龐瑞華　王玲　李小寧

摘要：以信陽(yáng)稻區(qū)水稻育種的主要親本為試驗(yàn)材料，利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，篩選出的17條多態(tài)性引物在43份水稻材料中共有126個(gè)位點(diǎn)條帶，其中多態(tài)性條帶有118條，其多態(tài)性比率為93.6%；每個(gè)引物可擴(kuò)增出3～8條多態(tài)性條帶，平均產(chǎn)生多態(tài)性條帶5.5條。43個(gè)品種（品系）間遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.402～0.937?；赗APD標(biāo)記，利用NTSYS.pc2.11構(gòu)建了聚類樹(shù)狀圖譜，遺傳距離為0.68，將43 份水稻資源聚成4大類群。該研究為信陽(yáng)水稻種質(zhì)資源的鑒定及水稻新品種的選育等方面提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞：水稻；種質(zhì)資源；RAPD；遺傳多樣性；聚類分析

中圖分類號(hào)： S511.032 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0113-03

水稻是人類最重要的糧食作物之一，世界上超過(guò)一半的人口以其為主食[1]。 河南省信陽(yáng)稻區(qū)常年種植水稻面積在 43.3萬(wàn)hm2 以上，約占全省水稻種植面積的70%，是河南水稻的主產(chǎn)區(qū)。目前，對(duì)信陽(yáng)地區(qū)水稻的研究主要集中在高產(chǎn)栽培及病蟲(chóng)害防治方面[2-4]，而對(duì)水稻種質(zhì)資源分子遺傳多樣性的研究非常薄弱。水稻種質(zhì)資源是水稻育種的基礎(chǔ)，充分了解和掌握當(dāng)?shù)刭Y源的豐度、差異性、親緣關(guān)系等是培育水稻品種的必要條件。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA （RAPD） 技術(shù)于1990年由美國(guó)Williams首先報(bào)道[5]，該技術(shù)是建立在PCR基礎(chǔ)上的一種可對(duì)整個(gè)未知序列的基因進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)。由于具有DNA用量少、靈敏度高、快捷、檢測(cè)容易和標(biāo)記的數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)水稻種質(zhì)的遺傳多樣性和親緣關(guān)系[6-9]。

對(duì)現(xiàn)有材料進(jìn)行遺傳多樣性研究，可有效減少相似遺傳背景的組合，減少育種的工作量，對(duì)于親本的雜交組合配置具有重要的指導(dǎo)意義[10]。本研究擬以信陽(yáng)稻區(qū)保存的43份水稻親本為試驗(yàn)材料，選用40條RAPD 隨機(jī)引物對(duì)供試材料擴(kuò)增，旨在從DNA分子水平上探討這些材料之間的遺傳多樣性程度，從而為信陽(yáng)地區(qū)水稻育種實(shí)踐提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的水稻種質(zhì)43份，包括42份常規(guī)粳稻和1份常規(guī)秈稻；有7份審定品種，其他36份為中間育種材料。材料編號(hào)、名稱及來(lái)源見(jiàn)表1。材料均由信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院水稻研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻基因組DNA的提取 將收集的水稻種子在實(shí)驗(yàn)室中發(fā)苗，然后取幼嫩的新鮮葉片，采用CTAB （十六烷基三甲基溴化銨）法提取葉片基因組 DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RAPD引物的篩選 選出40條10個(gè)堿基長(zhǎng)度的寡核苷酸隨機(jī)引物[6-7]，委托江蘇南京金斯瑞生物科技公司合成。對(duì)上述提取后的樣本基因組DNA進(jìn)行RAPD 預(yù)擴(kuò)增，從中篩選出多態(tài)性高、條帶清晰和重復(fù)性好的引物。

1.2.3 RAPD反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序 反應(yīng)體系包括10 μL 2×Power Taq PCR Master Mix（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，內(nèi)含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2以及反應(yīng)緩沖液等），20～50 ng DNA模板，1 μL（10 mmol/L）引物，補(bǔ)雙蒸水至總體積20 μL。擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，36 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用1.5%的瓊脂糖凝膠（加入Gold View I型核酸染色劑）電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析 DNA圖譜中，在同一遷移位置，有DNA擴(kuò)增帶的量化為1，無(wú)擴(kuò)增帶的量化為0，列出二元數(shù)據(jù)矩陣。應(yīng)用NTSYSpc2.10e統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算品種間的遺傳相似系數(shù)（genetic similarity，GS），根據(jù)遺傳相似系數(shù)的數(shù)據(jù)集，采用UPGMA（非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法）構(gòu)建遺傳關(guān)系樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD標(biāo)記結(jié)果分析

從50條引物當(dāng)中篩選出了17條擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的引物（表2）。所有的材料共擴(kuò)增出126條帶，其中多態(tài)性條帶118條，占總擴(kuò)增片段的93.6%。每個(gè)引物可擴(kuò)增出 3～11條多態(tài)性條帶，平均產(chǎn)生多態(tài)性條帶6.9條（圖1）。由表2可知，擴(kuò)增位點(diǎn)最少的引物是Rp16，僅有3個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)。圖1顯示17條引物在43個(gè)水稻品種中的多態(tài)性比率均高于80%，可用于水稻種質(zhì)資源的品種鑒定及親緣關(guān)系分析。如圖1是利用引物Rp15 得到的部分材料的RAPD標(biāo)記圖譜。

2.2 不同材料間的遺傳相似性分析

根據(jù)17條引物在43份供試材料中所獲得的126條擴(kuò)增條帶，應(yīng)用NTSYSpc2.10軟件包計(jì)算供試品種間的遺傳相似系數(shù)。所有供試品種間的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.402～0.937，材料間表現(xiàn)出顯著的遺傳變異。淮稻12與長(zhǎng)香粳之間的遺傳相似系數(shù)（GS=0.402）最小，反應(yīng)出兩者的遺傳異質(zhì)性較大；P078和黃金晴之間的遺傳系數(shù)高達(dá)0.937，表明這2個(gè)材料間的遺傳相似性較大；香寶3號(hào)（表1中編號(hào)為5）秈稻與大部分供試品種具有很大的差異性，遺傳相似系數(shù)在04～0.7之間。

2.3 聚類分析

由圖2可知，當(dāng)以遺傳相似系數(shù)0.68為閾值時(shí)，43份常規(guī)稻材料可以分為四大類。第Ⅰ類包含24份材料。以遺傳相似系數(shù)0.73為閾值，24份材料可分為2個(gè)亞組，分別以Ⅰ-1、Ⅰ-2表示。Ⅰ-1組包括香粳33等23個(gè)品種，由表1可知，這23個(gè)品種均為粳稻，且來(lái)源地大多為河南信陽(yáng)。Ⅰ-2組類僅包括1份材料：黑香糯192（編號(hào)為25），米粒黑色，為常規(guī)粳稻。第Ⅱ類中只有香寶3號(hào)（編號(hào)為5）1份材料，為常規(guī)秈稻。第Ⅲ類包括武香粳等16個(gè)品種。第Ⅳ類包括2份材料：伊拉泰104（編號(hào)為28）和津稻293（編號(hào)為29）。

3 討論

3.1 水稻材料間遺傳多樣性

本研究對(duì)43份水稻材料的遺傳多樣性分析中，17個(gè)引物共擴(kuò)增出126條帶，其中多態(tài)性條帶118條，多態(tài)性程度達(dá)到約93.6%，遠(yuǎn)高于49份旱稻（81.6%）[6]和貴州19份水稻（84%）[7]的遺傳多樣性。如此高的遺傳多態(tài)性，一方面與本研究材料的來(lái)源地廣泛有關(guān)：不僅有國(guó)內(nèi)，還有國(guó)外材料，40份常規(guī)稻來(lái)自于國(guó)內(nèi)4個(gè)省（河南、江蘇、天津和安徽），其余3份常規(guī)稻分別來(lái)源于法國(guó)、美國(guó)和日本；另一方面和材料的性狀類型豐富有關(guān)：試驗(yàn)材料除了普通常規(guī)稻外，還有旱稻、

香稻和黑稻等材料。從多態(tài)性比例看，本研究的43份材料存在著較大的遺傳差異和豐富的遺傳多樣性，這正是進(jìn)行雜交育種可利用的遺傳資源。

3.2 43份水稻材料的聚類分析

本試驗(yàn)的聚類結(jié)果基本反應(yīng)了材料間的系譜關(guān)系。當(dāng)以遺傳相似系數(shù)0.69為閾值，43份常規(guī)稻親本材料可以分為4大類，其中香寶3號(hào)（5號(hào)）單獨(dú)聚為一類，原因是42份材料均為粳稻，而5號(hào)為秈稻。這與王英等利用RAPD對(duì)49份旱稻種質(zhì)的的聚類結(jié)果[6]相一致。同一單位的育成品種遺傳差異較小，容易歸為一類[11]；來(lái)自信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院的10份水稻聚到第Ⅰ類，4份材料聚到了第Ⅲ類。本研究材料中共有17份香稻，其中16份聚到第一大類，表明這些香稻具有一致的遺傳背景和起源。然而，白現(xiàn)廣等對(duì)云南的 10個(gè)香稻品種、45個(gè)非香稻地方栽培品種利用SSR進(jìn)行聚類，發(fā)現(xiàn)10個(gè)香稻品種并沒(méi)有聚在一起[12]，這與云南現(xiàn)有的香稻栽培品種并非為單一的遺傳來(lái)源，而是從多個(gè)祖先分別起源有關(guān)。

RAPD標(biāo)記是從分子水平上揭示種質(zhì)間的遺傳差異，比傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記準(zhǔn)確度要高，因此本研究采用RAPD技術(shù)分析43份水稻材料的遺傳多樣性。近年來(lái)，隨著水稻基因組測(cè)序的完成，另一種分子標(biāo)記技術(shù)簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR正被廣泛應(yīng)用于水稻遺傳多樣性的研究中[13-15]。分類收集更多的信陽(yáng)水稻種質(zhì)，結(jié)合不同的分子標(biāo)記方法和農(nóng)藝性狀對(duì)其進(jìn)行多樣性分析將是下一步研究的內(nèi)容。

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