高華峰，趙文華，高　林，楊仕標(biāo)

(云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650024)

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小反芻獸疫病毒原核表達(dá)體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的建立

高華峰，趙文華，高林，楊仕標(biāo)*

(云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650024)

構(gòu)建了小反芻獸疫病毒(PPRV) 輔助質(zhì)粒和微型復(fù)制子(minireplicon)并進(jìn)行功能學(xué)研究。RT-PCR克隆PPRV疫苗株N75/1 N、 P和L基因，亞克隆至有T7啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體pGEM3Z構(gòu)建完成3個(gè)輔助質(zhì)粒，分別命名為pGEM3Z-N、pGEM3Z-P和pGEM3Z-L，并通過全基因合成構(gòu)建含PPRV 病毒5′端啟動(dòng)子序列(AGP)、3′ 端啟動(dòng)子序列(GP)、T7轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、丁型肝炎病毒核酶序列HamRZ及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT),獲得 PPRV 微型復(fù)制子重組質(zhì)粒 pGEM3Z-CAT。構(gòu)建完成的微型復(fù)制子及輔助質(zhì)粒在表達(dá) T7 RNA多聚酶(T7 RNP)感染痘病毒VTF7-3后,通過脂質(zhì)體法優(yōu)化4種質(zhì)粒配比,并將其轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，通過間接免疫熒光分析CAT的表達(dá)情況，熒光顯微鏡觀察到熒光的表達(dá)，并通過免疫印跡分析CAT蛋白的表達(dá)，表明構(gòu)建的PPRV微型復(fù)制子具有轉(zhuǎn)錄和復(fù)制功能，這將有助于進(jìn)一步開展以PPRV反向遺傳操作為基礎(chǔ)的免疫學(xué)及蛋白功能研究。

小反芻獸疫病毒；微型復(fù)制子；氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶

小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)是副黏病毒科、麻疹病毒屬的成員，因主要感染小反芻動(dòng)物而得名，特別是山羊高度易感。該病主要在非洲及中東地區(qū)流行，近年來在我國周邊國家頻繁發(fā)生。2007年我國西藏自治區(qū)首次報(bào)道該病疫情[1-4]，2013年11月新疆再次暴發(fā)該病，由于山羊和綿羊的大范圍流動(dòng)，本病在國內(nèi)迅速傳播，至2014年9月不到1年的時(shí)間，全國共有22個(gè)省(自治區(qū))256個(gè)縣暴發(fā)疫情，2014年發(fā)病毒株與巴基斯坦和塔吉克斯坦流行毒株更一致[5]，國內(nèi)最新研究表明，基因Ⅱ型也在出現(xiàn)在我國的黑龍江省[6-7]。

PPRV基因組為單股負(fù)鏈無節(jié)段RNA，從RNA鏈的3′端至5′端依次分布著N-P-M-F-H-L 6個(gè)基因，分別編碼相應(yīng)的6種結(jié)構(gòu)蛋白，各基因間由一定的基因間序列相間隔，PPRV N75/1弱毒疫苗株的基因組序列由15 948個(gè)堿基組成[2-3]。應(yīng)用反向遺傳學(xué)現(xiàn)已完成所有麻疹病毒屬的病毒拯救，由于反向遺傳技術(shù)可從cDNA水平進(jìn)行RNA病毒拯救，因而可以利用突變技術(shù)有目的地改變病毒基因組結(jié)構(gòu)，獲得有感染性的重組病毒，從而極大地方便了病毒復(fù)制、增殖包裝以及免疫學(xué)的研究。為此，我們首先構(gòu)建了小反芻獸疫病毒N75/1株的微型復(fù)制子，利用T7啟動(dòng)子和表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒VTF7-3構(gòu)成的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制效率研究，以方便將來的小反芻獸疫病毒拯救及免疫學(xué)研究。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1生物材料病毒、載體及Vero細(xì)胞、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清，Gibico公司產(chǎn)品；大腸埃希菌DH5α、原核載體pGEM3Z、表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒VTF7-3、小反芻獸疫病毒N75/1弱毒疫苗株，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2酶及試劑各種工具酶及核酸提取試劑Trizol，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；去基因組RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京天根生物公司產(chǎn)品；陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine 3000)，Invitrogen公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增試劑盒及產(chǎn)物回收試劑盒,上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；常用內(nèi)切酶，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；全基因合成及連接送蘇州金唯智公司完成；引物合成及DNA測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.1.3抗體氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白單克隆抗體，Santa Cruz公司產(chǎn)品;羊抗鼠FITC標(biāo)記的IgG二抗，碧云天公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)小反芻獸疫病毒N75/1毒株，設(shè)計(jì)合成如下引物用于目的基因的擴(kuò)增(表1)。

表1　輔助質(zhì)粒擴(kuò)增引物Table 1　Primers for helper plasmid amplification

注：帶下劃線的斜體大寫字母為酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)前大寫字母核苷酸為保護(hù)堿基，“+”和“-”分別代表上游引物和下游引物，N為全長核蛋白序列，P為全長磷酸化蛋白，LF1～LF3為分三段擴(kuò)增的多聚酶蛋白L序列，CAT為氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。

Note:The underlined italic capital letters for restriction enzyme sites and enzyme digestion sites before the uppercase nucleotides to protect the base,"+" and "-" representing upstream primer and downstream primer, N for full-length nucleoprotein sequence,P for full-length phosphorylated protein,LF1-LF3 for three segment amplification polymerase L protein sequence,CAT chloramphenicol acetyl transferase.

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建以形成廣泛病變的 PPRV感染Vero細(xì)胞培養(yǎng)物提取細(xì)胞總RNA，用上游特異引物合成cDNA,再分別以引物PCR擴(kuò)增病毒蛋白N、P、L的編碼區(qū)，TA克隆到pMD19T載體上，再亞克隆到質(zhì)粒pGEM3Z,獲得質(zhì)粒pGEM3Z-N、pGEM3Z-P、pGEM3Z-L。以上3個(gè)質(zhì)粒中病毒蛋白基因均在T7啟動(dòng)子控制下，PPRV微型復(fù)制子通過全基因合成調(diào)控序列GP和AGP分別為病毒3′端及5′端109 nt和107 nt調(diào)控序列，660 bp的報(bào)告基因氯酶素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT，核酶序列在基因組3′端引入Hepatitis delta ribozyme (HdvRZ，88bp)和T7終止子序列的重組質(zhì)粒，測序驗(yàn)證后命名為pGEM3Z-CAT。

1.2.3轉(zhuǎn)染及蛋白瞬時(shí)表達(dá)鑒定Vero細(xì)胞在6孔板上長至80%～90%單層，用重組痘苗病毒VTF7-3吸附感染(MOI=10)1 h。以Lipofection 2000試劑轉(zhuǎn)染，共轉(zhuǎn)染質(zhì)?？偭堪丛噭┖姓f明書進(jìn)行。質(zhì)粒pGEM3Z-N、pGEM3Z-P、pGEM3Z-L、pGEM3Z-CAT共轉(zhuǎn)染量之比為30∶10∶5∶1。

1.2.4RT及PCR反應(yīng)提取出現(xiàn)典型細(xì)胞病變的Vero細(xì)胞總RNA，20 μL體系，42℃反轉(zhuǎn)錄15 min，完成反轉(zhuǎn)錄后取1 μL cDNA對Vero細(xì)胞mRNA擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件均設(shè)為：94℃ 5 min;94℃ 40 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min～3 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)體系為50 μL，連接T載體測序驗(yàn)證后用于后續(xù)的酶切及連接，CAT mRNA的檢測取轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞及對照，消化后提取總RNA，20 μL體系，42℃反轉(zhuǎn)錄15 min，完成反轉(zhuǎn)錄后取1 μL cDNA對Vero細(xì)胞mRNA擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件均設(shè)為：94℃ 5 min;94℃ 40 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。反應(yīng)體系為20 μL。

1.2.5間接免疫熒光(IFA)試驗(yàn)共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h后細(xì)胞用0.01 mol/L PBS(pH7.2)沖洗3次：用冰丙酮固定20 min，0.01 mol/L預(yù)冷PBS漂洗，5 min 3次；滴加1∶2 000稀釋的小反芻獸疫N蛋白單抗為一抗，置于濕盒中，室溫孵育60 min，0.01 mol/L預(yù)冷PBS漂洗，5 min 3次；滴加1∶50稀釋的羊抗鼠FITC標(biāo)記的IgG為二抗，室溫避光放置60 min，0.01 mol/L預(yù)冷PBS漂洗，5 min 3次；用熒光顯微鏡觀察。丙酮固定10 min，以小鼠抗CAT抗體為第一抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠IgG為第二抗體，以未轉(zhuǎn)染的Vero為陰性對照，間接免疫熒光染色檢測復(fù)制子的包裝。

1.2.6Western blot分析蛋白免疫印跡則在轉(zhuǎn)染48 h后，取106個(gè)細(xì)胞裂解進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后100 g/L脫脂奶封閉過夜，以小鼠抗CAT抗體為第一抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠IgG為第二抗體，以未轉(zhuǎn)染的Vero為陰性對照，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色30 min分析結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1N75/1病毒株輔助質(zhì)粒酶切鑒定

以形成廣泛病變的PPRV感染Vero細(xì)胞培養(yǎng)物提取細(xì)胞總RNA，用上游特異引物合成cDNA，再分別以病毒反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過特異引物擴(kuò)增病毒蛋白N、P、L的編碼區(qū)，TA克隆到pMD-19T載體上，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序驗(yàn)證后分別用外部及內(nèi)部酶切位點(diǎn)酶切及連接再亞克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEM3Z，獲得質(zhì)粒pGEM3Z-N、pGEM3Z-P、pGEM3Z-L。酶切鑒定后得到與預(yù)期相符的大小分別為1 578、1 530、6 552、1 018 bp的4個(gè)條帶(圖1)。

2.2微型復(fù)制子的構(gòu)建

如圖2，由T7啟動(dòng)子，3′端調(diào)控序列GP，氯酶素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT，5′端調(diào)控序列AGP，丁肝核酶核心切割序,HdvRZ的自我剪切位點(diǎn)在其5′末端的鳥嘌啉之后的磷酸二脂鍵，T7終止子構(gòu)成，通過T7啟動(dòng)子有效轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物正義鏈，T7由表達(dá)禽痘病毒的重組病毒或穩(wěn)定表達(dá)T7聚合酶的允許細(xì)胞產(chǎn)生，共轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)料pGEM3Z-N、pGEM3Z-P、pGEM3Z-L及產(chǎn)生微型復(fù)制子的反基因組，負(fù)鏈復(fù)制子形成全長正義復(fù)制子，并轉(zhuǎn)錄表達(dá)氯酶素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT的信使RNA。

A.N基因：M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000;1,2.質(zhì)粒pGEM3Z-N雙酶切產(chǎn)物;B.P基因：M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000;1,2.質(zhì)粒pGEM3Z-P雙酶切產(chǎn)物;C.L基因：M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000;1.質(zhì)粒pGEM3Z-L雙酶切產(chǎn)物;2.質(zhì)粒pGEM3Z-L

A.N gene：M.DNA Marker DL 15 000;1-2.Double enzyme digestion of plasmid pGEM3Z-N;B.P gene：M.DNA Marker DL 15 000;1-2.Double enzyme digestion of plasmid pGEM3Z-P;C.L gene：M.DNA Marker DL 10 000;1.Double digestion of plasmid pGEM3Z-L;2.Plasmid pGEM3Z-L

圖1重組質(zhì)粒的酶切鑒定

Fig.1Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

圖2　N75/1病毒基因組全長文庫構(gòu)建策略及微型復(fù)制子轉(zhuǎn)錄復(fù)制

2.3微型復(fù)制子在細(xì)胞株中的拯救

Vero細(xì)胞在6孔板上長至80%～90%單層，用重組痘苗病毒 VTF7-3吸附感染(MOI=10) 1 h，將構(gòu)建好的4個(gè)質(zhì)粒，按不同濃度配比轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，質(zhì)粒pGEM3Z-N、pGEM3Z-P、pGEM3Z-L、pGEM3Z-CAT共轉(zhuǎn)染量之比為最終確定為30∶10∶5∶1。轉(zhuǎn)染后于48 h 通過間接免疫熒光觀察CAT在細(xì)胞中的表達(dá)，在細(xì)胞漿中觀察到少量細(xì)胞表達(dá)CAT蛋白，表明該系統(tǒng)能有效起始轉(zhuǎn)錄，但表達(dá)量相對較低(圖3)。

2.4標(biāo)記蛋白CAT表達(dá)分析

Vero細(xì)胞在6孔板上長至80%～90%單層，用重組痘苗病毒 VTF7-3吸附感染(MOI=10) 1 h，將構(gòu)建好的4個(gè)質(zhì)粒按30∶10∶5∶1共轉(zhuǎn)染。采用RT-PCR分析CAT基因48 h mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，提取轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞總RNA,棄除基因組RNA后反轉(zhuǎn)錄，經(jīng)PCR分析CAT基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞中有大小為275 bp的CAT表達(dá)，對照細(xì)胞則表達(dá)(圖4A),轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞收集后以1×106細(xì)胞量裂解后，通過蛋白免疫印跡分析CAT的表達(dá)，經(jīng)30 min曝光并顯色后能觀察到26 ku大小的條帶(圖4B)。表明小復(fù)制子能有效起始標(biāo)記基因CAT的轉(zhuǎn)錄。

A.轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞對照；B.小復(fù)制子的間接免疫熒光染色

A.Transfected Vero cell control；B.Indirect immunefluorescence staining of minireplicon

圖3微型復(fù)制子在Vero細(xì)胞株中的拯救(100×)

Fig.3Rescue of the minireplicon in Vero cells (100×)

A.PCR;B.Western blot;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陰性對照;2.未轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞;3.轉(zhuǎn)染48 h的Vero細(xì)胞;4，5.轉(zhuǎn)染48 h的Vero細(xì)胞;6.陰性對照

A.PCR;B.Western blot;M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control;2.Non transfected Vero cells;3.Transfected Vero cells in 48 h;4,5.Transfected Vero cells in 48 h;6. Negative control

圖4標(biāo)記蛋白CAT mRNA表達(dá)蛋白的免疫印跡分析

Fig.4Western blot analysis of CAT mRNA expression

3　討論

關(guān)于核酶與基因組的完整性?；蚪M的完整性，特別是5′末端和3′末端多出的非病毒核苷酸對病毒的拯救成敗和效率有重大影響。本研究為實(shí)現(xiàn)從轉(zhuǎn)錄水平上控制PPRV基因組的完整性，將HdvRZ的cDNA引入到PPRV株全基因組cDNA的末端。關(guān)于重組載體轉(zhuǎn)錄的正確終止，研究者做過很多嘗試。世界上首次拯救出副黏病毒利用轉(zhuǎn)錄3′端引入的單酶切位點(diǎn)來解決這一問題。核酶結(jié)構(gòu)的引入，更使這一難題得到了近乎完美的解決。核酶是一種具有酶活性的RNA，將具有自我剪切功能的核酶cDNA，作為順式作用元件引入全基因組兩端，從轉(zhuǎn)錄水平上實(shí)現(xiàn)對“基因組完整性”的精確控制，從而提高病毒拯救效率[8-9]。

本研究從兩個(gè)方面來確保病毒基因組的保真性:①PCR要使用高保真酶。本研究使用的是Invitrogen公司的高保真，保真性良好。②基因組的克隆與拼接對PPRV這種基因組較大的病毒，仍然要采用分段克隆然后拼接全長的方法，步驟煩瑣，比較容易引入突變。對于每個(gè)節(jié)段，都要至少測3個(gè)克隆一致，才能確定其序列?？紤]到“6堿基原則”在副黏病毒基因組復(fù)制中的重要作用[10]，本試驗(yàn)在構(gòu)建微型基因組時(shí)選擇的序列全長為660 bp，為該體系的有效運(yùn)行提供了良好保證，轉(zhuǎn)錄載體pGEM-3Z為復(fù)制嚴(yán)謹(jǐn)型的低拷貝質(zhì)粒，可以提高重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性，減少突變率，同時(shí)載體中含有高效的T7啟動(dòng)子以及丁型肝炎病毒的核酶和T7轉(zhuǎn)錄終止子，保證轉(zhuǎn)錄的高效性和準(zhǔn)確性。

在眾多的影響病毒拯救的因素中，篩選轉(zhuǎn)染用的細(xì)胞系也是至關(guān)重要的。最先使用的轉(zhuǎn)染細(xì)胞均來源于允許細(xì)胞，這樣，細(xì)胞就能提供病毒復(fù)制所需要的受體及轉(zhuǎn)錄復(fù)制酶，對于早期獲得重組病毒，通常采用原核啟動(dòng)子來啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，后來逐漸發(fā)展到用啟動(dòng)效率較高的真核啟動(dòng)子如CMV啟動(dòng)子啟始轉(zhuǎn)錄，大大提高了重組效率，但對于基因組較大的病毒，真核啟動(dòng)子并未表現(xiàn)出比T7更高的起始轉(zhuǎn)錄效率，因而T7啟動(dòng)子仍廣泛應(yīng)用于病毒拯救；由于細(xì)胞并不能提供T7啟動(dòng)子所能識(shí)別的原核RNA酶結(jié)合位點(diǎn)，因而需要提供附加的T7 RNA聚合酶，最早應(yīng)用的是表達(dá)T7 RNA聚合酶的復(fù)制缺陷型痘苗病毒，但由于其毒性較大，被后來的VTF7-3系統(tǒng)替換[10-12]。本研究采用VTF7-3和獲得穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的Vero細(xì)胞，盡量避免接種病毒所帶來的干擾。

本研究所構(gòu)建的小反芻獸疫病毒微型復(fù)制子的拯救系統(tǒng)，將為進(jìn)一步提高小反芻獸疫病毒全基因組感染性克隆的拯救效率奠定了基礎(chǔ)。

[1]張喜悅,劉春菊,王志亮,等.小反芻獸疫(PPR)傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)分析[J].中國動(dòng)物檢疫,2007,24(10):40-42.

[2]Dhar P,Sreenivasa B P,Barrett T,et al.Recent epidemiology of peste des petits ruminants virus (PPRV) [J].Vet Microbiol,2002,88(2):153-159.

[3]Shaila M S,Shamaki D,Forsyth M A,et al.Geographic distribution and epidemiology of peste des petits ruminants viruses[J].Virus Res,1996:43(2):149-153.

[4]Wang Z,Bao J,Wu X,et al.Peste des petits ruminants virus in Tibet,China[J].Emerg Infect Dis,2009,15(2):299-301.

[5]Wu X,Li L,Wang Z,et al.Peste des petits ruminants viruses re-emerging in China,2013-2014[J].Transb Emerg Dis,2015,8(1):24-35.

[6]Wang J,Wang M,Cai X,et al.Peste des petits ruminants virus in Heilongjiang province, China, 2014[J].Emerg Infect Dis,2015,21(4):677-680.

[7]Su W,Xing C,Wu Y，et al.Complete genome sequence of a novel mutant of peste des petits ruminants virus obtained from china[J].Acta Virol,2015,59(1):78-83.

[8]Roberts A,Rose J K.Recovery of negative-strand RNA viruses from plasmid DNAs:a positive approach revitalizes a negative field[J].Virology,1998,247(1):1-6.

[9]Barik S.Control of nonsegmented negative-strand RNA virus replication by siRNA[J].Virus Res,2004,102(1):27-35.

[10]Yunus M,Shaila M S.Establishment of aninvitrotranscription system for peste des petits ruminant virus[J].Virol J,2012,9:302.doi:10.1186/1743-422X-9-302.

[11]Calain P,Curran J,Kolakofsky D,et al.Molecular cloning of natural paramyxovirus copy-back defective interfering RNAs and their expression from DNA[J]. Virology,1992,191(1):62-71.

[12]Ghosh A,Nayak R,Shaila M S.Synthesis of leader RNA and editing of P mRNA during transcription by rinderpest virus[J].Virus Res,1996,41:69-76.

Establishment of aninVitroTranscription System for Peste des Petits Ruminant Virus

GAO Hua-feng，ZHAO Wen-hua，GAO Lin,YANG Shi-biao

(YunnanTropicalandSubtropicalAnimalViralDiseaseLaboratory,Kunming,Yunnan,650024,China)

In order to initiate the type of transcription pathways for PPRV,a PPRV minireplicon was constructed and its expression in transfected cells were studied.Backbone of pGEM3Z was used to clone the coding sequences of three genes of PPRV N,P,and L and finally named pGEM3Z-N,pGEM3Z-P,pGEM3Z-L respectively.The d-ribozyme,PPRV 5′genome promoters,3′antigenome promoters,T7 terminator,chloramphenicol acetyltransferase sequences were synthesized by artificial way and finally named pGEM3Z-CAT.These four plasmids were transfected into the cells by lipofectamine 2000 which infected VTF7-3 with T7 RNA polymerase.The expression of the target CAT protein was analyzed by indirect immune fluorescence and then by Western blot.The results showed that the cotransfection displayed that specific fluorescence can be observed in Vero cells and the protein can be detected by Western blot.The constructed PPRV minireplicon is able to replicate and transcribe,which provides a solid foundation for further PPRV studies by reverse genetics.

Peste-des-petits-ruminants virus;minireplicon;chloramphenicol acetyltransferase

2016-01-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160499)

高華峰(1973-)，男，云南宣威人，副研究員，主要從事動(dòng)物病毒學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.5

A

1007-5038(2016)10-0021-05