李　佳，侯　芳，段真真，巴音查汗，何宗霖*

(1.阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心，新疆阿克蘇 843000；2.阿克蘇地區(qū)卡拉庫(kù)爾羊基地畜牧獸醫(yī)站，新疆庫(kù)車 842000；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

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羊梅迪-維斯那病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

李佳1，2，侯芳1，3，段真真1，巴音查汗3*，何宗霖1*

(1.阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心，新疆阿克蘇 843000；2.阿克蘇地區(qū)卡拉庫(kù)爾羊基地畜牧獸醫(yī)站，新疆庫(kù)車 842000；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

為了建立一種能快速檢羊梅迪-維斯那病毒(MVV) 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，根據(jù)GenBank中MVV gag基因的序列，設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物及TaqMan探針，經(jīng)過(guò)反應(yīng)體系及條件優(yōu)化，以定量的10倍系列稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，建立了MVV實(shí)時(shí)熒光定量PCR。結(jié)果顯示，該方法對(duì)MVV DNA最小檢出量為10 copies/μL，比普通PCR具有較高的檢出率；組內(nèi)及組間變異系數(shù)均低于2%，具有較好的重復(fù)性；該方法可以特異地檢測(cè)到MVV，與其他病毒性樣品無(wú)交叉反應(yīng)。被檢的92份臨床樣品中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和常規(guī)PCR的陽(yáng)性檢出率分別為4.3%和3.3%。為羊MVV快速檢測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查提供了一種有效的方法。

梅迪-維斯那病毒；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；檢測(cè)

羊梅迪-維斯那病是由梅迪-維斯那病毒(Maedi-Visna virus，MVV)引起的一種慢性接觸性傳染病，MVV屬于RNA反轉(zhuǎn)錄病毒屬[1]，臨床上主要引起羊關(guān)節(jié)炎、腦炎和呼吸困難等癥狀，會(huì)造成感染羊進(jìn)行性消瘦、產(chǎn)羔數(shù)減少以及早期死亡等繁殖性能障礙，由于該病潛伏期長(zhǎng)、病程發(fā)展緩慢，不容易被發(fā)現(xiàn)[2]，該病的傳播容易給養(yǎng)羊業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。

梅迪-維斯那病最早發(fā)現(xiàn)于南非，隨后在荷蘭、美國(guó)以及冰島等國(guó)相繼發(fā)現(xiàn)了該病。1966年，我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)該病是從和田的引進(jìn)邊區(qū)萊斯特羊所致[3]。目前，該病幾乎遍布全世界所有的養(yǎng)羊國(guó)家，是全球養(yǎng)羊業(yè)的重要預(yù)防疫病之一?，F(xiàn)階段防控梅迪-維斯那病的主要方法是檢疫淘汰陽(yáng)性羊，雖然淘汰陽(yáng)性羊的方法可以降低發(fā)病率和死亡率，但是這種方法成本過(guò)高，不利于養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。

目前，檢測(cè)MVV的方法主要有病毒分離鑒定、ELISA、PCR等，但是這些方法在臨床應(yīng)用中存在靈敏度低、特異性差等不足[4-5]。因此，本研究針對(duì)MVV gag基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR，為MVV的早期快速檢測(cè)及分子流行病學(xué)研究提供了一種新的檢測(cè)手段。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株與疫苗MVV毒株，阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心實(shí)驗(yàn)室從發(fā)病綿羊臟器中分離保存；羊痘活疫苗，中牧實(shí)業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；口蹄疫疫苗、小反芻獸疫弱毒活疫苗，天康生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.1.2主要試劑與儀器 病毒核酸純化試劑盒、ExTaq聚合酶、Marker DL 2000、pXT19-T 載體、大腸埃希菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小量提取試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;Nano Drop 2000 超微量分光光度計(jì)，Thermo公司產(chǎn)品；7 500熒光 PCR 儀，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.1.3引物與探針設(shè)計(jì) 應(yīng)用Primer Premier 6.0軟件，根據(jù)GenBank中登錄的MVV gag 基因序列(登錄號(hào)：AY101611)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性實(shí)時(shí)熒光PCR引物和TaqMan探針，F(xiàn)-gag： 5′ -CATCTCAAGCCAATATGGATCAG-3′，R-gag： 5′-GTCACTGGTTCCGCATCAATAG-3′；P-gag：5′-FAM-CAAGACAGATATGCCTGCAGTGGGTAAT-TAMAR-3′；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)品的制備用病毒核酸純化試劑盒提取MVV DNA，用引物對(duì)提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增的陽(yáng)性產(chǎn)物鏈接至pXT19-T克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含氨芐西林的LB培養(yǎng)基增菌后，將PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將鑒定正確的陽(yáng)性菌液提取質(zhì)粒，經(jīng)超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度，以10倍遞增稀釋成 1.0×108copies/μL ～ 1.0×100copies/μL。

1.2.2反應(yīng)條件與體系優(yōu)化 采用矩陣方法對(duì)影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件中變性、退火、延伸溫度(54℃～60℃)、時(shí)間和反應(yīng)體系中的引物濃度(4 pmol/μL～15 pmol/μL)、探針濃度(5 pmol/μL～15 pmol/μL)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度試驗(yàn) 以10倍遞增稀釋好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為模板，按照優(yōu)化完成的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以雙蒸水為陰性對(duì)照，以便于區(qū)別最低檢測(cè)濃度。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度擴(kuò)增曲線，利用ABI 7500軟件分析自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4特異性試驗(yàn)分別提取羊痘病毒、口蹄疫病毒、小反芻獸疫病毒樣品RNA/DNA，按照優(yōu)化完成的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.5重復(fù)性試驗(yàn)選取5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行，進(jìn)行4次組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，每次試驗(yàn)間隔1周，分別計(jì)算組內(nèi)及組間的變異系數(shù)。

1.2.6臨床樣品檢測(cè)應(yīng)用建立的梅迪-維斯那病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)和常規(guī)PCR，對(duì)從阿克蘇地區(qū)庫(kù)車縣(成年卡拉庫(kù)爾羊50份)和阿克蘇市(成年刀郎羊42份)采集的92份抗凝血提取核酸后進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證建立的方法的臨床實(shí)用性。

2　結(jié)果

2.1重組陽(yáng)性質(zhì)粒的制備

以提取的MVV DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約145 bp的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)，將陽(yáng)性產(chǎn)物連接至pXT19-T克隆載體，將重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和測(cè)

序鑒定正確的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，提取質(zhì)粒后測(cè)定濃度，換算成初始濃度為 1.87×1010copies/ μL。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.梅迪-維斯那病毒；2.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1.Maedi-Visna virus；2.Negative control

圖1目的基因的PCR擴(kuò)增

Fig.1PCR amplification of the target gene

2.2反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化

以質(zhì)粒為模板，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳反應(yīng)濃度配比，最終確定最佳反應(yīng)體系為(25 μL)：2 × Premix ExTaq(Probe qPCR)12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)0.5 μL，探針為(10 pmol/μL)0.8 μL，模板1 μL，雙蒸水補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件確定為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 40 s，40 個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)，能夠獲得較小的Ct值及較大的熒光信號(hào)值，擴(kuò)增效果達(dá)到最好。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度試驗(yàn)

將質(zhì)粒按照10倍遞增稀釋好后，按照優(yōu)化好的反應(yīng)條件和體系，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法最低檢測(cè)稀釋度為1.87×101copies/μL，其靈敏度是常規(guī)PCR 的100倍(圖2)。以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，熒光信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式:y=-3.207x+38.86，相關(guān)系數(shù)R2=0.996，標(biāo)準(zhǔn)品與Ct值呈良好的線性關(guān)系(圖3)。

A.常規(guī)PCR;B.實(shí)時(shí)熒光定量PCR;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～8.1.87×108copies/μL～1.87×100copies/μL；N.陰性對(duì)照

A.PCR;B.Real-time PCR;M.DNA Marker DL 2 000；1-8.1.87×108copies/μL-1.87×100copies/μL；N.Negative control

圖2常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度試驗(yàn)

Fig.2Sensitivity tests of conventional PCR and real-time PCR

圖3　實(shí)時(shí)熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4特異性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果只有MVV樣品有擴(kuò)增曲線，羊痘病毒、口蹄疫病毒、小反芻獸疫病毒樣品均無(wú)擴(kuò)增曲線(圖4)。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)

選取1.87×107copies/μL ～ 1.87×103copies/μL 5個(gè)濃度的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)小于2%；組間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)小于1.41%(表1)，說(shuō)明建立的方法具有較好的重復(fù)性。

2.6臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

在臨床樣品檢測(cè)中，對(duì)92份羊的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示， 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢出4份陽(yáng)性，常規(guī)PCR檢出3份陽(yáng)性，其中常規(guī)PCR檢出的陽(yáng)性樣品經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR均顯示為陽(yáng)性，表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR更為靈敏。

1.梅迪-維斯那病毒；2.口蹄疫病毒；3.羊痘病毒；4.小反芻獸疫病毒；5.空白對(duì)照

1.MVV；2.FMDV；3.SPV；4.PPRV；5.Blank control

圖4　實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線 Fig.4　Specificity test curve of real-time PCR 表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)Table 1　The reproducibility test of real-time PCR

3　討論

梅迪-維斯納病是一種慢性、增生性傳染病，其病原MVV主要侵染單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，乳腺是最容易繁殖的靶器官，被MVV侵染多引起細(xì)胞融合形成多核細(xì)胞，數(shù)周后可在血液中檢測(cè)到該病毒[6-7]。MVV主要通過(guò)帶病羊的排泄物和健康羊直接接觸傳染，胎盤和乳汁可垂直傳播，一年四季均可發(fā)生，綿羊是MVV的易感宿主，其中邊區(qū)萊斯特羊最易感，感染率最高可達(dá)60%以上，中國(guó)美利奴羊和卡拉庫(kù)爾羊則易感性較低，而5歲以上羊易感性偏高[8]。

目前尚無(wú)有效疫苗和的治療方法，臨床上多呈散發(fā)，病死率較高，該病傳入感染羊群后很難根除，因此防控本病關(guān)鍵在于防止健康羊接觸傳染源和病羊，及時(shí)發(fā)現(xiàn)隔離淘汰帶病羊，做好飼養(yǎng)羊群和新進(jìn)羊的檢疫工作[9]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR因其特異、敏感、高通量等特點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域[10]，本研究根據(jù)MVV gag基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物和探針，通過(guò)優(yōu)化引物與探針的濃度配比，建立了梅迪-維斯那病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法具有良好的敏感性，最低檢測(cè)濃度為1.87×101copies/μL的陽(yáng)性質(zhì)粒，其敏感性比普通PCR提高了100倍，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%。該方法對(duì)口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)、綿羊痘病毒(Sheep pox virus,SPV)、小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)疫苗株的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，無(wú)交叉反應(yīng)，可用于羊出現(xiàn)相似臨床癥狀的病原鑒別檢測(cè)。本研究建立的方法敏感性好，無(wú)交叉反應(yīng)，重復(fù)性好，可應(yīng)用于高通量檢測(cè)，為MVV的分子生物學(xué)診斷和大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的檢測(cè)手段。

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Establishment of Real-time PCR for Detection of Mehdi-Visna Virus

LI Jia1,2，HOU Fang1,3，DUAN Zhen-zhen1，Bayinchahan3，HE Zong-lin1

(1.AksuCenterforAnimalDiseaseControlandDiagnosis，Aksu，Xinjiang，843000，China；2.KarakulSheepHusbandryandVeterinaryStation，Kuqa，Xinjiang，842000，China；3.CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturaUniversity，Urumqi，Xinjiang，830052，China)

In order to establish aTaqMan real-time PCR method to quickly check the sheep Maedi-Visna virus (MVV) ,according to the MVV gag gene sequences in GenBank,a pair of specific primers and aTaqMan probe were designed after optimizing the reaction system and conditions.The standards which are positive plasmids of quantitative 10-fold serial dilutions to real-time PCR amplification were used,and the real-time PCR detection method of MVV was established.The test results showed that the minimum detectable amount of this method is 10 copies,compared with ordinary PCR,the method has a higher detection rate;the coefficient of variation is less than 2% in intergroup and intragroup assays,with good repeatability; the method can be specific for detecting MVV,and do not have cross-reaction with other viral samples.Among 50 clinical samples,the positive rate was 4.3% detected by real-time PCR and 3.3% by conventional PCR.It indicated that the real-time PCR assay could be used for the rapid detection of MVV and molecular epidemiology investigation in sheep.

Mehdi-Visna virus;real-time PCR;detection

2016-03-25

新疆阿克蘇地區(qū)人才專項(xiàng)資金項(xiàng)目(20150037)

李佳(1989-)，男，新疆阿克蘇人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物疫病分子診斷研究。*通訊作者

S852.43;S852.659.3

A

1007-5038(2016)10-0026-04