陳柳 華清泉

[摘要] 轉(zhuǎn)錄組（RNA-Seq）是新一代測序技術(shù)，利用高通量測序技術(shù)對組織或細胞中所有RNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA文庫進行測序，從整體水平研究基因的功能及其結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學過程以及疾病發(fā)生過程中的分子機制，而癌癥療效評估的關(guān)鍵在于腫瘤的復發(fā)率和對放化療的敏感性。新一代測序系統(tǒng)有望識別導致腫瘤的形成和對治療產(chǎn)生抵抗的相關(guān)靶基因，對進一步指導臨床治療和診斷具有重要的理論及實踐意義。

[關(guān)鍵詞] 轉(zhuǎn)錄組學；RNA-Seq；腫瘤；測序技術(shù)

[中圖分類號] R733 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（c）-0058-04

Application and progress of RNA-Seq in tumor

CHEN Liu HUA Qingquan

Department of Otolaryngology & Head and Neck Surgery， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] The transcriptome is a new generation sequencing technology， which uses high-throughput sequencing technology to sequence cDNA library formed by the reverse transcription of all RNA from tissue or cells， studies gene function and structure from the overall level， reveals the specific molecular mechanism in the process of biological processes and disease. The key point evaluating the efficacy of cancer is the tumor recurrence rate and sensitivity to radiation and chemotherapy. The new generation sequencing system is expected to identify the related target genes which lead to the formation of tumor and resistance to treatment. Further more， it has important theoretical and practical significance for guiding clinical treatment and diagnosis.

[Key words] Transcriptomics； RNA-Seq； Tumor； Sequencing technology

轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的集合，包括蛋白質(zhì)編碼的信使RNA和非編碼RNA（rRNA、tRNA和其他ncRNAs）。1995年Velculescu等首次提出了關(guān)于轉(zhuǎn)錄組的概念，并在酵母細胞中獲得第1個轉(zhuǎn)錄組[1]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展大多是多種基因改變積累造成的，包括致癌基因的激活和抑癌基因的失活。RNA-Seq技術(shù)可以從轉(zhuǎn)錄水平檢測腫瘤中的改變基因。通過相關(guān)軟件分析，鑒定相關(guān)改變基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起的作用。然后經(jīng)過刷選，進一步挑選出相關(guān)靶基因進行實驗研究，有望為腫瘤的基因治療提供新的靶點。

1 轉(zhuǎn)錄組學的概念及進展

1.1 轉(zhuǎn)錄組學的概念

高通量測序技術(shù)也被稱為下一代測序（NGS）技術(shù)，推進了基因組學的研究進展。該項新技術(shù)除了研究靜態(tài)基因組，近年來也開始應(yīng)用于動態(tài)轉(zhuǎn)錄分析，由此衍生的技術(shù)稱為RNA序列分析（RNA-seq）[2]。在20世紀90年代末和21世紀初，隨著DNA基因芯片技術(shù)的快速發(fā)展，開創(chuàng)了癌癥近十年的高通量轉(zhuǎn)錄組研究。早期研究的顯著發(fā)現(xiàn)主要是關(guān)于黑色素瘤[3]和乳腺癌[4]。van't Veer等[5]曾使用基因芯片對乳腺癌淋巴結(jié)陽性患者進行相關(guān)研究，確定了一組70個基因的堿基排列順序，可以很好地預(yù)測乳腺癌患者的預(yù)后[6]。近年來，基于利用轉(zhuǎn)錄組所得到的成果，轉(zhuǎn)錄組逐漸成為研究癌癥生物學信息的一個主導實驗技術(shù)。

1.2 轉(zhuǎn)錄組學的相關(guān)進展

復合性基因融合現(xiàn)象常見于與血液學關(guān)聯(lián)的惡性腫瘤和罕見的骨骼及軟組織腫瘤中。近年來研究表明，常見的實體腫瘤中也有復發(fā)性基因融合現(xiàn)象。融合基因是最普遍的癌基因，是由染色體重組造成的。Maher等[7]綜合運用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，在慢性粒細胞性白血病細胞系中發(fā)現(xiàn)融合基因BCR-ABL1以及在前列腺的癌細胞系和組織中發(fā)現(xiàn)融合基因TMPRSS2-ERG。同時Huang等[8]研究提示RNA-Seq技術(shù)可以有效識別移位的染色體，并發(fā)現(xiàn)融合基因PARP14-TFE3。另一方面，可變剪接是導致人類蛋白質(zhì)多樣性的主要來源。單個基因經(jīng)過可變剪接，形成多種不同的mRNAs。據(jù)目前情況估計，基于全基因組技術(shù)的應(yīng)用，研究表明超過90%的人類基因都進行過可變剪接[9-10]。在許多癌癥中發(fā)現(xiàn)可變剪接。許多與腫瘤生物學功能相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)經(jīng)過了與癌癥相關(guān)的可變剪接，這些腫瘤生物學功能包括細胞凋亡、細胞周期調(diào)控、入侵和轉(zhuǎn)移[11-13]。近年來，全基因組方法的顯著發(fā)展有望發(fā)現(xiàn)腫瘤中改變的可變剪接基因，有助于發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中發(fā)生變化的具體信號通路。

2 RNA測序（RNA-Seq）

2.1 RNA-Seq的技術(shù)平臺

NGS已經(jīng)徹底改變了既往對研究細胞通路的系統(tǒng)分析方法。癌癥是一種復雜的疾病，涉及多種異常的基因表達調(diào)控。識別這種驅(qū)動腫瘤生物學發(fā)展的表達模式為我們理解癌癥提供了很好的分子基礎(chǔ)[14]。NGS的兩個主要平臺是全外顯子組測序（WES）和RNA-Seq。WES主要是用于發(fā)現(xiàn)DNA的變異，RNA-Seq主要用于衡量基因的表達。兩種技術(shù)都可以用于檢測基因變異，尤其是單核苷酸變異（SNVs）[15]。鑒于持續(xù)降低成本和改進數(shù)據(jù)分析方法的優(yōu)勢，NGS已經(jīng)開始直接影響生物醫(yī)學的發(fā)展[16]，其測序步驟依賴于NGS技術(shù)。目前使用最廣泛并且廣受歡迎的應(yīng)用于RNA-seq的NGS平臺有3個，包括454年焦磷酸測序系統(tǒng)、AB固體系統(tǒng)和Illummina基因組分析儀。具體來說，Illumina/Solexa Illumina公司（美國圣地亞哥Illumina公司Inc. CA）平臺是基于可逆染料終結(jié)合測序原理，而454年和固體系統(tǒng)采用創(chuàng)新型的乳液聚合酶鏈反應(yīng)機制。

RNA-seq也被稱為整個轉(zhuǎn)錄組鳥槍測序（wts）。RNA-seq包含三個步驟：測序文庫的建立，在特定NGS平臺中測序和生物信息學分析。RNA-Seq是一種基于NGS技術(shù)的新的轉(zhuǎn)錄分析方法。采用NGS技術(shù)對從感興趣的RNA樣本序列反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進行測序[17-19]。簡而言之，就是對剪切變體、轉(zhuǎn)錄后RNA編輯、內(nèi)含子表達水平和特定等位基因的表達情況進行定性和定量分析。

2.2 RNA-Seq原理

在對基因組測序和分析研究的同時，復雜的轉(zhuǎn)錄組研究也廣泛發(fā)展起來。利用高通量測序技術(shù)平臺分析轉(zhuǎn)錄組的結(jié)構(gòu)和表達水平情況，更能挖掘未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本信息，精確地識別RNA 的選擇性剪切以及編碼序列的單核苷酸多態(tài)性（SPN），進一步解析復雜的轉(zhuǎn)錄組信息[20]。最初的轉(zhuǎn)錄組研究主要以基因芯片微陣列技術(shù)為基礎(chǔ)，而基因芯片技術(shù)的檢測范圍取決于芯片上的探針信息，所以只能檢測已知序列的特征，缺少發(fā)現(xiàn)新基因的能力。而高通量測序技術(shù)可以很好地彌補基因芯片技術(shù)在這方面的不足。因此，現(xiàn)階段轉(zhuǎn)錄組的研究是借助于NGS[21]來完成的。通過構(gòu)建cDNA文庫并對cDNA 進行高通量測序，分析測序結(jié)果進而解析轉(zhuǎn)錄組學中的復雜變化。目前，以基因測序技術(shù)為核心的新技術(shù)平臺支撐體系已經(jīng)相對成熟和完善，例如：Illumina公司的Solexa測序技術(shù)、羅氏公司的454測序技術(shù)、ABI公司的SOLID測序技術(shù)以及美國螺旋生物科學公司的新型納米孔測序技術(shù)等[13]。

隨著NGS技術(shù)的不斷更新和提高而日益成熟完善，RNA測序技術(shù)平臺在測序通量、測序長度、錯配率、堿基配對讀取能力等測序性能方面技術(shù)的提高均有利于轉(zhuǎn)錄組的研究。RNA-Seq技術(shù)的不斷更新和創(chuàng)新，為人類逐步全面了解真核生物和原核生物的轉(zhuǎn)錄組信息提供了新的定性和定量的生物信息學方法。

2.3 RNA-Seq技術(shù)優(yōu)勢

相比基因芯片和標記的堿基序列的測序方法，RNA-seq具有一定的優(yōu)越性。與基因芯片相比，RNA-Seq不僅可以在更高的分辨率下用來測量基因的表達水平情況，還可以揭示未知的轉(zhuǎn)錄組和拼接亞型，并為選擇性拼接亞型提供定量分析[22]。相對于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺，轉(zhuǎn)錄組測序無需預(yù)先針對已知序列設(shè)計探針，即可對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進行檢測，提供更精確的數(shù)字化信號、更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，是目前深入研究復雜性轉(zhuǎn)錄組的強大工具。鑒于這些優(yōu)勢，RNA-Seq很快就被應(yīng)用到癌癥相關(guān)研究的多個方面。Brooks等[23]研究發(fā)現(xiàn)，相比于qRT-PCR，NGS能夠更加全面以及更加準確地定量和定性評價細胞或組織中的mRNA。NGS可以對細胞或組織中的RNA分子的所有亞型進行量化和綜合評價。同時，RNA-seq技術(shù)可以檢測到低水平表達、未識別的轉(zhuǎn)錄子和新拼接亞型基因[24]。另一方面，與基因芯片相比，RNA-Seq有一個更廣的檢測動態(tài)范圍，可以研究編碼和非編碼RNA，更易于基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、發(fā)現(xiàn)選擇性剪切轉(zhuǎn)錄物，檢測到等位基因的具體表達方式，也可以用來提取基因型信息。在RNA-Seq單細胞研究[25]中，一個主要優(yōu)勢是可以分析整個轉(zhuǎn)錄序列，而不是有限制數(shù)量的基因，并且，研究DNA和RNA的方法并不是相互排斥的，他們可以相互結(jié)合使用，產(chǎn)生更多的生物學上重要的信息[26]。

3 RNA-Seq在腫瘤中的應(yīng)用

癌癥的生物起源、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)錄組中的許多變化息息相關(guān)?；虻倪x擇性剪接是一個主要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，參與許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。NGS應(yīng)用于RNA層面上的研究，為研究轉(zhuǎn)錄組提供了一種新技術(shù)。同時，實體腫瘤與生物學特征及臨床行為息息相關(guān)，在治療方面越來越凸顯出個體化治療的重要性，而RNA-Seq是一種比較合適的技術(shù)來評估個性化的治療效果[27]。

3.1 RNA測序與食道鱗狀細胞癌

食管癌是一種常見的惡性腫瘤。陳友芳等[28]對6對食管鱗癌（ESCC）組織及同一患者的正常食管黏膜組織進行RNA-Seq分析，發(fā)現(xiàn)142個差異表達基因。Ma等[29]對3例確診為ESCC患者的癌組織和癌旁組織進行RNA-Seq分析。在癌組織中，PTK6均為低表達，并運用免疫組化、RT-PCR、流式細胞儀等技術(shù)進行驗證，發(fā)現(xiàn)PTK6可能是通過影響Akt/GSK3/β-catenin信號通路，從而促進腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移。Jiang等[30]通過對一個確診為ESCC患者的癌組織和癌旁組織進行RNA-Seq分析，確定新型融合基因HLA-E和HLA-B。該融合基因有望為ESCC的診斷和治療提供新的靶點，使我們更加了解ESCC的形成機制。

3.2 RNA測序與肺癌

肺癌的5年生存率不到15%。Beane等[31]利用RNA測序技術(shù)分析了抽煙對肺癌的影響，揭示了抽煙與肺癌的關(guān)系以及肺癌的發(fā)生機制。Riccardo等[32]在K-rasLA1/p53R172HΔg小鼠非小細胞肺癌模型中，運用RNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)GM-CSF和ADORA3的高表達均與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。ADORA3參與肺癌細胞系中p53誘導凋亡過程。在p53突變的腫瘤中，ADORA3有望成為潛在免疫治療的靶點。lncRNAs的破壞在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，Ricciuti等[33]揭示lncRNAs是早期非小細胞肺癌患者潛在生物標志物，可以預(yù)測腫瘤患者對化療和靶向治療的敏感性。

3.3 RNA測序與前列腺癌

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，同時也是男性中因癌癥死亡的第二大原因。Palanisamy等[34]對前列腺癌（PCa）組織標本進行RNA-Seq分析來探索新的嵌合體融合轉(zhuǎn)錄片段，最后分析發(fā)現(xiàn)了7種腫瘤特異性融合基因——其中有兩個是ETS基因家族中的ETl和ERG基因，4個是非ETS基因如CDKNlA（p21），CD9和IKBκB（IKK-beta）。該研究首次把非ETS基因納入到PCa融合基因中。Eswaran等[35]分析了15例前列腺癌樣本的RNA-Seq結(jié)果，驗證了RAF信號途徑在癌癥發(fā)病過程中起到了非常重要的作用，同時也表明了RAF信號途徑中的融合基因有潛力成為抗腫瘤治療與抗腫瘤藥物篩選的靶點。Xu等[36]利用RNA測序數(shù)據(jù)對前列腺癌的體細胞突變進行篩查，得到一組可用于前列腺癌的診斷和治療的候選基因。

3.4 RNA-Seq面臨的挑戰(zhàn)及發(fā)展前景

目前，RNA-seq技術(shù)仍處于起步階段，然而它的優(yōu)越性明顯超過傳統(tǒng)的芯片雜交測序方法。在過去的幾年中，RNA-seq在研究人類癌癥的轉(zhuǎn)錄注釋、基因轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)的確定、不同轉(zhuǎn)錄生物過程的定量分析中做出了不可磨滅的貢獻。隨著RNA-seq技術(shù)不斷發(fā)展和成本持續(xù)下降，在未來幾年中，將RNA-seq技術(shù)應(yīng)用于人類腫瘤的研究中，相信很有可能會產(chǎn)生更加令人振奮的發(fā)現(xiàn)。

此外，RNA-Seq實驗還可以揭示出那些基因芯片不能檢測出的新型的轉(zhuǎn)錄子、非編碼RNA和其他小分子RNA 。我們認識到，拼接變異以及其他基因組變化是腫瘤重要的驅(qū)動因素[34]。RNA-Seq可以有效捕獲內(nèi)含子水平的亞型和非編碼基因。在尋找與癌癥預(yù)后、診斷及治療靶點的生物標志上，RNA-Seq是一種很有潛力的實驗技術(shù)，為研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供了一個前所未有的機遇。

惡性腫瘤嚴重威脅人類健康，是世界各國醫(yī)學科學領(lǐng)域中的重大科研課題。目前每年大約有200萬例新發(fā)病例，130萬人死于惡性腫瘤，是目前中國人的第三大死因。早治療、早診斷可以提高患者生活質(zhì)量。我們相信，基于網(wǎng)絡(luò)的生物學方法可以為解釋腫瘤的發(fā)病機制和發(fā)現(xiàn)腫瘤的新藥物靶點奠定有力基礎(chǔ)；為腫瘤患者的預(yù)診斷及治療提供理論及實驗依據(jù)，有望進一步提高腫瘤患者的生活質(zhì)量。RNA-Seq可以有效捕獲內(nèi)含子水平的亞型和非編碼基因[19]。在尋找與癌癥預(yù)后、診斷及治療靶點的生物標志上，RNA-Seq是一種很有潛力的實驗技術(shù)，為研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供了一個前所未有的機遇。

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（收稿日期：2015-10-02 本文編輯：張瑜杰）