鄭國亞 齊佳 劉順梅 連波 陳麗梅 尹金良

[摘要] 鏈脲佐菌素是最常用的誘導動物發(fā)生糖尿病的藥物。利用鏈脲佐菌素構(gòu)建小鼠糖尿病模型的文獻報道很多，但關(guān)于鏈脲佐菌素有效誘導小鼠糖尿病模型的關(guān)鍵因素及實驗注意事項的報道卻很少。本文總結(jié)了筆者在多次糖尿病小鼠建模實驗中獲得的一些經(jīng)驗與體會，以期為其他研究者開展糖尿病建模工作提供參考與指導作用。

[關(guān)鍵詞] 鏈脲佐菌素；糖尿??；小鼠；模型

[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（c）-0182-04

Experience on the construction of diabetic mice model induced by streptozotocin

ZHENG Guoya QI Jia LIU Shunmei LIAN Bo CHEN Limei YIN Jinliang

School of Bioscience and Technology， Weifang Medical College， Shandong Province， Weifang 261053， China

[Abstract] Streptozotocin （STZ） is the most widely used drug to produce animal model of diabetes mellitus. Many studies have been reported on the construction of STZ-induced diabetic mice model， but only scanty information is available on the detailed description of the key factors and details that should be pay attention to during establishment of the model. This paper summarizes the experiences of authors obtains from several times of producing diabetic mice model. The aim is to provide reference and instruction for other researchers.

[Key words] Sreptozotocin； Diabetes； Mice； Model

糖尿病是一種由多種因素引起的慢性非傳染性代謝性疾病[1]，其發(fā)病機制是由T細胞介導的胰島β細胞功能破壞而引起的自身免疫性疾病[2-3]，造成體內(nèi)胰島素缺乏，或胰島素的利用率降低，導致機體對葡萄糖、蛋白和脂肪的代謝紊亂，出現(xiàn)明顯的高血糖癥，并伴有廣泛而嚴重的并發(fā)癥[4-6]。糖尿病的發(fā)病率較高，已成為一種全球性疾病，嚴重威脅著人類健康。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會估算，到2030年，全世界糖尿病患者將由2010年的2.85億例上升至4.38億例[7]。目前對糖尿病的相關(guān)研究已成為世界范圍內(nèi)的一個重要課題。為了克服人體的局限性，建立穩(wěn)定可靠的糖尿病動物模型越來越引起人們的關(guān)注[8]。制備糖尿病動物模型的方法較多，通過手術(shù)、藥物或食物誘導、自發(fā)、轉(zhuǎn)基因等都可誘發(fā)糖尿病[9-10]。由于自發(fā)和轉(zhuǎn)基因費用昂貴，藥物誘導法已成為目前構(gòu)建糖尿病動物模型最常用的方法，主要誘導藥物包括四氧嘧啶（alloxan，ALX）和鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）[11]。與ALX相比，STZ對實驗動物的胰島β細胞具有高度選擇性，藥物用量少，毒性小[12]。因此，STZ已成為目前最常用的糖尿病誘導藥物[13]。利用STZ誘導糖尿病小鼠模型的文獻較多，但對模型建立過程中的關(guān)鍵因素及一些細節(jié)和注意事項的完整闡述卻很少。因此，本文將筆者在多次STZ誘導小鼠糖尿病模型過程中獲得的一些經(jīng)驗及心得體會進行總結(jié)，以期為相關(guān)的研究者提供借鑒作用。

1 動物種類和品系的選擇

適于用STZ誘導建立糖尿病模型的動物種類較多，如大鼠、小鼠、狗、猴等，兔也可以利用STZ建模，但對STZ的敏感性不如前面幾種動物高。目前最常用于糖尿病建模的動物是大鼠和小鼠[13]。由于大鼠對STZ具有高敏感性，為避免造成大鼠死亡率高、成模率低等問題，需嚴格控制用藥劑量。小鼠對STZ的敏感性較大鼠差，用小鼠代替大鼠，可增加對STZ劑量的耐受力，減少死亡率，并可以降低糖尿病動物模型制備的成本[14]。

不同動物對STZ的敏感性不同，同一種動物的不同品系對STZ的敏感性也有差異[9，15-16]，因此在建模時要適當選擇動物種類和品系。就小鼠來說，最常用于糖尿病建模的C57BL/6J小鼠對STZ比較敏感，其敏感性高于FVB/NJ、BALB/C和A/J品系，但比CBA/J的敏感性低[9]。劉長清等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6J小鼠對STZ的敏感性稍高于KM（昆明小鼠）和ICR，敏感性最低的是BALB/C小鼠。張金保等[16]也證實，C57BL/6J小鼠比ICR小鼠敏感性高，同等STZ劑量下前者成模率高于后者。筆者曾用C57BL/6J和KM小鼠同時造模以探討二者在同樣STZ劑量下的成模率，發(fā)現(xiàn)無論是單次大劑量（150 mg/kg）還是多次小劑量（50 mg/kg，連續(xù)5次）給藥，二者的成模率沒有明顯差別（實驗結(jié)果待發(fā)表）。該結(jié)果與劉長清等[15]、張金保等[16]的研究基本一致?？紤]到KM的價格比C57BL/6J小鼠要便宜很多，所以在建立糖尿病模型時KM小鼠應(yīng)該是首選動物之一。

動物的性別也會影響造模的成功率，不同的性別對STZ的敏感性不同。對于大鼠和小鼠而言，雄性比雌性更敏感[17-19]，所以目前所見到的糖尿病建模研究幾乎全部采用雄性鼠。除非實驗對雌性有特殊要求，建議研究者在選擇糖尿病建模動物時采用雄性以提高建模成功率。

實驗動物的體重也會影響糖尿病模型的成模率。郭延敏[20]研究發(fā)現(xiàn)，同等STZ劑量下，體重20～28 g的小鼠比30～40 g的成模率高，死亡率低。原因有可能是不同體重小鼠對STZ的敏感性和抵抗力不同。

由于上述種種原因，在建立糖尿病動物模型時選取合適的動物對實驗的成功與否是非常關(guān)鍵的。所以小鼠建模時應(yīng)選擇雄性，體重以20～30 g為宜，品系以C57BL/6J和KM為佳。

2 預實驗的重要性

動物在實驗條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1～2周后即可開始建模。但要注意的一點是，不要盲目按照文獻報道的劑量直接給藥建模，一定要在正式實驗之前先做預實驗來摸索動物的最佳用藥劑量。因為小鼠的品系、性別、體重、禁食時長、藥物給藥途徑（腹腔或是靜脈）、給藥方式（單次大劑量或是多次小劑量）以及藥品的質(zhì)量等眾多因素都會影響建模的成功率。不同的實驗條件下STZ的最適劑量會有差別。因此，為了不浪費藥品、提高建模成功率，預實驗是十分必要的。

筆者曾用同一性別、相同體重的兩批KM小鼠建立1型糖尿?。╰ype 1 diabetes，T1MD）模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同的實驗條件下，即相同的飼養(yǎng)條件和禁食時間（12 h）、同一藥物品牌（STZ，Sigma）、相同劑量及處理方式（50 mg/kg連續(xù)5 d腹腔注射，配好的STZ在10 min內(nèi)用完），但第一批動物的成模率明顯高于第二批（實驗結(jié)果未發(fā)表）。分析原因，其一可能因為兩批動物來源于兩家公司，雖然都是KM小鼠，但可能體質(zhì)方面存在差別；其二可能是藥品的差別。兩次實驗用的STZ都是Sigma原裝進口，但卻是分兩次購買，批號不同；其三，第一批動物是在冬天12月建模，第二批是在春天5月建模，雖然都飼養(yǎng)在同一間動物房，相同的溫濕度環(huán)境，但畢竟季節(jié)不同，動物本身對藥物的反應(yīng)也有可能會隨季節(jié)不同而有所差別。當然，上述原因都是推測，還需要進一步的實驗證據(jù)來證實。

總而言之，從筆者的經(jīng)歷和前人的經(jīng)驗來看，為了節(jié)約藥品并保障建模成功率，預實驗非常重要，最好在預實驗的成模率達到一定比例后再開始大規(guī)模建模。

3 實驗條件的篩選

動物選定之后，影響成模率的主要因素為禁食時間、藥物劑量及給藥方式，這些因素都應(yīng)在預實驗中篩選確定。

3.1 禁食時間的選擇

禁食處理的目的：首先，禁食后動物胃腸排空，有利于STZ的吸收。其次，禁食后血糖水平和胰島素分泌水平均下降，使STZ直接作用于胰島β細胞，可增強STZ對胰島β細胞的損傷程度，從而增加糖尿病模型的成模率。一般認為，禁食的時間越長，胰島β細胞受到STZ的破壞程度就越大，即藥效越高。但時間過長，死亡率也會隨之增加。因此，選擇合適的禁食時間對于STZ誘導糖尿病小鼠模型的成模率是十分重要的。目前大多數(shù)建模實驗普遍采用禁食12 h[4，16，21-22]，也有采用禁食16 h[23]的報道。但虞冬輝等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在多次小劑量STZ誘導T1MD小鼠模型時禁食時間為10 h的成模率高于禁食16 h，二者的成模率分別為90%和80%；且在4周的實驗期間，禁食10 h組的模型鼠的平均血糖一直高于禁食16 h組。筆者所做的建模實驗一直采用禁食12 h，成模率也較高，可達80%（已被《中國生化藥物雜志》接收，待發(fā)表）?？梢娊硶r間采用12 h左右比較適宜。當然，不同的實驗條件下最適的禁食時間也不一定相同。Furman[13]用小鼠禁食4 h、大鼠禁食6～8 h的方法也成功地建立了T1MD模型。因此，研究者可以根據(jù)自己的實驗條件探索適當?shù)慕硶r間。

3.2 STZ劑量和給藥方式的選擇

STZ的劑量是決定成模與否的最重要因素。當劑量太低時，死亡率較低，成模率也較低；而劑量過高時，成模率升高，但死亡率也升高。對于小鼠來說，目前普遍采用一次性腹腔注射150～200 mg/kg或者連續(xù)5次（每天1次）腹腔注射40～50 mg/kg的方法[13-14，21]。單次大劑量和多次小劑量STZ注射均能建立糖尿病模型。單次大劑量給藥操作簡單，省時省力，用藥量相對較少，可節(jié)約費用，但這種給藥方式的成模率往往不如低劑量多次給藥方式高，而且模型鼠的高血糖也往往不如后者穩(wěn)定，血糖波動幅度大，容易逐漸降回正常值[23，25]。

筆者曾用KM小鼠比較了一次性腹腔注射150 mg/kg與連續(xù)5次注射50 mg/kg的成模率，發(fā)現(xiàn)150 mg/kg組的成模率在4周后低于50 mg/kg組，且前者的死亡率高于后者（已被《中國生化藥物雜志》接收，待發(fā)表）。這與多數(shù)人的研究結(jié)果基本一致。因此，建議最好選擇STZ低劑量多次給藥方式建模。

上述所討論的STZ劑量與給藥方式都是基于腹腔注射給藥進行的研究，這種給藥途徑是目前絕大多數(shù)糖尿病建模實驗所采用的。除了腹腔注射給藥途徑外，STZ還可經(jīng)尾靜脈注射、皮下注射等方式給藥。有人認為尾靜脈注射較之腹腔注射具有用藥量少且成模率高的特點[26]，所以不同的給藥途徑所需的最適劑量也有一定差別，每名實驗者都應(yīng)通過預實驗來確定自己的最適給藥劑量和給藥方式。

4 實驗過程中的注意事項

4.1 STZ的保存與配制

STZ見光易分解，因此在稱取和分裝時要避光。STZ易潮解，受潮30 min后會失去效果，因此STZ要在-20℃冰箱中干燥保存。STZ易溶于水，其水溶液在室溫下極不穩(wěn)定，可在數(shù)分鐘內(nèi)分解成氣體，所以水溶液應(yīng)在冰浴中配制和保存[26]，且在配制后應(yīng)在30 min內(nèi)完成注射（越快越好）以保障其療效。

STZ常用pH為4.2～4.5的0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液溶解后進行注射，這是因為在此pH范圍內(nèi)STZ的穩(wěn)定性最好，動物的吸收效率最高。因此，STZ溶液配好后必須調(diào)節(jié)pH值至4.2～4.5。通常STZ用檸檬酸緩沖液配成1%的濃度用于注射，且要現(xiàn)用現(xiàn)配，務(wù)必在配好后的30 min之內(nèi)用完，以免因時間過長而分解失效。

采用靜脈方式給藥時STZ溶液必須經(jīng)過滅菌處理，采取腹腔和皮下給藥方式可以不經(jīng)滅菌處理，但為避免感染引起動物死亡，建議無論采用哪種給藥途徑都應(yīng)當將STZ做無菌處理。筆者通常是在超凈工作臺中將配好的STZ溶液用0.22 μm的一次性濾器過濾除菌，操作方便，除菌效果好，且不影響STZ的藥效。

4.2 給藥途徑選擇和注射速度

雖然STZ可以通過皮下注射、腹腔注射、靜脈注射等方式給藥，但是，由于STZ的生物半衰期短，容易降解，所以最常被選用的給藥途徑為腹腔注射。這是因為此種方法操作簡便，注射用時短，可以避免STZ分解。皮下注射雖然操作簡單，但成功率較低，且容易感染形成皮下腫瘤，所以一般不選用此種給藥方式。至于靜脈注射，由于小鼠的尾靜脈很細，靜脈注射技術(shù)較難掌握，注射速度慢，操作誤差較大，所以此種給藥途徑也很少使用。筆者一直采用腹腔注射給藥方式建模，簡單快速，成模率較高。建議實驗者在注射時注意避免將針頭扎入內(nèi)臟，而導致死亡率增高；也要注意避免將藥物注入皮下，其會降低成模率。

STZ的注射速度也會影響被試鼠的血糖。注射時推注速度較快，對動物的刺激會較大，也更容易形成高血糖模型；若推注速度較緩慢，相對的危險性降低，成模率也會降低。因此，建議快速注射以保障成模率。

4.3 造模后動物的飼養(yǎng)與管理

4.3.1 日常管理 小鼠成模后，飲水量及攝食量會明顯增加，因此要確保飲水和飼料充足，避免小鼠因缺水少糧而相互撕咬，否則會增加感染率和死亡率。成模后小鼠的尿量會顯著增加，由于高血糖鼠本身的抗病力差，一定要勤換墊料，保持墊料潔凈和干燥，避免小鼠感染疾病。根據(jù)籠中小鼠數(shù)量的多少，墊料宜一天更換1～2次。

4.3.2 感染的預防與處理 造模后的小鼠往往每隔3～7 d就需采血檢測一次血糖，一般采用尾部取血法。由于檢測血糖所用的方法或血糖儀品牌不同，所需血量有多有少。需血量多時往往采用剪尾法，即將尾尖剪掉取血，這種方法容易形成創(chuàng)傷和發(fā)生感染。一旦感染發(fā)生，可采用清創(chuàng)消毒后涂抹紅霉素軟膏的方法控制感染。筆者用卓越型羅氏血糖儀檢測血糖，需血量極少，用血糖試紙配送的采血針輕刺尾部即可取到足夠血量，不會對小鼠造成創(chuàng)傷，從沒發(fā)生過感染現(xiàn)象。鑒于上述原因，建議實驗者在確定血糖檢測方法時選用合適的方法和儀器，采血前要對采血部位進行消毒，采血后要對傷口進行適當處理和止血。

4.3.3 降低模型鼠死亡率的補救措施 注射STZ后，糖尿病小鼠血糖水平的改變可分為3個不同的時相：①早期高血糖相，持續(xù)1～2 h，是由于STZ抑制胰島素的釋放，使血糖迅速升高；②低血糖相，持續(xù)6～10 h，可能是胰島β細胞被破壞，使其釋放出大量的胰島素，使血糖顯著降低；③24 h后出現(xiàn)穩(wěn)定的高血糖相即糖尿病階段，大部分胰島β細胞已出現(xiàn)不同程度的損傷和破壞，使血糖持續(xù)維持在較高的水平。血糖過低或過高都會造成小鼠死亡。為了降低小鼠的死亡率，可通過暫時補糖和注射胰島素的方法來解決這兩個問題。一般在注射STZ后的第2個時相（低血糖相）時，個別小鼠會出現(xiàn)持續(xù)低血糖而驚厥死亡。這種情況可在喂養(yǎng)飼料的同時給予5%的葡萄糖水24 h或腹腔注射20%的葡萄糖來解決。注射STZ后期，小鼠一直處于持續(xù)的高血糖狀態(tài)，為避免小鼠因血糖過高而死亡，可以注射一定量的胰島素，例如中性魚精蛋白鋅胰島素或甘精胰島素，每次1～3 U，即可用于緩解小鼠血糖過高的狀況。

5 結(jié)語

STZ誘導法是目前建立糖尿病動物模型最常用的方法，操作簡單，建?？焖?。采用此法建模時，藥物劑量、給藥方式、造模后動物的飼養(yǎng)與護理等都是關(guān)系到成模率的重要因素。因此，要想達到較高的成模率，上述因素都必須慎重選擇。就小鼠來說，C57BL/6J和KM小鼠、禁食12 h、150～200 mg/kg STZ一次性腹腔注射或40～50 mg/kg連續(xù)5次腹腔注射是目前最常用的建模方式，實驗者可根據(jù)上述原則通過預實驗進一步確定和選擇更適合自身實驗條件的建模方法。

[參考文獻]

[1] Amitani H，Asakawa A，Cheng K，et al. Hydrogen improves glycemic control in type 1 diabetic animal model by promoting glucose uptake into skeletal muscle [J]. Plos One，2013，8（1）：e53913.

[2] Ichinose K，Kawasaki E，Eguchi K. Recent advancement of understanding pathogenesis of type 1 diabetes and potential relevance to diabetic nephropathy [J]. Am J Nephrol，2007，27（6）：554-564.

[3] Homo-Delarche F，Drexhage HA. Immune cells，pancreas development，regeneration and type 1 diabetes [J]. Trends Immunol，2004，25（5）：222-229.

[4] 李甜，張亞樓，陳龍，等.鏈脲佐菌素誘導C57小鼠1型糖尿病模型的研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2014，14（26）：5031-5033.

[5] 孫國鵬，尹國安，張艷芳.低劑量鏈脲佐菌素誘導遲發(fā)性Ⅰ型糖尿病小鼠模型[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2013， 25（3）：30-33.

[6] 魏榮銳，苗明三.糖尿病動物模型及特點分析[J].中醫(yī)研究，2010，23（2）：6-11.

[7] Hwang PA，Hung YL，Tsai YK，et al. The brown seaweed Sargassum hemiphyllum exhibits a-amylase and a-glucosidase inhibitory activity and enhances insulin release in vitro [J]. Cytotechnology，2015，67（4）：653–660.

[8] 孫麗華，崔海峰，孫明杰，等.鏈脲佐菌素制備糖尿病大鼠模型探討[J].中國實驗動物學報，2012，20（6）：15-19.

[9] 伍靜，王彬鮑，臻楊，等.糖尿病動物模型的特點及影響因素分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2013，13（25）：4988-4990.

[10] Aileen JFK. The use of animal models in diabetes research [J]. Brit J Pharmacol，2012，166（3）：877-894.

[11] 嵇揚，張葵榮，王文俊.建立四氧嘧啶糖尿病模型的研究[J].中國醫(yī)學刊，2003，21（7）：1125-1126.

[12] 張儉，劉杰，伍賢進.KM小鼠糖尿病動物模型的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2012，40（3）：174-175.

[13] Furman BL. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats [J]. Curr Protoc Pharmacol，2015，70：5.47.1-5.47.20.

[14] 屈彥純，杜娥，張玥，等.糖尿病小鼠模型制備方法的初步探討[J].醫(yī)學研究雜志，2011，40（3）：78-80.

[15] 劉長青，宋立江，蔣東升，等.不同種屬和禁食時間對鏈脲佐菌素誘導糖尿病模型的影響研究[J].實用預防醫(yī)學，2010，17（2）：377-378.

[16] 張金保，莊朋偉，林映雪，等.小鼠品系、給藥劑量及次數(shù)對鏈脲霉素誘導1型糖尿病的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2013，23（36）：31-35.

[17] Herberg L，Coleman DL. Laboratory animals exhibiting obesity and diabetes syndromes [J]. Metabolism，1977，26（1）：59-99.

[18] Rossini AA，Williams RM，Appel MC，et al. Sex differences in the multiple-doses streptozotocin model of diabetes [J]. Endocrinology，1978，103（4）：1518-1520.

[19] 王曉琳，邱宗蔭，夏永鵬.性別差異對實驗性鏈脲佐菌素糖尿病大鼠造模的影響[J].第三軍醫(yī)大學學報，2009， 31（17）：1668-1671.

[20] 郭延敏.體重和劑量對鏈脲佐菌素致糖尿病小鼠模型影響的研究[J].畜牧與飼料科學，2011，32（12）：17-18.

[21] 韋立順，許忠新，田河林，等.鏈脲佐菌素致小鼠糖尿病模型的建立與評價[J].中國實驗診斷學，2013，17（5）：806-808.

[22] Dang JK，Wu Y，Cao H，et al. Establishment of a rat model of type Ⅱ diabetic neuropathic pain [J]. Pain Medicine，2014，15（4）：637-646.

[23] 閔筱輝，陳其奎，于濤，等.鏈脲佐菌素誘導建立長期穩(wěn)定糖尿病小鼠模型的給藥方案研究[J].中國醫(yī)藥導報，2013，10（4）：7-10.

[24] 虞冬輝，程紅科，李勇，等.禁食時間對鏈脲佐菌素誘導1型糖尿病小鼠模型的影響[J].中國臨床醫(yī)學，2013， 20（4）：472-473.

[25] 周燁文，張福梅.鏈脲佐菌素誘導糖尿病小鼠模型的構(gòu)建[J].生物技術(shù)世界，2014，（6）：78-80.

[26] 王繼紅，劉學政，楊雪佳.尾靜脈注射STZ制備1型糖尿病大鼠模型實驗的技巧[J].遼寧醫(yī)學院學報，2010， 31（1）：7-9.

（收稿日期：2015-11-20 本文編輯：程 銘）