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        樟芝適宜的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方研究

        2016-10-20 15:07:57王麗星黃志偉鄭亞鳳
        江蘇農業(yè)科學 2016年7期
        關鍵詞:樟芝菌絲體

        王麗星 黃志偉 鄭亞鳳

        摘要:研究了珍貴藥用菌——樟芝(Antrodia camphorata)液體發(fā)酵適宜的碳源、氮源、碳氮比及其所需的礦質元素、微量元素、維生素。結果表明:樟芝菌絲生長的最適無機氮源為酒石酸銨;最適有機氮源為麩皮;最適天然碳源為米粉,且以天然多糖類物質(木薯粉除外)為碳源處理的菌絲產量明顯高于單糖、雙糖、化學制劑多糖處理,而葡萄糖是僅次于天然多糖類物質的碳源;菌絲生長適宜的碳氮比為(20~50) ∶ 1;K、P、Mg、S、Na、Ca均為菌絲生長必需的礦質元素;微量元素Fe、B、Zn、Mn、Mo、Cu、Co均對樟芝菌絲生長有一定抑制作用,其中Fe、B元素的抑制作用最顯著;添加維生素對菌絲生長無顯著影響。

        關鍵詞:樟芝;菌絲體;液體發(fā)酵;培養(yǎng)基配方

        中圖分類號: S188+.4 文獻標志碼: A 文章編號:1002-1302(2016)07-0236-03

        樟芝(Antrodia camphorata)屬于多孔菌科、薄孔菌屬[1],別稱牛樟菇、牛樟芝、樟內菇、紅樟菰等,為中國臺灣特有的珍貴藥用真菌[2]。樟芝僅寄生在臺灣特有樹種牛樟(Cinnamomum comphora)的樹干上[3],具有抗腫瘤、增加免疫力、抗菌、抗病毒、抗過敏、抗高血壓、降血糖、降膽固醇、抑制血小板凝集及保護肝臟等生理功能[4]。目前野生樟芝數量很少,而且尚未能進行其子實體的人工栽培,所以采用液體發(fā)酵培養(yǎng)樟芝的菌絲體是最環(huán)保的樟芝獲取途徑,并且菌絲體的效果接近子實體[5]。劉華等研究了樟芝液體發(fā)酵培養(yǎng)條件,采用的培養(yǎng)基配方為40 g/L葡萄糖、6 g/L豆餅粉、1 g/L K2HPO4、100 mg/L 維生素B1,pH值自然,接種量為20%,裝液量為100 mL/250 mL三角瓶,轉速100 r/min,26 ℃恒溫培養(yǎng)6 d后,胞內的三萜產量達 152.5 mg/L[6]。黃大斌等在電子顯微鏡下觀察了樟芝的菌絲體、子實體、分生孢子,并在瓊脂培養(yǎng)基上研究了不同碳源、氮源對樟芝菌絲生長的影響,結果發(fā)現(xiàn)樟芝菌絲生長最適溫度為28 ℃,木屑培養(yǎng)基的最適含水量為58.5%,最適碳源為2%葡萄糖,最適氮源為0.2%檸檬酸銨[7]。黃志偉等對樟芝菌絲體的固體培養(yǎng)特性進行了研究,結果表明以雜木屑、麥皮(或稻草粉)為主料的培養(yǎng)基均可培養(yǎng)出生長良好的樟芝菌絲,菌絲生長適宜的PDA 培養(yǎng)基pH 值為4~8,在木屑培養(yǎng)基中添加3%~5%的過磷酸鈣可促進菌絲生長,光照和黑暗條件下菌絲的生長速度沒有顯著差異,但在黑暗條件下菌絲長勢較好,分生孢子較多[8]。宋愛榮對樟芝液體培養(yǎng)的碳源、氮源分別進行了研究,結果表明碳源以麥芽糖利用效果最佳,有機氮比無機氮的利用效果更好,其中以酵母膏最佳[9-10]。陳娟等以樟芝菌絲生物量、三萜、多糖為響應指標,利用Plackett-Burman法篩選樟芝液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源,結果顯示,最有利于提高樟芝菌絲生物量的碳源、氮源為葡萄糖、可溶性淀粉、酵母粉,最有利于提高樟芝多糖含量的碳源、氮源為可溶性淀粉、麩皮,而最有利于提高樟芝三萜含量的碳源為麥芽糖[11]。凌慶枝等研究表明,樟芝對不同無機鹽離子需求不同,對鉀鹽需求量大,對鈉鹽、鐵鹽、鎂鹽、銅鹽需求量少[12]。本研究探討了適宜樟芝液體發(fā)酵的碳源、氮源、碳氮比及其所需的礦質元素和微量元素等,以期為深入研究樟芝的液體發(fā)酵工程技術奠定基礎。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 供試菌株 樟芝菌株Ac-A,由福建農林大學菌物研究中心提供。

        1.1.2 供試培養(yǎng)基配方

        1.1.2.1 研究不同氮源對樟芝菌絲生長影響的培養(yǎng)基配方 基礎培養(yǎng)基配方:3%葡萄糖、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、5 mg/L 維生素B1,pH值自然。添加的無機氮種類為硫酸銨、氯化銨、磷酸氫二銨、酒石酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣、硝酸銨;有機氮種類為蛋白胨、大豆粉、麩皮、玉米粉。氮源添加量為0.032 g N/100 mL無機氮、0.2%蛋白胨、5%天然有機氮。

        1.1.2.2 研究不同碳源對樟芝菌絲生長影響的培養(yǎng)基配方 基礎培養(yǎng)基配方:0.032%(以氮含量計算)酒石酸銨、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、5 mg/L維生素B1、pH值自然。添加的碳源種類為葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、可溶性淀粉、微晶纖維素、玉米粉、面粉、米粉、甘薯粉、木薯粉。碳源添加量為2%。

        1.1.2.3 研究不同碳氮比對樟芝菌絲生長影響的培養(yǎng)基配方 基礎培養(yǎng)基配方:2%葡萄糖、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、5 mg/L 維生素B1,pH值自然。分別在基礎培養(yǎng)基中添加不同質量的酒石酸銨以調節(jié)培養(yǎng)基的C/N。

        1.1.2.4 研究不同礦質元素對樟芝菌絲生長影響的培養(yǎng)基配方 基礎培養(yǎng)基配方:2%葡萄糖、0.211%酒石酸銨、5 mg/L 維生素B1,pH值自然。按表1在基礎培養(yǎng)基中添加各種試劑,配制出6種缺素培養(yǎng)基和1種對照培養(yǎng)基。

        1.1.2.5 研究不同微量元素對樟芝菌絲生長影響的培養(yǎng)基配方 基礎培養(yǎng)基配方:2%葡萄糖、0.211%酒石酸銨、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O,pH值自然,用重蒸餾水配制1 L基礎培養(yǎng)基后,加入15 g CaCO3,在121 ℃下滅菌20 min,冷卻后過濾除去微量元素,隨后加入5 mg 維生素B1,并按表2添加各種微量元素。

        1.1.2.6 研究不同維生素對樟芝菌絲生長影響的培養(yǎng)基配方 基礎培養(yǎng)基配方:2%葡萄糖、0.211%酒石酸銨、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O,pH值自然。添加的維生素種類為生物素、核黃素、硫胺素、尼古丁酸、葉酸、抗壞血酸,對照不添加任何維生素。維生素添加量為50 μg/L。

        1.2 方法

        1.2.1 不同氮源對樟芝菌絲生長的影響 將培養(yǎng)基分裝于250 mL三角瓶中(100 mL/瓶),每個處理4瓶,在121 ℃下滅菌30 min。接種時,先將樟芝斜面菌種放入盛有無菌水的三角瓶中,用分散器攪拌勻漿,使之成為均勻的菌液。然后用移液槍吸取菌液接種于各瓶培養(yǎng)基中(1 mL菌液/100 mL),接種后置于搖床上振蕩培養(yǎng)(26 ℃、120 r/min )20 d。用紗布和40目土樣篩過濾樟芝菌絲,分別盛入已于105 ℃下烘至恒質量的坩堝,再將坩堝置于105 ℃烘箱中烘至恒質量后,測定菌絲干質量。然后用SAS 軟件 對數據進行方差分析與顯著性測驗。

        1.2.2 不同碳源、礦質元素、微量元素、維生素對樟芝菌絲生長的影響 參照“1.2.1”節(jié)的方法進行培養(yǎng)基的分裝、滅菌、接種、培養(yǎng)、測定菌絲干質量等。

        1.2.3 不同碳氮比對樟芝菌絲生長的影響 設置8個C/N,即 5 ∶ 1、10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、30 ∶ 1、50 ∶ 1、75 ∶ 1、100 ∶ 1,在基礎培養(yǎng)基中添加酒石酸銨調節(jié)培養(yǎng)基的C/N,酒石酸銨添加量依次為16.03、6.35、3.96、2.88、1.86、1.09、0.72、0.54 g/L。然后參照“1.2.1”節(jié)的方法進行培養(yǎng)基的分裝、滅菌、接種、培養(yǎng)、測定菌絲干質量等。

        2 結果與分析

        2.1 不同氮源對樟芝菌絲生長的影響

        2.1.1 無機氮對樟芝菌絲生長的影響 由圖1可見,不同氮源處理下菌絲產量差異較大,說明樟芝對氮源種類的要求較為嚴格。不同氮源處理下樟芝菌絲產量高低排序為蛋白胨(有機氮)>銨態(tài)氮>硝態(tài)氮,差異明顯。以硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣為氮源時,菌絲產量與對照無明顯差異,說明樟芝不能利用硝態(tài)氮。硝酸銨既可以提供硝態(tài)氮,也可提供銨態(tài)氮,其菌絲產量比硝態(tài)氮高,但比銨態(tài)氮低,說明NO-3可能抑制樟芝菌絲生長。樟芝菌絲生長最適宜的無機氮源為酒石酸銨。

        2.1.2 有機氮對樟芝菌絲生長的影響 由圖2可見,不同有機氮源處理下樟芝菌絲產量高低順序為麩皮>大豆粉>玉米粉>蛋白胨>無氮對照,差異明顯。以麥皮為氮源時,其菌絲產量是蛋白胨處理的5倍,是最適于樟芝菌絲生長的氮源。

        2.2 不同碳源對樟芝菌絲生長的影響

        從圖3可以看出,以天然多糖類物質為碳源處理的菌絲產量明顯高于雙糖、單糖。以米粉為碳源處理的菌絲產量最大,與其他碳源處理差異明顯。本研究使用了5種天然物質和2種化學制劑多糖,除木薯粉外,以天然物質為碳源處理的菌絲產量明顯高于以化學制劑多糖(可溶性淀粉、微晶纖維素)為碳源的處理。將天然物質作為碳源,水解后可提供多

        種糖類供菌絲吸收利用,并且它還含有少量氮素營養(yǎng)或一些生長促進因子,可促進菌絲生長。以麥芽糖、蔗糖為碳源處理的菌絲產量較低。葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露醇中,唯有葡萄糖適于樟芝菌絲生長。

        2.3 不同碳氮比對樟芝菌絲生長的影響

        基于上述碳源、氮源的篩選結果,選用適于樟芝菌絲生長的碳源(葡萄糖)和無機氮源(酒石酸銨)來調節(jié)培養(yǎng)基的 C/N,以研究適宜樟芝菌絲生長的C/N。從圖4可以看出,在所研究的C/N范圍內,C/N為10 ∶ 1以上時均適于樟芝菌絲生長,在C/N為(20~50) ∶ 1時菌絲生長最快。

        2.4 不同礦質元素對樟芝菌絲生長的影響

        從圖5可以看出,礦質元素K、P、Mg、S、Na、Ca的缺乏均會明顯影響樟芝菌絲的生長,即這6種元素均為菌絲生長必需的礦質元素。其中,缺Na、缺Ca對菌絲產量影響較小,而K、P、Mg、S的缺乏將極大程度地影響菌絲生長。

        2.5 不同微量元素對樟芝菌絲生長的影響

        從圖6可以看出,7種微量元素(Fe、B、Zn、Mn、Mo、Cu、

        Co)均對樟芝菌絲生長有一定的抑制作用,其中Fe、B元素對樟芝菌絲生長的抑制作用最為明顯。

        2.6 不同維生素對樟芝菌絲生長的影響

        從圖7可以看出,所添加的6種維生素均對樟芝菌絲的生長沒有明顯影響。

        3 結論與討論

        本研究分析了樟芝液體發(fā)酵適宜的碳源、氮源、碳氮比及其所需的礦質元素和微量元素等,結果表明樟芝菌絲生長的最適無機氮源為酒石酸銨,最適有機氮源為麩皮;最適天然碳源為米粉,且以天然多糖類物質(木薯粉除外)為碳源處理的菌絲產量明顯高于單糖、雙糖、化學制劑多糖處理;菌絲生長適宜的碳氮比為(20~50) ∶ 1;K、P、Mg、S、Na、Ca均為菌絲生長必需的礦質元素;微量元素Fe、B、Zn、Mn、Mo、Cu、Co均對樟芝菌絲生長有一定的抑制作用,其中Fe、B元素的抑制作用最顯著;添加維生素對菌絲生長無明顯影響。

        本研究中以蛋白胨為氮源處理的菌絲產量明顯高于無機氮源處理。而黃大斌等研究發(fā)現(xiàn),在瓊脂培養(yǎng)基上以蛋白胨、酵母汁為氮源處理的菌絲生長速度不如檸檬酸銨、硝酸銨、硫酸銨等無機氮源處理[7]。因此,如果用瓊脂培養(yǎng)基活化樟芝菌種,應采用無機氮源;如果進行樟芝菌絲體的液體發(fā)酵生產,則應采用有機氮源。

        本研究表明,以葡萄糖為碳源處理的樟芝菌絲產量明顯高于麥芽糖、半乳糖處理,且葡萄糖是僅次于天然多糖類物質的碳源。而黃大斌等研究表明,在瓊脂培養(yǎng)基上,以葡萄糖為碳源處理的菌絲生長速度快于山梨醇糖、半乳糖、麥芽糖、淀粉處理[7]。因此,以葡萄糖作為碳源,不但適于樟芝菌種的活化,而且適于樟芝菌絲體的液體發(fā)酵生產。

        本研究還表明,在樟芝的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中不需要添加維生素。因此,可以推測在樟芝菌絲生長過程中,菌絲體會合成自身生長所需維生素。

        參考文獻:

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        [3]陳體強,李開本,林章余. 臺灣食(藥)用菌發(fā)展現(xiàn)狀[J]. 福建農業(yè)科技,2000(1):20-21.

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        [8]黃志偉,程祖鋅,謝寶貴,等. 樟芝菌絲體的固體培養(yǎng)特性研究[J]. 中國食用菌,2015,34(2):29-32.

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        [10]宋愛榮. 樟芝對氮素營養(yǎng)源利用的研究[J]. 菌物研究,2004,2(1):45-48.

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        [12]凌慶枝,劉國慶,袁懷波. pH和無機鹽對樟芝液體發(fā)酵的影響[J]. 食品科學,2007,28(11):365-369.

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