EGFP共同轉(zhuǎn)染PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000;1,4.Transfection with pIRES2-EGFP plasmid;2.PCR products of TCR Vα5 gene transfection with TCR Vα5-pIRES2-EGFP;3.PCR products of TCR Vα5 gene cotransfection with TCR Vα5-pIRES2-EGFP and TCR Vβ6-pIRES2-EGFP plasmids;5.PCR products of TCR Vβ6 gene transfection with TCR Vβ6-pIRES2-EGFP;6.PCR products of TCR Vβ6 gene cotransfection with TCR Vα5-pIRES2-EGFP and TCR Vβ6-pIRES2-EGFP plasmids

圖5RT-PCR分析重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況

Fig.5Analysis of the transcription in 293 T cells transfected with recombinant plasmids by RT-PCR

2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的目的分子的轉(zhuǎn)錄情況

轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒48 h后，通過real-time PCR對(duì)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞進(jìn)行外源TCR Vα5和TCR Vβ6基因mRNA水平表達(dá)的檢測(cè)。同時(shí)，我們以同比例稀釋的RNA為模板進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，以排除cDNA被質(zhì)粒DNA污染而影響結(jié)果判定，檢測(cè)結(jié)果為陽性，提示cDNA中的確存在質(zhì)粒DNA污染，但是以cDNA為模板的轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞外源TCR Vα5和TCR Vβ6擴(kuò)增的Ct值較同比例稀釋的RNA為模板擴(kuò)增的Ct值提前2個(gè)～3個(gè)且遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)染空載體組，表明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞中外源TCR基因在mRNA水平上進(jìn)行了表達(dá)(圖6)。

2.7豬αβ TCR真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后目的蛋白的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染48 h后，提取轉(zhuǎn)染空載體、重組質(zhì)粒和陰性對(duì)照組細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)NC膜，用小鼠抗人GAPDH單抗和兔抗鼠的IgG二抗雜交孵育后底物顯色表明，所有試驗(yàn)組均出現(xiàn)與GAPDH亞基分子質(zhì)量(36 ku)一致的雜交帶，這說明所提取的目的蛋白量良好(圖7)；同時(shí)，用鼠抗人的EGFP單抗和兔抗鼠的IgG二抗雜交孵育，底物顯色表明轉(zhuǎn)染空載體組、轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組均出現(xiàn)與EGFP蛋白分子質(zhì)量(27 ku)一致的條帶，說明轉(zhuǎn)染空載體組和轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組均表達(dá)了EGFP蛋白(圖7)。

3　討論

本實(shí)驗(yàn)室前期利用RT-PCR基因掃描分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)感染豬瘟病毒C株的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中具有TCR Vα5和Vβ6亞家族基因的單/寡趨勢(shì)的T細(xì)胞，該試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上擴(kuò)增出其全長(zhǎng)基因序列，其CDR3區(qū)各含保守的氨基酸基序“DDY”和“PAV”[15]，這種保守的基序可能與豬瘟病毒C株的抗原肽表位的識(shí)別和結(jié)合有關(guān)。

αβ TCR是一種異源二聚體，只有共同表達(dá)、定位在T細(xì)胞膜上，才能發(fā)揮T細(xì)胞抗原受體的作用。本試驗(yàn)構(gòu)建了TCR Vα5-pIRES2-EGFP和TCR Vβ6-pIRES2-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞觀察體外表達(dá)、定位情況，判斷其是否具有免疫學(xué)功能。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞均可看到綠色熒光，表明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后EGFP能夠有效表達(dá)，且單獨(dú)轉(zhuǎn)染組和共同轉(zhuǎn)染組的熒光情況產(chǎn)生情況相似，轉(zhuǎn)染效率無明顯差異，初步認(rèn)為TCR Vα5和Vβ6基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)水平基本相同，但是在共同轉(zhuǎn)染組中仍不能區(qū)分兩種重組質(zhì)粒的表達(dá)比例以及二者是否均得到了表達(dá)。因此，在后續(xù)的試驗(yàn)中可以采用不同的標(biāo)記基因來構(gòu)建真核表達(dá)載體，對(duì)兩種基因共表達(dá)時(shí)的水平進(jìn)行比較。其次，通過mRNA水平的比較發(fā)現(xiàn)，TCR Vα5和Vβ6基因均可以表達(dá)。由于目前沒有商品化的豬TCR單抗，在蛋白質(zhì)水平上我們只能通過Western blot檢測(cè)EGFP的表達(dá)來間接反映目的基因的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)除陰性對(duì)照組外，其他試驗(yàn)組均顯示與EGFP分子質(zhì)量大小一致的雜交條帶，這表明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞表達(dá)了EGFP。尹青松等[16]將彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)相關(guān)抗原特異的TCR Vα6和Vβ13分別連接入pIRES2-EGFP中，為解決αβ兩種基因轉(zhuǎn)入同一個(gè)真核表達(dá)載體后下游基因表達(dá)量低的問題，同時(shí)提高TCR Vβ基因的表達(dá)水平，其在mRNA和蛋白質(zhì)水平上對(duì)外源基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。但是與α、β兩種TCR鏈基因插入同一個(gè)真核表達(dá)載體相比，前者只有在α、β兩種TCR鏈重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入同一個(gè)T細(xì)胞后才可能形成功能性的αβ TCR異二聚體。

A.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞的cDNA為模板;B.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞的RNA為模板;C.轉(zhuǎn)染空載體的293T細(xì)胞的cDNA為模板

A.cDNA template of 293T cells transfected with recombinant plasmid;B.RNA template of 293T cells transfected with recombinant plasmid;C.cDNA template of 293T cells transfected with empty vector

圖6實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄

Fig.6Analysis of the transcription in 293 T cells transfected with recombinant plasmids by real-time PCR

1.陽性對(duì)照;2.轉(zhuǎn)染TCR Vα5-pIRES2-EGFP重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞;3.轉(zhuǎn)染TCR Vβ6-pIRES2-EGFP重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞;4.共轉(zhuǎn)染TCR Vα5-pIRES2-EGFP和TCR Vβ6-pIRES2-EGFP重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞;5.陰性對(duì)照

1.Positive control;2.293T cells transfected with TCR Vα5-pIRES2-EGFP recombinant plasmid;3.293T cells transfected with TCR Vβ6-pIRES2-EGFP recombinant plasmid;4.293 T cells transfected with TCR Vα5-pIRES2-EGFP and TCR Vβ6-pIRES2-EGFP recombinant plasmids;5.Negative control

圖7Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞中EGFP的表達(dá)

Fig.7EGFP expression in 293T cells transfected with recombinant plasmid detected by Western blot

總之，本研究構(gòu)建了豬瘟病毒C株特異的TCR Vα5和Vβ6基因的真核表達(dá)載體TCR Vα5-p IRES2-EGFP和TCR Vβ6-pIRES2-EGFP，將其單獨(dú)轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染不表達(dá)TCR的293T細(xì)胞中，在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上證明了其體外表達(dá)。但是這種將TCR Vα5和Vβ6基因分別構(gòu)建在同一個(gè)真核表達(dá)載體中，共同轉(zhuǎn)染后是否會(huì)影響異源二聚體TCR的形成，并有效在T細(xì)胞中表達(dá)，以及轉(zhuǎn)染后兩種質(zhì)粒能否穩(wěn)定存在[16]，是否對(duì)豬瘟病毒C株具有特異性的殺傷作用仍有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Construction and Cotransfection of Eukaryotic Expression Plasmids TCR Vα5 and Vβ6 Specific for CSFV-C Strain

WANG Chun-yan,CHEN Guo-hua,HE Xiao-bing,ZENG Shuang,JIA Huai-jie,FANG Yong-xiang,FENG Yuan,LI Shou-jie,JING Zhi-zhong

(StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology/KeyLaboratoryofVeterinaryPublicHealthofMinistryofAgriculture/LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou,Gansu,730046,China)

Previously,we detected TCR Vα5 and TCR Vβ6 gene families specific for CSFV-C strain.In this study,to further observe the expression levelinvitro,RT-PCR technique was used to amplify the full-length sequences of TCR Vα5 and TCR Vβ6,and recombinant plasmids of TCR Vα5-pIRES2-EGFP and TCR Vβ6-pIRES2-EGFP were also constructed and co-transfected into 293T cells to observe the expression of CSFV-C specific αβTCR gene.In result,the TCR Vα5 and TCR Vβ6 sequences were 816 bp and 945 bp,respectively;the sequences of TCR Vα5-pIRES2-EGFP and TCR Vβ6-pIERS2-EGFP recombinant plasmids were confirmed to be correct by restriction enzyme digestion analysis and sequencing.Green fluorescence was observed with at least 70% transfected cells after 24 h post-transfection.Besides,the expression of TCR Vα5 and TCR Vβ6 were detected through real-time PCR and the EGFP protein was also verified by Western blot and the EGFP expression level was the same between two groups.These results indicated that the eukaryotic expression vector of TCR Vα5-pIRES2-EGFP and TCR Vβ6-pIRES2-EGFP specific for CSFV-C strain were constructed successfully and can be co-transfected into the 293T cells,realizing co-expression of TCR Vα5 and TCR Vβ6 geneinvitro.

Classical swine fever-C strain;TCR Vα/Vβ gene;lipofectin transfection;EGFP

2016-03-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372423，31302072)

王春燕(1990 -)，女，山東煙臺(tái)人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物疫苗與分子免疫學(xué)研究。*通訊作者

S852.651;Q789

A

1007-5038(2016)10-0034-07