高華峰，趙文華，高　林，楊仕標

(云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650024)

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小反芻獸疫病毒原核表達體外轉錄系統(tǒng)的建立

高華峰，趙文華，高林，楊仕標*

(云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650024)

構建了小反芻獸疫病毒(PPRV) 輔助質粒和微型復制子(minireplicon)并進行功能學研究。RT-PCR克隆PPRV疫苗株N75/1 N、 P和L基因，亞克隆至有T7啟動子的原核表達載體pGEM3Z構建完成3個輔助質粒，分別命名為pGEM3Z-N、pGEM3Z-P和pGEM3Z-L，并通過全基因合成構建含PPRV 病毒5′端啟動子序列(AGP)、3′ 端啟動子序列(GP)、T7轉錄終止信號、丁型肝炎病毒核酶序列HamRZ及氯霉素乙酰轉移酶(CAT),獲得 PPRV 微型復制子重組質粒 pGEM3Z-CAT。構建完成的微型復制子及輔助質粒在表達 T7 RNA多聚酶(T7 RNP)感染痘病毒VTF7-3后,通過脂質體法優(yōu)化4種質粒配比,并將其轉染至Vero細胞，通過間接免疫熒光分析CAT的表達情況，熒光顯微鏡觀察到熒光的表達，并通過免疫印跡分析CAT蛋白的表達，表明構建的PPRV微型復制子具有轉錄和復制功能，這將有助于進一步開展以PPRV反向遺傳操作為基礎的免疫學及蛋白功能研究。

小反芻獸疫病毒；微型復制子；氯霉素乙酰轉移酶

小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)是副黏病毒科、麻疹病毒屬的成員，因主要感染小反芻動物而得名，特別是山羊高度易感。該病主要在非洲及中東地區(qū)流行，近年來在我國周邊國家頻繁發(fā)生。2007年我國西藏自治區(qū)首次報道該病疫情[1-4]，2013年11月新疆再次暴發(fā)該病，由于山羊和綿羊的大范圍流動，本病在國內迅速傳播，至2014年9月不到1年的時間，全國共有22個省(自治區(qū))256個縣暴發(fā)疫情，2014年發(fā)病毒株與巴基斯坦和塔吉克斯坦流行毒株更一致[5]，國內最新研究表明，基因Ⅱ型也在出現(xiàn)在我國的黑龍江省[6-7]。

PPRV基因組為單股負鏈無節(jié)段RNA，從RNA鏈的3′端至5′端依次分布著N-P-M-F-H-L 6個基因，分別編碼相應的6種結構蛋白，各基因間由一定的基因間序列相間隔，PPRV N75/1弱毒疫苗株的基因組序列由15 948個堿基組成[2-3]。應用反向遺傳學現(xiàn)已完成所有麻疹病毒屬的病毒拯救，由于反向遺傳技術可從cDNA水平進行RNA病毒拯救，因而可以利用突變技術有目的地改變病毒基因組結構，獲得有感染性的重組病毒，從而極大地方便了病毒復制、增殖包裝以及免疫學的研究。為此，我們首先構建了小反芻獸疫病毒N75/1株的微型復制子，利用T7啟動子和表達T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒VTF7-3構成的表達系統(tǒng)進行病毒轉錄復制效率研究，以方便將來的小反芻獸疫病毒拯救及免疫學研究。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1生物材料病毒、載體及Vero細胞、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清，Gibico公司產品；大腸埃希菌DH5α、原核載體pGEM3Z、表達T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒VTF7-3、小反芻獸疫病毒N75/1弱毒疫苗株，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室保存。

1.1.2酶及試劑各種工具酶及核酸提取試劑Trizol，寶生物工程(大連)有限公司產品；去基因組RNA反轉錄試劑盒，北京天根生物公司產品；陽離子脂質體細胞轉染試劑(Lipofectamine 3000)，Invitrogen公司產品；PCR擴增試劑盒及產物回收試劑盒,上海生工生物工程技術服務有限公司產品；常用內切酶，F(xiàn)ermentas公司產品；全基因合成及連接送蘇州金唯智公司完成；引物合成及DNA測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.1.3抗體氯霉素乙酰轉移酶蛋白單克隆抗體，Santa Cruz公司產品;羊抗鼠FITC標記的IgG二抗，碧云天公司產品。

1.2方法

1.2.1引物設計根據(jù)小反芻獸疫病毒N75/1毒株，設計合成如下引物用于目的基因的擴增(表1)。

表1　輔助質粒擴增引物Table 1　Primers for helper plasmid amplification

注：帶下劃線的斜體大寫字母為酶切位點，酶切位點前大寫字母核苷酸為保護堿基，“+”和“-”分別代表上游引物和下游引物，N為全長核蛋白序列，P為全長磷酸化蛋白，LF1～LF3為分三段擴增的多聚酶蛋白L序列，CAT為氯霉素乙酰轉移酶。

Note:The underlined italic capital letters for restriction enzyme sites and enzyme digestion sites before the uppercase nucleotides to protect the base,"+" and "-" representing upstream primer and downstream primer, N for full-length nucleoprotein sequence,P for full-length phosphorylated protein,LF1-LF3 for three segment amplification polymerase L protein sequence,CAT chloramphenicol acetyl transferase.

1.2.2質粒構建以形成廣泛病變的 PPRV感染Vero細胞培養(yǎng)物提取細胞總RNA，用上游特異引物合成cDNA,再分別以引物PCR擴增病毒蛋白N、P、L的編碼區(qū)，TA克隆到pMD19T載體上，再亞克隆到質粒pGEM3Z,獲得質粒pGEM3Z-N、pGEM3Z-P、pGEM3Z-L。以上3個質粒中病毒蛋白基因均在T7啟動子控制下，PPRV微型復制子通過全基因合成調控序列GP和AGP分別為病毒3′端及5′端109 nt和107 nt調控序列，660 bp的報告基因氯酶素乙酰轉移酶CAT，核酶序列在基因組3′端引入Hepatitis delta ribozyme (HdvRZ，88bp)和T7終止子序列的重組質粒，測序驗證后命名為pGEM3Z-CAT。

1.2.3轉染及蛋白瞬時表達鑒定Vero細胞在6孔板上長至80%～90%單層，用重組痘苗病毒VTF7-3吸附感染(MOI=10)1 h。以Lipofection 2000試劑轉染，共轉染質粒總量按試劑盒說明書進行。質粒pGEM3Z-N、pGEM3Z-P、pGEM3Z-L、pGEM3Z-CAT共轉染量之比為30∶10∶5∶1。

1.2.4RT及PCR反應提取出現(xiàn)典型細胞病變的Vero細胞總RNA，20 μL體系，42℃反轉錄15 min，完成反轉錄后取1 μL cDNA對Vero細胞mRNA擴增，PCR反應條件均設為：94℃ 5 min;94℃ 40 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min～3 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。反應體系為50 μL，連接T載體測序驗證后用于后續(xù)的酶切及連接，CAT mRNA的檢測取轉染后48 h的細胞及對照，消化后提取總RNA，20 μL體系，42℃反轉錄15 min，完成反轉錄后取1 μL cDNA對Vero細胞mRNA擴增，PCR反應條件均設為：94℃ 5 min;94℃ 40 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min。反應體系為20 μL。

1.2.5間接免疫熒光(IFA)試驗共轉染質粒48 h后細胞用0.01 mol/L PBS(pH7.2)沖洗3次：用冰丙酮固定20 min，0.01 mol/L預冷PBS漂洗，5 min 3次；滴加1∶2 000稀釋的小反芻獸疫N蛋白單抗為一抗，置于濕盒中，室溫孵育60 min，0.01 mol/L預冷PBS漂洗，5 min 3次；滴加1∶50稀釋的羊抗鼠FITC標記的IgG為二抗，室溫避光放置60 min，0.01 mol/L預冷PBS漂洗，5 min 3次；用熒光顯微鏡觀察。丙酮固定10 min，以小鼠抗CAT抗體為第一抗體，F(xiàn)ITC標記羊抗鼠IgG為第二抗體，以未轉染的Vero為陰性對照，間接免疫熒光染色檢測復制子的包裝。

1.2.6Western blot分析蛋白免疫印跡則在轉染48 h后，取106個細胞裂解進行SDS-PAGE，轉膜后100 g/L脫脂奶封閉過夜，以小鼠抗CAT抗體為第一抗體，F(xiàn)ITC標記羊抗鼠IgG為第二抗體，以未轉染的Vero為陰性對照，用ECL化學發(fā)光試劑顯色30 min分析結果。

2　結果

2.1N75/1病毒株輔助質粒酶切鑒定

以形成廣泛病變的PPRV感染Vero細胞培養(yǎng)物提取細胞總RNA，用上游特異引物合成cDNA，再分別以病毒反轉錄產物通過特異引物擴增病毒蛋白N、P、L的編碼區(qū)，TA克隆到pMD-19T載體上，經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序驗證后分別用外部及內部酶切位點酶切及連接再亞克隆到原核表達質粒pGEM3Z，獲得質粒pGEM3Z-N、pGEM3Z-P、pGEM3Z-L。酶切鑒定后得到與預期相符的大小分別為1 578、1 530、6 552、1 018 bp的4個條帶(圖1)。

2.2微型復制子的構建

如圖2，由T7啟動子，3′端調控序列GP，氯酶素乙酰轉移酶CAT，5′端調控序列AGP，丁肝核酶核心切割序,HdvRZ的自我剪切位點在其5′末端的鳥嘌啉之后的磷酸二脂鍵，T7終止子構成，通過T7啟動子有效轉錄產生初級轉錄產物正義鏈，T7由表達禽痘病毒的重組病毒或穩(wěn)定表達T7聚合酶的允許細胞產生，共轉染輔助質料pGEM3Z-N、pGEM3Z-P、pGEM3Z-L及產生微型復制子的反基因組，負鏈復制子形成全長正義復制子，并轉錄表達氯酶素乙酰轉移酶CAT的信使RNA。

A.N基因：M.DNA 標準DL 15 000;1,2.質粒pGEM3Z-N雙酶切產物;B.P基因：M.DNA 標準DL 15 000;1,2.質粒pGEM3Z-P雙酶切產物;C.L基因：M.DNA 標準DL 10 000;1.質粒pGEM3Z-L雙酶切產物;2.質粒pGEM3Z-L

A.N gene：M.DNA Marker DL 15 000;1-2.Double enzyme digestion of plasmid pGEM3Z-N;B.P gene：M.DNA Marker DL 15 000;1-2.Double enzyme digestion of plasmid pGEM3Z-P;C.L gene：M.DNA Marker DL 10 000;1.Double digestion of plasmid pGEM3Z-L;2.Plasmid pGEM3Z-L

圖1重組質粒的酶切鑒定

Fig.1Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

圖2　N75/1病毒基因組全長文庫構建策略及微型復制子轉錄復制

2.3微型復制子在細胞株中的拯救

Vero細胞在6孔板上長至80%～90%單層，用重組痘苗病毒 VTF7-3吸附感染(MOI=10) 1 h，將構建好的4個質粒，按不同濃度配比轉染Vero細胞，質粒pGEM3Z-N、pGEM3Z-P、pGEM3Z-L、pGEM3Z-CAT共轉染量之比為最終確定為30∶10∶5∶1。轉染后于48 h 通過間接免疫熒光觀察CAT在細胞中的表達，在細胞漿中觀察到少量細胞表達CAT蛋白，表明該系統(tǒng)能有效起始轉錄，但表達量相對較低(圖3)。

2.4標記蛋白CAT表達分析

Vero細胞在6孔板上長至80%～90%單層，用重組痘苗病毒 VTF7-3吸附感染(MOI=10) 1 h，將構建好的4個質粒按30∶10∶5∶1共轉染。采用RT-PCR分析CAT基因48 h mRNA轉錄水平的表達，提取轉染Vero細胞總RNA,棄除基因組RNA后反轉錄，經PCR分析CAT基因的表達，轉染Vero細胞中有大小為275 bp的CAT表達，對照細胞則表達(圖4A),轉染48 h的細胞收集后以1×106細胞量裂解后，通過蛋白免疫印跡分析CAT的表達，經30 min曝光并顯色后能觀察到26 ku大小的條帶(圖4B)。表明小復制子能有效起始標記基因CAT的轉錄。

A.轉染Vero細胞對照；B.小復制子的間接免疫熒光染色

A.Transfected Vero cell control；B.Indirect immunefluorescence staining of minireplicon

圖3微型復制子在Vero細胞株中的拯救(100×)

Fig.3Rescue of the minireplicon in Vero cells (100×)

A.PCR;B.Western blot;M.DNA 標準DL 2 000;1.陰性對照;2.未轉染Vero細胞;3.轉染48 h的Vero細胞;4，5.轉染48 h的Vero細胞;6.陰性對照

A.PCR;B.Western blot;M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control;2.Non transfected Vero cells;3.Transfected Vero cells in 48 h;4,5.Transfected Vero cells in 48 h;6. Negative control

圖4標記蛋白CAT mRNA表達蛋白的免疫印跡分析

Fig.4Western blot analysis of CAT mRNA expression

3　討論

關于核酶與基因組的完整性?；蚪M的完整性，特別是5′末端和3′末端多出的非病毒核苷酸對病毒的拯救成敗和效率有重大影響。本研究為實現(xiàn)從轉錄水平上控制PPRV基因組的完整性，將HdvRZ的cDNA引入到PPRV株全基因組cDNA的末端。關于重組載體轉錄的正確終止，研究者做過很多嘗試。世界上首次拯救出副黏病毒利用轉錄3′端引入的單酶切位點來解決這一問題。核酶結構的引入，更使這一難題得到了近乎完美的解決。核酶是一種具有酶活性的RNA，將具有自我剪切功能的核酶cDNA，作為順式作用元件引入全基因組兩端，從轉錄水平上實現(xiàn)對“基因組完整性”的精確控制，從而提高病毒拯救效率[8-9]。

本研究從兩個方面來確保病毒基因組的保真性:①PCR要使用高保真酶。本研究使用的是Invitrogen公司的高保真，保真性良好。②基因組的克隆與拼接對PPRV這種基因組較大的病毒，仍然要采用分段克隆然后拼接全長的方法，步驟煩瑣，比較容易引入突變。對于每個節(jié)段，都要至少測3個克隆一致，才能確定其序列?？紤]到“6堿基原則”在副黏病毒基因組復制中的重要作用[10]，本試驗在構建微型基因組時選擇的序列全長為660 bp，為該體系的有效運行提供了良好保證，轉錄載體pGEM-3Z為復制嚴謹型的低拷貝質粒，可以提高重組質粒的穩(wěn)定性，減少突變率，同時載體中含有高效的T7啟動子以及丁型肝炎病毒的核酶和T7轉錄終止子，保證轉錄的高效性和準確性。

在眾多的影響病毒拯救的因素中，篩選轉染用的細胞系也是至關重要的。最先使用的轉染細胞均來源于允許細胞，這樣，細胞就能提供病毒復制所需要的受體及轉錄復制酶，對于早期獲得重組病毒，通常采用原核啟動子來啟動基因的轉錄，后來逐漸發(fā)展到用啟動效率較高的真核啟動子如CMV啟動子啟始轉錄，大大提高了重組效率，但對于基因組較大的病毒，真核啟動子并未表現(xiàn)出比T7更高的起始轉錄效率，因而T7啟動子仍廣泛應用于病毒拯救；由于細胞并不能提供T7啟動子所能識別的原核RNA酶結合位點，因而需要提供附加的T7 RNA聚合酶，最早應用的是表達T7 RNA聚合酶的復制缺陷型痘苗病毒，但由于其毒性較大，被后來的VTF7-3系統(tǒng)替換[10-12]。本研究采用VTF7-3和獲得穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶的Vero細胞，盡量避免接種病毒所帶來的干擾。

本研究所構建的小反芻獸疫病毒微型復制子的拯救系統(tǒng)，將為進一步提高小反芻獸疫病毒全基因組感染性克隆的拯救效率奠定了基礎。

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Establishment of aninVitroTranscription System for Peste des Petits Ruminant Virus

GAO Hua-feng，ZHAO Wen-hua，GAO Lin,YANG Shi-biao

(YunnanTropicalandSubtropicalAnimalViralDiseaseLaboratory,Kunming,Yunnan,650024,China)

In order to initiate the type of transcription pathways for PPRV,a PPRV minireplicon was constructed and its expression in transfected cells were studied.Backbone of pGEM3Z was used to clone the coding sequences of three genes of PPRV N,P,and L and finally named pGEM3Z-N,pGEM3Z-P,pGEM3Z-L respectively.The d-ribozyme,PPRV 5′genome promoters,3′antigenome promoters,T7 terminator,chloramphenicol acetyltransferase sequences were synthesized by artificial way and finally named pGEM3Z-CAT.These four plasmids were transfected into the cells by lipofectamine 2000 which infected VTF7-3 with T7 RNA polymerase.The expression of the target CAT protein was analyzed by indirect immune fluorescence and then by Western blot.The results showed that the cotransfection displayed that specific fluorescence can be observed in Vero cells and the protein can be detected by Western blot.The constructed PPRV minireplicon is able to replicate and transcribe,which provides a solid foundation for further PPRV studies by reverse genetics.

Peste-des-petits-ruminants virus;minireplicon;chloramphenicol acetyltransferase

2016-01-10

國家自然科學基金項目(31160499)

高華峰(1973-)，男，云南宣威人，副研究員，主要從事動物病毒學研究。*通訊作者

S852.659.5

A

1007-5038(2016)10-0021-05