蘇力擔(dān)卡扎·仇曼，林海，何鐵英，程坤，王松，郝曉文，陳啟龍，韓瑋

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 胰腺外科，新疆 烏魯木齊 830054）

?

大鼠胰島細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

蘇力擔(dān)卡扎·仇曼，林海，何鐵英，程坤，王松，郝曉文，陳啟龍，韓瑋

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 胰腺外科，新疆 烏魯木齊 830054）

目的 探討胰島細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。方法 從實(shí)驗(yàn)室中挑選出30只成年雄性大鼠，將膠原酶注入大鼠的胰腺導(dǎo)管，聚蔗糖梯度離心法分離胰島細(xì)胞，并培養(yǎng)與鑒定胰島細(xì)胞。培養(yǎng)1周后用雙硫腙（DTZ）行胰島細(xì)胞鑒定。用丫啶橙（AO）、碘丙啶（PI）檢測(cè)胰島細(xì)胞活性。結(jié)果 經(jīng)過(guò)分離與純化，大鼠胰島細(xì)胞的獲得率較高且較穩(wěn)定；分離后的胰島細(xì)胞在適宜環(huán)境中生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)較佳，在培養(yǎng)后的12～24 h可貼壁，在培養(yǎng)后4～5 d細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)達(dá)到頂峰，細(xì)胞完好，且折光性能優(yōu)異。利用免疫組化法鑒定胰島細(xì)胞，分離的細(xì)胞SMA及PDGFR表達(dá)呈陽(yáng)性，少數(shù)細(xì)胞vWF表達(dá)呈陽(yáng)性。結(jié)論 我科此次分離純化大鼠胰島細(xì)胞的方法為逆行灌注膠原酶+原位消化+Ficoll液梯度分離法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯著，能在一定程度上獲取純度較高的大鼠胰島細(xì)胞。分離后的胰島細(xì)胞在培養(yǎng)4～5 d后達(dá)到最佳狀態(tài)，適用于作為實(shí)驗(yàn)室胰島細(xì)胞功能深入研究的實(shí)驗(yàn)材料。

胰島細(xì)胞；分離；培養(yǎng)；鑒定；大鼠

20世紀(jì)90年代末期以來(lái)，國(guó)內(nèi)及國(guó)外許多優(yōu)秀的醫(yī)學(xué)研究學(xué)者把實(shí)驗(yàn)室大鼠胰島細(xì)胞的分離與培養(yǎng)作為研究胰島細(xì)胞功能的一項(xiàng)重要科學(xué)課題［1-2］。該課題開展的原理為，通過(guò)研究大鼠胰島細(xì)胞的各種生化、生理機(jī)制，如細(xì)胞膜中陰、陽(yáng)離子通道的開啟與閉合會(huì)影響胰島細(xì)胞進(jìn)行多種激素的分泌及后續(xù)一系列的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，來(lái)進(jìn)行人類糖尿病發(fā)病因素與機(jī)制的深入性研究及合理有效降低糖尿病患者血糖濃度方式的新型研究方案的研發(fā)。雖然在很早以前就有分離實(shí)驗(yàn)室大鼠胰島細(xì)胞的方式，但由于以往醫(yī)學(xué)技術(shù)水平和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的限制，分離出來(lái)的胰島細(xì)胞純度并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的標(biāo)準(zhǔn)。除此之外，由于實(shí)驗(yàn)中多種外界因素和內(nèi)部因素的干擾，研究人員在每次取得胰島的產(chǎn)量并不固定，且在分離和培養(yǎng)過(guò)程中，胰島細(xì)胞的穩(wěn)定性較低也是限制實(shí)驗(yàn)取得完美結(jié)果的重要因素之一［3-5］。為了得到純度較高的可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的符合標(biāo)準(zhǔn)的胰島細(xì)胞，我科對(duì)大鼠胰島細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)、鑒定做了目的性研究，以下是關(guān)于此次試驗(yàn)的報(bào)道。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物來(lái)源及飼養(yǎng)方法

我科于2014年1月至2014年12月期間從新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心（許可證號(hào)scxk（新）2014-0004）購(gòu)進(jìn)30只成年雄性實(shí)驗(yàn)室大鼠。將大鼠置于恒溫為25 ℃的實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)，每日定時(shí)投喂水和食物，投喂原則為少量多次喂食。大鼠飼料與水的配比為1∶2，即大鼠進(jìn)食1g飼料要飲2 mL水（注：大鼠的飲水原則以城市居民飲水衛(wèi)生要求為最低標(biāo)準(zhǔn)）。在飼養(yǎng)過(guò)程中，每周更換墊料2次，以保證大鼠飼養(yǎng)期間的健康要求。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室每日進(jìn)行通風(fēng)，保證優(yōu)質(zhì)的空氣供應(yīng)，并設(shè)定12 h的日光燈照射模擬外界環(huán)境。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

聚蔗糖Ficoll 400，10 g/支，生興生物技術(shù)（南京）有限公司；膠原酶V，25 mg/支，北京方程生物科技有限公司；胰蛋白酶，2 000 U/g，東恒華道生物科技有限公司；DNase I，規(guī)格為15 KU，上海前塵生物有限公司，產(chǎn)地瑞典。雙硫腙（DTZ）、丫啶橙（AO）、碘丙啶（PI），Sigma公司。

1.3胰島分離與純化

30只雄性大鼠在實(shí)驗(yàn)前12 h給予禁食，予10％水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，消毒后于大鼠腹腔做一縱行切線，于該切線下刀逐層鈍性剝離腹腔軟組織。當(dāng)?shù)竭_(dá)腹腔后，可見到被腹膜覆蓋的剛臟和部分胰腺組織。將表面筋膜、脂肪等軟組織剝離后暴露肝臟、部分胰腺及周圍臟器等。操作人員在胰管十二指腸的腸壁部分取1號(hào)泰絲線作結(jié)扎，結(jié)扎完畢后，將導(dǎo)管從胰膽管開口處—十二指腸乳頭逆行插入至胰膽管。之后將留置針置入膽管內(nèi)部約1 cm處，并夾閉膽管的近肝端。大鼠心臟放凈全身血液后，在置入胰腺膽管的導(dǎo)管內(nèi)逆行注射入膠原酶V，待胰腺反應(yīng)完成至水腫膨脹后，立即將胰腺摘除置入提前冷卻完畢的裝有Hanks液的消化瓶中。將含有胰腺的消化液置于38 ℃的恒溫水浴箱中靜置約10 min，取出消化瓶水平震蕩，待瓶中溶液變?yōu)榧?xì)沙狀方可停止。之后加入4 ℃的牛血清和Hanks液中終此繼續(xù)消化。操作人員用濾網(wǎng)對(duì)含有胰腺細(xì)胞的消化液進(jìn)行過(guò)濾，將濾過(guò)的消化液進(jìn)行離心處理，轉(zhuǎn)速為1 000 r/min，取下層沉淀物又加入與先前相同的Hanks液洗滌，相同步驟洗滌一次，再加入消化液后將平分到兩個(gè)試劑瓶中，再次離心，設(shè)定離心指標(biāo)與之前相同。取沉淀物加入濃度為25％的Ficoll 400溶液攪拌均勻，按濃度梯度從高至低分別添加23％、20％、11％的Ficoll 400溶液及Hanks液2 mL，離心處理，轉(zhuǎn)速為3 000轉(zhuǎn)/min，離心溫度為4 ℃，時(shí)間為20 min，之后分別吸出位于11％～20％和20％～23％界面的胰島細(xì)胞［6］，再次加入Hanks液后置入50 mL離心裝置中離心2次，再次洗滌，留待以下操作。

1.4胰島細(xì)胞的培養(yǎng)

將前個(gè)步驟獲取的胰島放入5 mL的含有2 mmol/L的Hanks液燒杯中，并將燒杯置于水溫為37 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床中，時(shí)間為10 min。之后將轉(zhuǎn)速調(diào)為100 r/min進(jìn)行離心處理，時(shí)間為2 min，取下層沉淀液。操作人員向下層沉淀液添加酶液，充分反應(yīng)4 min后，讓其自然靜置1 min。用滴管吸取頂層少量消化液置于另一離心器中，再添加同等體積的酶液。以上步驟進(jìn)行3次方可將胰島組織分離為數(shù)個(gè)單細(xì)胞。離心機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)指標(biāo)設(shè)定：轉(zhuǎn)速為1 000 r/min，時(shí)間為5 min。下層沉淀物取Hanks液洗滌，重復(fù)2次。再次離心，離心機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)指標(biāo)設(shè)定：轉(zhuǎn)速為600 r/min，時(shí)間為8 min。取0.5 mL的消化液及底部細(xì)胞，混合充分反應(yīng)并輕擊瓶身使得細(xì)胞懸浮在瓶體中而不沉底，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)成分含有濃度為10％的牛血清、相同濃度的谷氨酰胺及100 U/mL的雙抗培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：37 ℃、CO25％。

1.5胰島細(xì)胞的鑒定

以上步驟結(jié)束后，按以下步驟對(duì)胰島細(xì)胞進(jìn)行鑒定：（1）將所獲取的胰島細(xì)胞用甲醛溶液進(jìn)行固定；（2）Triton X-100溶液10 min；（3）用PBS溶液對(duì)胰島細(xì)胞沖洗，牛血清30 min；（4）按1∶100的比例分別添加PDGFR（血小板衍生生長(zhǎng)因子受體）、SMA（抗平滑肌抗體），存放于4 ℃冰箱中，時(shí)間為24 h；（5）再次用PBS溶液對(duì)胰島細(xì)胞沖洗，按1∶1 000比例加入驢抗兔IgG，之后置于37 ℃水浴箱中，時(shí)間為1 h，過(guò)程中嚴(yán)密避光；第3次用PBS溶液對(duì)胰島細(xì)胞沖洗。采用丫啶橙（AO）和碘丙啶（PI）雙熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料使用（±s）表示，組間比較應(yīng)用方差分析；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，應(yīng)用x2檢驗(yàn)進(jìn)行兩組比較；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1胰島分離、純化效果

將胰島制備物玻片與DTZ溶液混合后發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)玻片中，約有80％的細(xì)胞團(tuán)塊紅染，這是實(shí)驗(yàn)得到的分離純化完整或不完整的胰島細(xì)胞成品；每只大鼠胰島培養(yǎng)前獲得的胰島細(xì)胞數(shù)量為（381±39）個(gè)。見圖1。

2.2胰島細(xì)胞培養(yǎng)情況

在培養(yǎng)開始后的12～24 h，胰島細(xì)胞開始貼附至培養(yǎng)器皿表面，此階段的接種細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好（見圖2）；培養(yǎng)開始后的48～72 h，接種的細(xì)胞處于迅速繁殖階段；培養(yǎng)開始后的96～120 h（4～5 d），接種的胰島細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖狀態(tài)達(dá)到頂峰，此時(shí)，細(xì)胞膜完好無(wú)破損，且細(xì)胞折光性能優(yōu)異（見圖3）；培養(yǎng)開始后的6 d起，不能緊密貼附至培養(yǎng)器皿表面的胰島細(xì)胞開始增多，細(xì)胞大體形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)異常，表明大多數(shù)細(xì)胞已結(jié)束生長(zhǎng)狀態(tài)。該階段過(guò)后，細(xì)胞基本步入死亡階段，細(xì)胞萎縮，內(nèi)部結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)一些列變化，死亡的胰島細(xì)胞日益增加，存活的胰島細(xì)胞數(shù)量不斷下降。

2.3胰島細(xì)胞的活性

將純化的胰島用AO/PI染色，在熒光顯微鏡下見胰島細(xì)胞團(tuán)均呈亮綠色熒光，證明胰島細(xì)胞存活良好。見圖4。

2.4不同狀態(tài)下分離的胰島細(xì)胞數(shù)量

將酶濃度和反應(yīng)時(shí)間作為變量，比較不同酶濃度下分離胰島細(xì)胞的數(shù)量。從實(shí)驗(yàn)可見，反應(yīng)時(shí)間10 min、酶濃度1.7 mg/mL組可獲得較高數(shù)量胰島細(xì)胞，反應(yīng)時(shí)間20 min及30 min時(shí)，在酶濃度0.5 mg/mL組胰島細(xì)胞獲得率均較高。反應(yīng)時(shí)間為20 min時(shí)不同酶濃度組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），反應(yīng)時(shí)間為10 min及30 min時(shí)三組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。具體見表1。

2.5胰島細(xì)胞免疫組化鑒定

分離的胰島細(xì)胞SMA、PDGFR表達(dá)呈陽(yáng)性，少數(shù)細(xì)胞血管性血友病因子（vWF）表達(dá)呈陽(yáng)性，提示分離出的細(xì)胞中可能存在少量的血管內(nèi)皮細(xì)胞。見圖5～7。

圖1　DTZ染色胰島細(xì)胞（×20）

圖 2胰島細(xì)胞培養(yǎng)24 h圖片（×20）

圖3　胰島細(xì)胞培養(yǎng)5 d圖片（×20）

圖4　AO/PI染色胰島細(xì)胞（×20）

表1　不同狀態(tài)下胰島分離的數(shù)量

3 討論

胰腺是人體重要的消化器官之一，按分泌功能可分為內(nèi)、外兩種腺體組成部分。胰腺的外分泌部分主要由胰腺腺泡和胰腺導(dǎo)管組成，胰腺的內(nèi)分泌腺主要由胰島組成。目前，在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行胰島移植研究課題的主要困難為胰島細(xì)胞來(lái)源少。雖然在醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中有報(bào)道，在一定的體外條件下，研究人員可利用胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞獲取胰島細(xì)胞［7-9］。實(shí)際上，在現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)模式中從胰腺器官中分離提純出胰島仍是獲取的主要途徑。

本實(shí)驗(yàn)中的胰島細(xì)胞活力、狀態(tài)均較良好。通過(guò)一系列的Hanks液、膠原酶消化等步驟獲取了高濃度、高活性、功能良好的胰島細(xì)胞。通過(guò)此次試驗(yàn)總結(jié)了以下幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：（1）摘除胰島的整個(gè)過(guò)程一定要快、狠、準(zhǔn)，徹底地清楚淋巴、神經(jīng)、血管等軟組織，且操作輕柔，不能損傷胰島。如此一來(lái)，才能保證胰島的純度和產(chǎn)量，避免外界因素的影響導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他參考文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)有出入或達(dá)不到預(yù)期水平。（2）在實(shí)驗(yàn)中，利用消化液逆行灌注導(dǎo)管進(jìn)行胰腺消化仍是分離胰島細(xì)胞的有效方式。本研究選擇Hanks消化液消化胰腺，胰腺外分泌部位的腺泡可經(jīng)此遭到破壞。研究未直接利用膠原酶進(jìn)行該步驟的原因?yàn)?，后者屬于生物酶，?duì)待溫度、pH、時(shí)間都需有嚴(yán)格的要求。消化過(guò)深和消化不足都會(huì)影響胰島細(xì)胞的的得率。（3）一定程度的消化胰腺組織可使實(shí)驗(yàn)成功率提升，然而，國(guó)內(nèi)目前尚沒(méi)有對(duì)消化程度有統(tǒng)一的規(guī)定。在消化的過(guò)程中，影響細(xì)胞得率關(guān)鍵的一點(diǎn)是要減少膠狀物的形成，如此一來(lái)，必須嚴(yán)格把控時(shí)間、溫度和溶液的pH值。本研究發(fā)現(xiàn)，消化液與胰腺的體積比必須大于5∶1，且在反應(yīng)完成時(shí)，消化液剩余的量必須超過(guò)胰腺。（4）本次實(shí)驗(yàn)純化后胰島細(xì)胞可達(dá)90％以上，而在純化前則不足50％，表明用本實(shí)驗(yàn)可有效提高胰島細(xì)胞獲得率。接種的胰島細(xì)胞在培養(yǎng)4～5 d后狀態(tài)達(dá)到最佳，而往后，胰島細(xì)胞便逐漸走向死亡，這提示可使用分離純化的方式獲取接種細(xì)胞，進(jìn)行目的性實(shí)驗(yàn)。

圖5　SMA表達(dá)（AO/PI染色，×400）

圖7　vWF表達(dá)（AO/PI染色，×400）

［1］ OBERHOLZER J， TOSO C， RIS F， et al. Beta cell replacement for the treatment of diabetes ［J］. Ann N Y Acad Sci，2001， 944: 373-387.

［2］ DUFRANE D， GOEBBELS R M， GUIOT Y， et al. A simple method using a polymethylpenten chamber for isolation of human pancreatic islets ［J］. Pancreas， 2005， 30（3）: 51-59.

［3］ 葉叢叢, 傅紅興, 江玲, 等. 一種快速分離純化小鼠胰島的方法 [J]. 肝膽胰外科雜志, 2014, 26(5): 403-405.

［4］ 傅紅興, 李慧, 江玲, 等. 裸鼠糖尿病模型的建立及皮下異種胰島移植研究 [J]. 肝膽胰外科雜志, 2013, 25(3): 225-228.

［5］ 江玲, 傅紅興, 張偉, 等. 家兔胰島分離純化方法的改進(jìn) [J].肝膽胰外科雜志, 2015, 27(1): 34-36.

［6］ 丁和遠(yuǎn), 徐東麗, 王芳, 等. SD大鼠原代胰島細(xì)胞分離、純化及培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn) [J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2014, 14(15): 2816-2822.

［7］ 楊永生, 孫寶震, 解英俊, 等. 大鼠胰島分離純化方法的改進(jìn) [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2006, 10(12): 1486-1488.

［8］ HADJIVASSILIOU V， GREEN M H， GREEN I C. Immunomagnetic purification of beta cells from rat islets of Langerhans［J］. Diabetologia， 2000， 43（9）: 1170-1177.

［9］ 鄧秀玲, 陳璐璐, 袁莉, 等. 一種改良的大鼠胰島細(xì)胞原代培養(yǎng)方法 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 16(7): 1025-1027, 1036.

（本文編輯：魯翠濤）

Isolation， culture and identification of islet cells in rats

Sulidankazha·Chouman， LIN Hai， HE Tieying， CHENG Kun， WANG Song， HAO Xiao-wen， CHEN Qi-long， HAN Wei. Department of Pancreatic Surgery， The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China

Objective To study the isolation， culture and identification of islet cells in rats. Methods A total of 30 adult male rats were selected from the lab， the collagenase was retrogradely perfused into rats pancreatic duct. Islet cells were isolated by Ficoll liquid gradient centrifugation， and then for further cultivation and identification. Dithizone （DTZ） was used for islet cell identification after 1 week of culture. Cell activity was detected with Acridine orange and Iodide iodide. Results After separation and purification， the obtain rate of rat islet cells was high and stable. Islet cells achieved a good growth status in the appropriate environment， attached the wall in 12 to 24 h， and reached the growth peak in 4～5 d of culture. The cells were intact， with excellent refraction performance. Immunohistochemical identification showed positive expression of SMA and PDGFR， and positive expression of vWF in a few cells. Conclusion In this study， retrograde perfusion of collagenase in situ+Ficoll liquid gradient separation can obtain high purity of islet cells in rats. Islet cells achieve the best condition in 4～5 d of culture， which can be suitable for further laboratory study.

islet cells； isolation； culture； identification； rats

Q813

A DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.05.010

2016-02-22

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金聯(lián)合基金（2016DO1C272）。

蘇力擔(dān)卡扎·仇曼（1982-），新疆烏魯木齊人，主治醫(yī)師，碩士。

簡(jiǎn)介］韓瑋，主任醫(yī)師，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，E-mail：13999846637@139.com。