金濤 王松林 李東波 楊濤 宋錦寧

[摘要] 目的 研究彌漫性軸索損傷（DAI）對大鼠腦皮質(zhì)鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1（ORAI1）表達的影響。 方法 利用瞬間旋轉(zhuǎn)損傷裝置，建立大鼠DAI模型，分為DAI組及對照組，DAI組又分為DAI組傷后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d等5個亞組。運用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠DAI后腦皮質(zhì)的病理生理變化；運用免疫組化檢測大鼠腦皮質(zhì)ORAI1的分布及表達。 結(jié)果 HE染色顯示，DAI傷后6 h～1 d神經(jīng)元變性、壞死、崩解數(shù)量增多，軸索的斷裂和紊亂明顯；DAI傷后3～14 d，開始恢復(fù)期改變，神經(jīng)元的變性、水腫和壞死現(xiàn)象逐漸減少。免疫組化檢測顯示，與對照組比較，DAI傷后6 h大鼠腦皮質(zhì)ORAI1的表達即開始增加，傷后1 d達高峰，傷后3～14 d逐漸降低，至傷后14 d時仍高于對照組（P < 0.05）。 結(jié)論 DAI后大鼠腦皮質(zhì)ORAI1的表達水平呈先增加后降低的趨勢，這一變化與大鼠DAI后腦皮質(zhì)的病理生理變化有關(guān)，ORAI1可能參與DAI后的病理生理過程。

[關(guān)鍵詞] 鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1；大鼠；彌漫性軸索損傷；病理生理

[中圖分類號] R651.1 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（c）-0022-04

Influence of diffuse axonal injury on expression of ORAI1 in brain cortex of rat

JIN Tao1 WANG Songlin1 LI Dongbo1 YANG Tao1 SONG Jinning2

1.Department of Neurosurgery， Center Hospital of Ankang City， Shaanxi Province， Ankang 725000， China； 2.Department of Neurosurgery， the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University， Shaanxi Province， Xi′an 710061， China

[Abstract] Objective To investigate influence of diffuse axonal injury （DAI） on expression of calcium release-activated calcium channel modulator 1 （ORAI1） in brain cortex of rat. Methods Lateral head-rotating device was used to establish DAI model. Rats were randomly divided into control group and DAI groups， which contained five subgroups （6 h， 1 d， 3 d， 7 d， 14 d after injury）. HE staining was used to observe pathological change in cerebral cortex after DAI and immunohistochemistry staining was applied to determine the distribution and expression of ORAI1. Results HE staining showed increased neuronal degeneration and necrosis at 6 h-1 d after DAI. Structural distortion of axons were observed. During 3 d to 14 d， neuronal recovery began. Degeneration， edema and necrosis of neuron gradually alleviated. Immunohistochemistry showed increase of ORAI1 expression began at 6 h in cortex after DAI； peaked at 1 d and gradually deceased from 3 d to 14 d； at 14 d， expression of ORAI1 still remained higher than control group （P < 0.05）. Conclusion ORAI1 expression significantly increase and then decrease in cerebral cortex of rats after DAI. Dynamic change of ORAI1 after DAI positively correlates with the pathological evolution， indicating the possible role of ORAI1 in pathophysiology of DAI.

[Key words] Calcium release-activated calcium channel modulator 1； Rat； Diffuse axonal injury； Pathophysiology

彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury，DAI）致殘率及死亡率高，發(fā)病機制不清，臨床尚無有效的治療手段，深入揭示DAI的發(fā)病機制可以為臨床治療DAI提供新的思路。鈣離子（Ca2+）是細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中最常見的信使，在病理條件下，Ca2+超載在機體許多疾病的發(fā)生中都扮演著重要角色[1]。DAI后伴隨著缺氧缺血，能量代謝發(fā)生障礙，胞內(nèi)Ca2+濃度急劇升高，形成鈣超載，導(dǎo)致鈣依賴性酶激活、自由基形成、能量耗竭等一系列生化反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。鈣庫調(diào)控的鈣內(nèi)流（store-operated calcium entry，SOCE）是非興奮細(xì)胞主要的鈣內(nèi)流方式，參與機體眾多的生理過程。SOCE的形成有兩個關(guān)鍵蛋白，即基質(zhì)相互作用分子1（stromal interaction molecule 1，STIM1）和鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1（calcium release-activated calcium channel modulator 1，ORAI1）[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，DAI后大鼠大腦皮質(zhì)中STIM1的表達升高，其可能參與DAI后的鈣超載[3]。本研究擬利用大鼠DAI模型，研究DAI后ORAI1蛋白的動態(tài)變化，探討該蛋白在DAI后病理生理發(fā)展過程中的角色，從而為DAI的臨床診治提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供的2月齡、體重250～300 g、具有相同遺傳背景的健康成年雄性SD大鼠60只，合格證號：SCXK（陜）08-018。該實驗倫理經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。將大鼠置于（22±2）℃的環(huán)境中，在12 h照明、12 h黑暗的條件下，用標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)7 d后開始實驗。采用完全隨機分組將大鼠分為對照組和DAI組，其中對照組10只，DAI組按受傷后的時間分為傷后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d等5個亞組，每個亞組10只。具體方法為：按體重從小到大對60只大鼠進行編號，編號為從隨機數(shù)字表中任選的60個隨機數(shù)字，遇相同數(shù)字時，則取下一個隨機數(shù)，然后對編號從小到大進行排序，從排序后的數(shù)字中規(guī)定前10個為對照組，再10個為DAI組傷后6 h，依次類推。

1.2 DAI模型的建立

DAI模型利用大鼠頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)損傷裝置制備[4]：大鼠經(jīng)100 g/L水合氯醛麻醉（0.2～0.3 mL/100 g），成功后固定于裝置，大鼠剛蘇醒時，按動扳機，使大鼠頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)90°，重復(fù)8次。對照組大鼠僅固定于裝置上。DAI組大鼠在預(yù)定時間經(jīng)鹽水、多聚甲醛灌注后取腦。

1.3 實驗方法

1.3.1 蘇木精-伊紅（HE）染色評估DAI后的病理變化 取出的大鼠腦組織繼續(xù)固定48 h，石蠟包埋、切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。先后經(jīng)蘇木素染色、鹽酸乙醇分化，切片經(jīng)自來水浸泡后再置入伊紅液。常規(guī)脫水，透明，封片。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法檢測ORAI1 取切片，常規(guī)脫蠟、水化，高壓法抗原修復(fù)，ORAI1（濃度1∶200，博奧森，中國）采用SP染色法，具體步驟嚴(yán)格按照說明書操作。每個組織的免疫組化染色重復(fù)3次，每張切片隨機選取6個視野（400×），Leica-Q550CW圖像分析系統(tǒng)采集圖像。采用Image-Pro Plus 6.0軟件計數(shù)ORAI1陽性細(xì)胞百分比進行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦皮質(zhì)HE染色結(jié)果

與DAI組比較，對照組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)纖維排列整齊，無其他病理學(xué)改變；DAI組傷后6 h可見組織結(jié)構(gòu)疏松、神經(jīng)元水腫及軸索腫脹，部分神經(jīng)元壞死；DAI組傷后1 d時組織損傷進一步加重，神經(jīng)元變性、壞死、崩解數(shù)量增多，尼氏小體的數(shù)量大幅減少，甚至消失，軸索的斷裂和紊亂也更加嚴(yán)重；DAI組傷后3～14 d，開始出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)期改變，組織結(jié)構(gòu)疏松減輕，神經(jīng)元的變性、水腫和壞死現(xiàn)象逐漸減少（圖1）。

A：對照組；B、C、D、E、F：DAI組傷后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d；DAI：彌漫性軸索損傷

圖1 各組大鼠腦皮質(zhì)HE染色（400×）

2.2 各組大鼠腦皮質(zhì)ORAI1的表達

對照組大鼠腦皮質(zhì)幾乎不表達ORAI1；DAI組ORAI1陽性表達位于神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞漿，其陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較對照組明顯升高（圖2）。各組大鼠腦皮質(zhì)ORAI1的表達比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；DAI組傷后6 h時ORAI1的表達升高（P < 0.05），DAI組傷后1 d時ORAI1的表達達高峰（P < 0.05），DAI組傷后3、7、14 d，ORAI1的表達逐漸降低，但仍高于對照組（P < 0.05）。見表1。

A：對照組；B、C、D、E、F：DAI組傷后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d；DAI：彌漫性軸索損傷；ORAI1：鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1

圖2 各組大鼠腦皮質(zhì)ORAI1的表達（SP染色法，400×）

表1 各組大鼠腦皮質(zhì)ORAI1陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)比較

注：與對照組比較，*P < 0.05；與DAI組傷后6 h比較，#P < 0.05；與DAI組傷后1 d比較，▽P < 0.05；與DAI組傷后3 d比較，▲P < 0.05；與DAI組傷后7 d比較，△P < 0.05；DAI：彌漫性軸索損傷；ORAI1：鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1

3 討論

DAI是一種特殊類型的顱腦外傷，其病理改變以廣泛軸索斷裂為特征，患者多預(yù)后不良[5-7]。目前DAI的發(fā)病機制仍不清楚，臨床治療手段單一，療效欠佳，因此揭示DAI后繼發(fā)的病理生理變化，可以為臨床治療DAI提供新的思路和方向，而穩(wěn)定、有效的DAI模型建立是研究DAI后病理生理機制的關(guān)鍵。本研究采用頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)裝置模擬大鼠DAI模型，HE染色是評價DAI病理過程的經(jīng)典方法。DAI后皮質(zhì)經(jīng)HE染色可見組織疏松、神經(jīng)元水腫及軸索腫脹，尼氏小體減少，神經(jīng)元壞死，胞體及軸索周圍間隙增大，這種病理變化在傷后6 h可見，1 d時達高峰，這可能是因為DAI可以導(dǎo)致微循環(huán)的破裂、出血，神經(jīng)元和白質(zhì)的彌漫性損害，并伴隨著缺氧、二氧化碳蓄積、顱內(nèi)高壓等引起DAI后的繼發(fā)性損害；在傷后3～14 d，大腦皮質(zhì)處于恢復(fù)期[8-9]。HE結(jié)果提示該模型有效，能很好地模擬DAI后的病理生理過程。

SOCE多在大多數(shù)非興奮細(xì)胞和少數(shù)興奮細(xì)胞內(nèi)起到介導(dǎo)鈣流入的作用，STIM1和ORAI1是形成SOCE的關(guān)鍵蛋白[10]。ORAI1是位于細(xì)胞膜上的選擇性Ca2+通道蛋白，在靜息狀態(tài)下，ORAI1主要以二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)膜上；其活化時需要4個分子共同組成四聚體，這個聚合體與STIM1相互作用，形成細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流的通道[11]。ORAI1參與的SOCE與蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦缺血、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及外傷性癲癇等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，ORAI1蛋白的表達明顯升高，其介導(dǎo)的SOCE通道開放，導(dǎo)致Ca2+濃度持續(xù)升高，參與疾病的病理生理過程[12-17]。在本研究中，DAI傷后6 h即可觀察到ORAI1在大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)的表達升高，傷后1 d時ORAI1的表達達高峰，傷后3～14 d，ORAI1的表達逐漸降低，ORAI1表達量的動態(tài)變化提示ORAI1可能與DAI后SOCE介導(dǎo)的鈣超載有關(guān)，但是具體的作用及可能機制仍不清楚。ORAI1的變化趨勢與大腦皮質(zhì)DAI后的病理變化呈時相相關(guān)，這提示DAI后大腦皮質(zhì)ORAI1的表達變化參與DAI后大腦皮質(zhì)的病理生理過程。此外，在本研究中，即使到了傷后14 d，ORAI1的表達仍較對照組高，提示ORAI1參與DAI后病理改變的時限較長，可能與DAI后的慢性退行性病變有關(guān)。本研究的時間點局限在傷后14 d，這是本研究的不足之處，繼續(xù)深入研究ORAI1在DAI后慢性期的作用對揭示其病理機制也有一定意義。

本研究還發(fā)現(xiàn)，DAI后ORAI1在胞質(zhì)內(nèi)染色深，范圍廣，幾乎可見于皮質(zhì)內(nèi)所有的細(xì)胞類型，且近年研究顯示，ORAI1表達于神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)祖細(xì)胞，并參與其各自的病理變化過程[18-23]。小膠質(zhì)細(xì)胞在腦外傷后最快被激活并起主要免疫作用，受損細(xì)胞釋放的物質(zhì)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移，由STIM1和ORAI1調(diào)節(jié)的SOCE參與小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的改變，并介導(dǎo)其活化[19-20]。本研究HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DAI后伴隨著大量小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，而ORAI1的表達升高可能參與此過程。神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖是神經(jīng)再生的關(guān)鍵，細(xì)胞增殖依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。研究發(fā)現(xiàn)，SOCE參與神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖，敲除ORAI1或STIM1可以顯著抑制SOCE和神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖[21]。因此，ORAI1可能也參與DAI導(dǎo)致的神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖。既往研究認(rèn)為，SOCE在非興奮細(xì)胞鈣內(nèi)流的機制中起重要作用，但是，與非興奮細(xì)胞相似，STIM1和ORAI1也參與神經(jīng)元內(nèi)SOCE的形成。DAI后神經(jīng)軸索的斷裂分為原發(fā)性和繼發(fā)性，原發(fā)性斷裂發(fā)生于受傷的瞬間，而繼發(fā)性斷裂發(fā)生于傷后的數(shù)小時至數(shù)天。DAI后神經(jīng)元內(nèi)Ca2+超載在繼發(fā)性軸索斷裂的過程中起重要作用。DAI后，軸索膜通透性增加，細(xì)胞外Ca2+流入，軸索內(nèi)Ca2+濃度升高，導(dǎo)致核溶解、細(xì)胞結(jié)構(gòu)崩解、軸索腫脹等一系列的病理改變，鈣超載是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的最后共同通路[22]。SOCE是介導(dǎo)胞外Ca2+進入細(xì)胞內(nèi)的重要通道之一，既往研究證實，STIM1與DAI后早期鈣超載有關(guān)，而本研究發(fā)現(xiàn)，DAI后神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞內(nèi)ORAI1的表達升高；這種改變在受損神經(jīng)元內(nèi)尤其明顯，提示ORAI1可能也參與神經(jīng)元內(nèi)SOCE介導(dǎo)的鈣超載，這與既往的研究結(jié)果相吻合[23]。

綜上所述，DAI后大鼠腦皮質(zhì)ORAI1的表達升高后逐漸降低，其表達變化趨勢與DAI后大腦損傷程度一致。闡明DAI后ORAI1在相關(guān)病理過程中的作用可能揭示DAI的新機制，并為DAI的治療提供新的思路。

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（收稿日期：2015-11-05 本文編輯：李亞聰）