楊　治　張　銘　劉　林　彭　侃　許　鵬

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會(huì)醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，陜西西安710054

膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿和關(guān)節(jié)滑液中microRNA-365的表達(dá)水平及其臨床意義

楊治張銘劉林彭侃許鵬▲

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會(huì)醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，陜西西安710054

目的探討膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）患者血漿和關(guān)節(jié)滑液中microRNA-365（miR-365）的表達(dá)水平及其臨床意義。方法選取2015年5月～2016年5月在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會(huì)醫(yī)院住院治療的52例膝骨關(guān)節(jié)炎患者和43例膝關(guān)節(jié)半月板損傷患者作為研究對(duì)象，采用定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)患者血漿和關(guān)節(jié)滑液中miR-365的表達(dá)水平，并統(tǒng)計(jì)分析膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿和關(guān)節(jié)滑液中miR-365的表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿、關(guān)節(jié)滑液中miR-365水平分別為（1.69±0.42）、（1.44±0.36），膝關(guān)節(jié)半月板損傷患者血漿、關(guān)節(jié)滑液中miR-365水平分別為（1.28±0.27）、（1.25±0.19），二者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。相關(guān)分析顯示膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿中miR-365水平與關(guān)節(jié)滑液中的水平之間呈正相關(guān)（r=0.631，P<0.05）。結(jié)論膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿、關(guān)節(jié)滑液中miR-365水平增高，提示miR-365可能參與了膝骨關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程。

骨關(guān)節(jié)炎；微小RNA；血漿；關(guān)節(jié)滑液

［Abstract］Objective To detect the plasm and joint synovia levels of microRNA-365（miR-365）in the patients with knee osteoarthritis and explore their clinical significances.Methods 52 patients with knee osteoarthritis and 43 patients with knee joint meniscus injury in Hong Hui Hospital，Xi'an Jiaotong University College of Medicine from May 2015 to May 2016 were enrolled in the study.The plasm and joint synovia levels of miR-365 were detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.The relationships between the plasm and joint synovia levels of miR-365 in patients with knee osteoarthritis were analyzed.Results The plasma levels of miR-365 in the patients with knee osteoarthritis（1.69±0.42）were statistically higher than those in the patients with knee joint meniscus injury（1.28±0.27）（P<0.01）.Compared with the patients with knee joint meniscus injury（1.25±0.19），the joint synovia levels of miR-365 in the patients with knee osteoarthritis（1.44±0.36）were statistically higher（P<0.01）.The plasm levels of miR-365 were positive correlation with joint synovia levels（r=0.631，P<0.05）.Conclusion The plasm and joint synovia levels of miR-365 increase in the patients with knee osteoarthritis.miR-365 may involve in the pathology of knee osteoarthritis.

［Key words］Osteoarthritis；MicroRNA；Plasm；Joint synovia

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種伴隨疼痛和膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)障礙的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，主要病理改變是膝關(guān)節(jié)軟骨面的退行性變和繼發(fā)性的骨質(zhì)增生。原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病原因目前尚不清楚，可能是多因素綜合作用的結(jié)果，增齡、肥胖、勞損、創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)先天性異常、關(guān)節(jié)畸形等諸多因素與原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病有關(guān)［1-5］。膝骨關(guān)節(jié)炎無(wú)特異的治療方式，主要是減少關(guān)節(jié)的負(fù)重和過(guò)度的大幅度活動(dòng)，以延緩病變的進(jìn)程［6-8］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種長(zhǎng)度為22個(gè)左右核苷酸的非編碼單鏈小RNA，參與轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控，在細(xì)胞分化、生物發(fā)育及各種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［9-10］。研究表明多種miRNAs在骨關(guān)節(jié)炎中表達(dá)異常，在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用［11-16］，Xu等［17］通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的miR-365的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常的軟骨細(xì)胞。為了進(jìn)一步研究miR-365在骨關(guān)節(jié)炎中的作用，本研究利用定量聚合酶鏈反應(yīng)（transcription polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)52例膝骨關(guān)節(jié)炎患者和43例膝關(guān)節(jié)半月板損傷患者血漿和關(guān)節(jié)滑液中miR-365的表達(dá)水平，旨在初步探討miR-365在膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2015年5月～2016年5月在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會(huì)醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）關(guān)節(jié)外科住院治療的膝骨關(guān)節(jié)炎患者52例，其中男24例，女28例，年齡45～72歲，平均（61.24±11.63）歲，所有患者診斷均符合1986年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)［18］，排除標(biāo)準(zhǔn)：合并腫瘤、自身免疫性疾病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、血液系統(tǒng)疾病、炎癥性疾病及嚴(yán)重心肝腎疾病。同期在我院關(guān)節(jié)外科住院治療的43例外傷導(dǎo)致的單純膝關(guān)節(jié)半月板損傷患者為對(duì)照組，其中男20例，女23例，年齡40～67歲，平均（57.71±10.36）歲，排除標(biāo)準(zhǔn)：合并骨關(guān)節(jié)炎、腫瘤、自身免疫性疾病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、血液系統(tǒng)疾病、炎癥性疾病及嚴(yán)重心肝腎疾病。兩組研究對(duì)象性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)并得到所有研究對(duì)象知情同意。

1.2試劑與儀器

miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒、內(nèi)參照U6（CD201-0145）及miR-365（CD201-0367）引物均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3方法

1.3.1樣本采集所有膝骨關(guān)節(jié)炎和膝關(guān)節(jié)半月板損傷患者均在治療前空腹采集EDTA抗凝血5.0 mL，并在膝關(guān)節(jié)穿刺時(shí)采集關(guān)節(jié)滑液500 μL。血液及關(guān)節(jié)滑液分別在室溫下2500 r/min及3000 r/min離心10 min，分離上層血漿或關(guān)節(jié)滑液至EP管中，4℃12000 r/min再次離心10 min，分別吸取上清至新的EP管中，置于-80℃保存。

1.3.2血漿及關(guān)節(jié)滑液中miR-365水平的檢測(cè)取200 μL血漿或關(guān)節(jié)滑液，采用miRcute miRNA提取分離試劑盒提取總RNA，提取的RNA溶解于20 μL DEPC水中，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。利用紫外分光光度儀測(cè)定提取的RNA液的OD260、OD280值，二者比值在1.8～2.1范圍的RNA為合格，可用于下一步的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。利用miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，20 μL的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括2 μL RNA、10 μL 2× miRNA RT反應(yīng)緩沖液、2 μL miRNA逆轉(zhuǎn)錄酶、6 μL無(wú)RNA酶水，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃60 min、95℃3 min，合成的cDNA放置于-20℃保存待用。采用內(nèi)參照U6（CD201-0145）及miR-365（CD201-0367）引物及miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，20 μL PCR反應(yīng)體系具體如下：10 μL 2×miR-cute Plus miRNA Premix、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、1 μL cDNA、2 μL 50×ROX Reference Dye、6.2 μL雙蒸水，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，94℃20 s、60℃34 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本的每個(gè)基因均設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，擴(kuò)增結(jié)束后自動(dòng)獲得循環(huán)閾值即Ct值，基因表達(dá)水平采用2-△△Ct進(jìn)行分析，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt（目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct）-對(duì)照組ΔCt（目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 16.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用檢驗(yàn)，膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿與關(guān)節(jié)滑液中miR-365水平的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)法進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1膝骨關(guān)節(jié)炎與膝關(guān)節(jié)半月板損傷患者血漿、關(guān)節(jié)滑液中miR-365水平的比較

定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與膝關(guān)節(jié)半月板損傷患者血漿、關(guān)節(jié)滑液中miR-365水平比較，膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿、關(guān)節(jié)滑液中miR-365水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿中miR-365水平明顯高于關(guān)節(jié)液中的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而膝關(guān)節(jié)半月板損傷患者血漿、關(guān)節(jié)液中miR-365水平的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1　2組研究對(duì)象血漿、關(guān)節(jié)滑液中miR-365水平的比較（?）

2.2膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿與關(guān)節(jié)滑液中miR-365水平的相關(guān)性

相關(guān)分析顯示膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿中miR-365水平與關(guān)節(jié)滑液中的水平之間呈正相關(guān)（r=0.631，P< 0.05）。

3　討論

骨關(guān)節(jié)炎是多種原因引起的關(guān)節(jié)軟骨退化損傷、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生，臨床主要表現(xiàn)為緩慢發(fā)展的關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、僵硬、關(guān)節(jié)腫脹、活動(dòng)受限和關(guān)節(jié)畸形等。X線表現(xiàn)為關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨下骨質(zhì)致密，骨小梁斷裂，有硬化和囊性變，關(guān)節(jié)邊緣有唇樣增生，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，增齡、肥胖、勞損、創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)先天性異常、關(guān)節(jié)畸形等諸多因素與原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病有關(guān)［1-5］。

在細(xì)胞核內(nèi)miRNA前體在RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄成pri-miRNA，然后由核酸酶Drosha裂解成pre-miRNA后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，在核酸酶Dicer的作用下形成成熟的miRNA，miRNA主要通過(guò)與靶基因mRNA的3’UTR結(jié)合導(dǎo)致靶基因降解或者抑制靶基因的表達(dá)，從而在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷靶基因的表達(dá)，在機(jī)體的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及發(fā)育等生理過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。越來(lái)越多的研究證實(shí)miRNA參與了腫瘤性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及其他疾病的病理過(guò)程［9-10］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與了成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的增殖、凋亡及分化，在骨代謝、骨重建、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及骨肉瘤等生理病理過(guò)程發(fā)揮重要作用［19-21］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miR-16、miR-22、miR-34a、miR-146a等在骨關(guān)節(jié)炎組織中高表達(dá)，可能發(fā)揮促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎作用，而miR-27b、miR-125b、miR-140等在骨關(guān)節(jié)炎中低表達(dá)，可能在骨關(guān)節(jié)炎過(guò)程中起保護(hù)作用［11-17］。

miR-365基因定位16p13.12，miR-365的功能非常復(fù)雜，目前對(duì)miR-365的研究主要是集中在惡性腫瘤，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miR-365在結(jié)腸癌、肺癌、肝癌、惡性黑色素瘤、兒童白血病、浸潤(rùn)性導(dǎo)管胰腺癌及胃癌等腫瘤組織或細(xì)胞系中表達(dá)異常，miR-365在不同腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用［22-24］。Xu等［17］利用定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞miR-365的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常的軟骨細(xì)胞，同時(shí)在大鼠的骨關(guān)節(jié)炎模型中得到了驗(yàn)證。外周循環(huán)的miRNA可以與蛋白結(jié)合成復(fù)合體，不易被RNA酶降解，可以非常穩(wěn)定地存在，體液中miRNA的濃度較高，可以達(dá)到作為生物標(biāo)志物的檢測(cè)濃度，同時(shí)由于體液取材方便，miRNA是理想的生物標(biāo)志物［25］。有學(xué)者利用定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺患者血清中miR-365表達(dá)水平明顯降低，與肺癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)［23］。目前研究發(fā)現(xiàn)miR-16、miR-132、miR-146a、miR-155、miR-223等多種miRNAs在骨關(guān)節(jié)炎患者血漿或關(guān)節(jié)滑液中表達(dá)異常［26-28］。本研究采用定量PCR檢測(cè)了膝骨關(guān)節(jié)炎患者和膝關(guān)節(jié)半月板損傷患者血漿和關(guān)節(jié)滑液中miR-365的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿、關(guān)節(jié)滑液中miR-365水平均明顯高于膝關(guān)節(jié)半月板損傷患者（P<0.01），與Xu等［17］在骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞中的研究結(jié)果一致，研究結(jié)果提示膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中患者血漿及關(guān)節(jié)滑液中miR-365的水平不斷增高，可能在疾病的病理進(jìn)程中發(fā)揮了一定的作用。研究還發(fā)現(xiàn)膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿中miR-365水平明顯高于關(guān)節(jié)液中的水平，進(jìn)一步的相關(guān)分析顯示膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿中miR-365水平與關(guān)節(jié)滑液中的水平之間呈正相關(guān)，提示膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿、關(guān)節(jié)滑液中miR-365的來(lái)源可能相同，但有關(guān)miR-365的具體來(lái)源有待于進(jìn)一步研究。由于膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿及關(guān)節(jié)滑液中miR-365可以穩(wěn)定存在、濃度較高且與病理過(guò)程有關(guān)，可以作為膝骨關(guān)節(jié)炎的一種生物標(biāo)志物。

綜上所述，膝骨關(guān)節(jié)炎患者血漿、關(guān)節(jié)滑液中miR-365水平增高，血漿中miR-365水平與關(guān)節(jié)滑液中的水平之間呈正相關(guān)，提示miR-365參與了膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，隨著對(duì)miR-365在膝骨關(guān)節(jié)炎中的研究深入，miR-365有可能成為膝骨關(guān)節(jié)炎診斷、預(yù)后及治療的新靶點(diǎn)。

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Expression and clinical significances of microRNA-365 in plasm and joint synovia of patients with knee osteoarthritis

YANG Zhi ZHANG Ming LIU Lin PENG Kan XU Peng▲
Department of Joint Surgery，Hong Hui Hospital，Xi'an Jiaotong University College of Medicine，Shaanxi Province，Xi'an710054，China

R684.3

A

1674-4721（2016）09（c）-0103-04

2016-05-20本文編輯：趙魯楓）

陜西省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013K12-17-03）；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（SJ08-ZT12-6）。