余玲 肖同楚 屈亞莉 湛進(jìn)進(jìn) 郭蓮軍

[摘要] 目的 研究本實(shí)驗(yàn)室分離提取的米邦塔仙人掌果膠（MCP）對(duì)小鼠慢性溫和應(yīng)激（CUMS）模型學(xué)習(xí)記憶影響。 方法 采用Morris水迷宮（MWM）對(duì)60只小鼠進(jìn)行篩選后按照隨機(jī)數(shù)字表分為5組（每組12只）：正常對(duì)照組、CUMS模型組、MCP低劑量組（50 mg/kg）、MCP中劑量組（100 mg/kg）、MCP高劑量組（200 mg/kg）。建立CUMS模型，造模結(jié)束96 h后進(jìn)行MWM實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果 學(xué)習(xí)訓(xùn)練結(jié)束時(shí)，模型組小鼠逃逸潛伏期和游泳總路程顯著長(zhǎng)于對(duì)照組（P < 0.01），在靶標(biāo)象限游泳路程/游泳總路程和穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯低于對(duì)照組（P < 0.05或P < 0.01），MCP中、高劑量組小鼠逃逸潛伏期與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），游泳總路程與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），穿越平臺(tái)的次數(shù)顯著增加（P < 0.05），而模型組、MCP各劑量組的小鼠游泳速度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 MCP對(duì)CUMS小鼠學(xué)習(xí)記憶具有一定的改善作用。

[關(guān)鍵詞] 米邦塔仙人掌果膠；慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激；學(xué)習(xí)記憶；小鼠

[中圖分類號(hào)] R965 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）02（c）-0014-05

Effect of milpa alta cactus pectin on learning and memory in mice exposed to chronic unpredictable mild stress

YU ling1 XIAO Tongchu1 QU Yali2 ZHAN Jinjin3 GUO Lianjun3

1.Department of Obstetrics and Gynecology and Chronic Disease Management， Yiling District Maternal and Child Health Hospital， Hubei Province， Yichang 443100， China； 2.Department of Interventional Ultrasound， Wuhan Medical Treatment Center， Hubei Province， Wuhan 430023， China； 3.Department of Pharmacology， School of Basic Medical Sciences， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Hubei Province， Wuhan 430030， China

[Abstract] Objective To explore the effect of milpa alta cactus pectin （MCP） on learning and memory in mice exposed to chronic unpredictable mild stress （CUMS）. Methods A total of 60 qualified mice selected by Morris water Maze （MWM） were randomly divided into 5 groups using the random number table （12 mice in each group）； Control group， CUMS group， MCP low dose group （50 mg/kg）， MCP medium dose group （100 mg/kg）， and MCP high dose group （200 mg/kg）. The MWM test was conducted to evaluate the ability of learning and memory in 96 hours after the mice were exposed to CUMS. Results At the end of learning acquisition， compared with the control group， the escape latency and total swimming distance of CUMS group were significantly increased （P < 0.01）， while the target quadrant swimming distance/total swimming distance and the time of crossing platform were significantly decreased （P < 0.05）. Compared with CUMS group， MCP in medium dose group （100 mg/kg） and high dose group （200 mg/kg） significantly reduced the escape latency （P < 0.01） and the total swimming distance （P < 0.05）， but not for the target quadrant swimming distance/total swimming distance （P > 0.05）. CUMS and MCP treatment had no effect on the swimming speed in mice （P > 0.05）. Conclusion MCP shows an improving effect on learning and memorizing in mice exposed to CUMS.

[Key words] Milpa alta cactus pectin； Chronic unpredictable mild stress； Learning and memory； Mice

慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型能很好地模擬人類抑郁癥中慢性、低水平應(yīng)激可導(dǎo)致的疾病發(fā)生，是一種用于研究疾病發(fā)生的良好動(dòng)物模型[1]。CUMS造模過(guò)程中所用的各種應(yīng)激因子能較好地模擬人類抑郁癥狀的發(fā)生[2]；同時(shí)也能較好地模擬抑郁患者其他的一些神經(jīng)系統(tǒng)功能改變，如認(rèn)知能力下降等；大量研究證實(shí)，CUMS導(dǎo)致海馬依賴性認(rèn)知功能損傷[3-5]。目前國(guó)內(nèi)外研究者廣泛應(yīng)用此模型評(píng)價(jià)藥物對(duì)抑郁癥及相關(guān)學(xué)習(xí)記憶損傷的改善作用[6-7]。果膠（Pectin）是一種復(fù)雜的多糖，其主要成分是部分甲酯化的a（l，4）-D-聚半乳糖醛酸[8]，大量研究顯示多種植物果膠有較好的抗氧化、抗炎、抗?jié)儭⒖拱┖驼{(diào)節(jié)免疫的作用[9-12]。關(guān)于米邦塔仙人掌果膠（MCP）對(duì)中樞系統(tǒng)的影響報(bào)道較少。因此本文探討MCP對(duì)慢性溫和型應(yīng)激模型小鼠學(xué)習(xí)記憶是否有改善作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

MCP，棕色粉末，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系提取，用雙蒸水溶解配制成低、中、高三種濃度（5、10、20 mg/mL），調(diào)節(jié)pH值至中性。水迷宮試驗(yàn)系統(tǒng)及分析軟件（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

15～20 g清潔級(jí)的健康雄性昆明種小鼠，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK（鄂）2008-0007，合格證號(hào)：00020736]，動(dòng)物飼養(yǎng)：12 h晝夜交替，室溫（24±2）℃，空氣濕度（50±10）%，除造模及必要的斷水?dāng)嗍惩?，小鼠均可自由進(jìn)水進(jìn)食。

采用Morris水迷宮（MWM）檢測(cè)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，將篩選合格的60只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組（每組12只，造模前各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）：①正常對(duì)照組；②CUMS模型組；③MCP低劑量組（50 mg/kg）；④MCP中劑量組（100 mg/kg）；⑤MCP高劑量組（200 mg/kg）。正常對(duì)照組：不進(jìn)行任何應(yīng)激處理；模型組：持續(xù)6 周給予1.3中的應(yīng)激處理；果膠處理組：各組均進(jìn)行應(yīng)激處理，期間每天上午9：00～10：00灌胃給藥，灌胃體積為0.1 mL/10 g，模型組給予同等體積的雙蒸水。

1.3 慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激模型制備

在造模過(guò)程包括以下11種應(yīng)激因子：①斷水16 h時(shí)，②斷食16 h，③45°傾斜鼠籠4 h，④潮濕墊料24 h，⑤通宵照明，⑥2 h-2 h時(shí)晝夜交替，⑦晝夜顛倒，⑧陌生氣味4 h，⑨4℃水溫游泳，⑩陌生氣味4 h，■活動(dòng)限制2 h。以周為時(shí)間單位，每天給予2～3種不同刺激因子進(jìn)行應(yīng)激，每次應(yīng)激時(shí)間間隔48 h，應(yīng)激處理共歷時(shí)6周。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

在一間光線均勻的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，所有陳設(shè)位置相對(duì)固定。實(shí)驗(yàn)前，先將小鼠放在實(shí)驗(yàn)室1 h以適應(yīng)。實(shí)驗(yàn)條件：室溫25℃，水溫18～22℃。通過(guò)攝像系統(tǒng)實(shí)時(shí)拍攝小鼠的游泳軌跡，然后經(jīng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)軟件計(jì)算游泳速度及游泳總路程等。

實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行，①定位航行實(shí)驗(yàn)：小鼠每天訓(xùn)練4次，連續(xù)訓(xùn)練5 d，在10：00～14：00進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)小鼠分別從4個(gè)不同的入水點(diǎn)，并將小鼠頭朝游泳桶壁入水，任其游泳，直到找到平臺(tái)，每次訓(xùn)練間隔為10 min。設(shè)定每次試驗(yàn)時(shí)間為60 s，小鼠在60 s內(nèi)達(dá)到平臺(tái)的時(shí)間即逃逸潛伏期被記錄下來(lái)；如果60 s內(nèi)沒(méi)能找到平臺(tái)的記其潛伏期為60 s。②空間探索實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)第6天12：00進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤出平臺(tái)，設(shè)定試驗(yàn)時(shí)間為30 s，小鼠從第4象限中間點(diǎn)入水，記錄小鼠穿越目標(biāo)區(qū)域的次數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，重復(fù)測(cè)量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析并結(jié)合LSD檢驗(yàn)或Tamhane's T2檢驗(yàn)比較各指標(biāo)的組間差異，單因素方差分析并結(jié)合LSD檢驗(yàn)比較空間探索實(shí)驗(yàn)中采用組間差異，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCP對(duì)小鼠CUMS損傷空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

小鼠在連續(xù)訓(xùn)練5 d的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)在訓(xùn)練的第1天，各組小鼠尋找靶標(biāo)所需時(shí)間較長(zhǎng)，而經(jīng)過(guò)訓(xùn)練后，各組小鼠尋找靶標(biāo)的時(shí)間均有縮短。結(jié)果發(fā)現(xiàn)從第2天起，CUMS模型組明顯長(zhǎng)于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。在訓(xùn)練第5天，MCP中、高劑量處理組小鼠逃逸潛伏期顯著低于CUMS模型組（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 MCP對(duì)小鼠CUMS模型游泳速度的影響

從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可以看出，學(xué)習(xí)訓(xùn)練第1天，各組小鼠游泳速度均較快，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加從第2天開始，各組游泳速度趨于穩(wěn)定。學(xué)習(xí)訓(xùn)練第5天，正常對(duì)照組、CUMS模型組、MCP各劑量組的游泳速度之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 MCP對(duì)小鼠CUMS模型游泳總路程的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠在訓(xùn)練第1天，繞迷宮壁游泳的時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致游泳總路程較長(zhǎng)；隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，小鼠在入水后就有目的性的向著平臺(tái)方向游去，其游泳總路程縮短。在訓(xùn)練第5天，CUMS模型組的游泳總路程與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；而MCP中、高劑量組的游泳總路程顯著短于CUMS模型組（P < 0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 MCP對(duì)小鼠CUMS模型在目標(biāo)象限游泳路程/游泳總路程的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠在訓(xùn)練第5天，CUMS模型組小鼠在目標(biāo)象限游泳路程/游泳總路程正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；CUMS模型組、MCP各劑量組小鼠在目標(biāo)象限游泳路程/游泳總路程，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表4。

2.5 MCP對(duì)小鼠CUMS空間記憶能力的影響

空間探索實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)30 s內(nèi)小鼠穿越靶標(biāo)所在區(qū)域的次數(shù)評(píng)價(jià)小鼠的空間記憶能力。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組，CUMS模型組，MCP低、中、高劑量組次數(shù)分別為（2.69±0.44）、（1.50±0.27）、（1.70±0.42）、（2.60±0.27）、（2.70±0.42）次。CUMS模型組小鼠穿越越平臺(tái)次數(shù)與正常對(duì)照組比較（P<0.01）；而MCP中、高劑量組小鼠穿越次數(shù)與CUMS型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討論

MWM實(shí)驗(yàn)?zāi)壳氨粡V泛用于評(píng)價(jià)嚙齒目動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力的一種研究手段，已有文獻(xiàn)報(bào)道CUMS模型損傷動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力[7]，故本實(shí)驗(yàn)中用MWM評(píng)價(jià)MCP對(duì)CUMS小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用。已有臨床報(bào)道，抑郁癥患者往往伴有典型的學(xué)習(xí)記憶能力減退[13]，獲取的信息在存儲(chǔ)和再提取過(guò)程中顯示出異常。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)過(guò)一段時(shí)間慢性不可預(yù)知應(yīng)激后，尋找目標(biāo)的時(shí)間（即逃逸潛伏期）明顯延長(zhǎng)，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示小鼠空間學(xué)習(xí)能力減退。另一方面，通過(guò)檢測(cè)小鼠在靶標(biāo)象限的穿越次數(shù)，也就是空間探索試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CUMS模型組小鼠在靶標(biāo)象限穿越的次數(shù)與正常對(duì)照組，明顯減少，表明小鼠經(jīng)慢性不可預(yù)知應(yīng)激后，在空間學(xué)習(xí)能力減退的同時(shí)，空間記憶能力也受到損傷。而且通過(guò)檢測(cè)小鼠在目標(biāo)象限的游泳總路程/游泳總路程，發(fā)現(xiàn)CUMS模型組與正常對(duì)照組游泳速度和游泳總路程與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在目標(biāo)象限的游泳總路程與游泳總路程的比值亦明顯增加，說(shuō)明慢性應(yīng)激損傷對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)能力并無(wú)明顯影響，而對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力損傷更為明顯，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14-15]。有關(guān)慢性應(yīng)激損傷對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶的影響，也有不同的報(bào)道，認(rèn)為可使學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)[16]，其原因可能與使用的動(dòng)物種系和應(yīng)激方式不同有關(guān)。

國(guó)外研究顯示，仙人掌具有神經(jīng)保護(hù)和提高長(zhǎng)期記憶的作用，其機(jī)制可能是提高了腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（pERK）的表達(dá)水平[17-19]。李萬(wàn)銘等[20]報(bào)道仙人掌多糖可劑量依耐性改善慢性腦低灌注導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶功能減退，明顯改善小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞存活率；潘建萍等[21]發(fā)現(xiàn)仙人掌多糖能夠減輕缺氧/缺糖再給氧所致大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡作用，其機(jī)制可能與其增強(qiáng)機(jī)體的抗自由基抗氧化能力有關(guān)。李莉梅等[22]發(fā)現(xiàn)野生仙人掌多糖對(duì)DPPH·、N02-有較強(qiáng)的清除作用，并具有一定的還原能力，該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為這是一種具有開發(fā)潛力的抗氧化、防衰老的功能性食品或藥物。本研究結(jié)果顯示米邦塔仙人掌果膠100 mg/kg和200 mg/kg不影響小鼠游泳速度影響，但顯著降低CUMS小鼠逃逸潛伏期、游泳總路程，而且呈現(xiàn)劑量依賴性，表現(xiàn)出良好的學(xué)習(xí)記憶保護(hù)作用。

綜上所述，CUMS模型可導(dǎo)致動(dòng)物抑郁行為，并表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)記憶能力的降低。給予MCP治療后能顯著改善抑郁模型動(dòng)物的行為學(xué)與學(xué)習(xí)記憶能力的異常，表現(xiàn)出改善抑郁造成的認(rèn)知功能損傷的作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 謝正，李恒芬，代娟，等.抑郁癥動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)[J].國(guó)際神經(jīng)病學(xué)雜志，2007，23（4）：212-215.

[2] Keith S，Dobson MC，Scherrer LC，et al. Depression [M]. New York：Practitioners guide to evidence-based psychotherapy，2006：238-247.

[3] Gouirand AM，Matuszewich L. The effects of chronic unpredictable stress on male rats in the water maze [J]. Physiol Behav，2005，86（1-2）：21-31.

[4] Li XH，Liu NB，Zhang MH，et al. Effects of chronic multiple stress on learning and memory and the expression of Fyn， BDNF， TrkB in the hippocampus of rats [J]. Chin Med J （Engl），2007，120（8）：669-674.

[5] McLaughlin KJ，Gomez JL，Baran SE，et al. The effects of chronic stress on hippocampal morphology and function： an evaluation of chronic restraint paradigms [J]. Brain Res，2007，1161：56-64.

[6] Zhang Y，Gu F，Chen J，et al. Chronic antidepressant administration alleviates frontal and hippocampal BDNF deficits in CUMS rat [J]. Brain Res，2010，1366：141-148.

[7] Elizalde N，Gil-Bea FJ，Ramirez MJ，et al. Long-lasting behavioral effects and recognition memory deficit induced by chronic mild stress in mice： effect of antidepressant treatment [J]. Psychopharmacology （Berl），2008，199（1）：1-14.

[8] 胡國(guó)華.功能性食品膠[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

[9] Wong TW，Colombo G，Sonvico F. Pectin matrix as oral drug delivery vehicle for colon cancer treatment [J]. AAPS PharmSciTech，2011，12（1）：201-214.

[10] 王玉祿，李蘭蓮.果膠對(duì)大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化作用的影響[J].中華當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2005，3（9）：12-13.

[11] Ye MB，Lim BO. Dietary pectin regulates the levels of inflammatory cytokines and immunoglobulins in interleukin-10 knockout mice [J]. J Agric Food Chem，2010， 58（21）：11281-11286.

[12] Alimi H，Hfaiedh N，Bouoni Z，et al. Antioxidant and antiulcerogenic activities of Opuntia ficus indica f. inermis root extract in rats [J]. Phytomedicine，2010，17（14）：1120-1126.

[13] Christopher G，MacDonald J. The impact of clinical depression on working memory [J]. Cogn Neuropsychiatry，2005，10（5）：379-399.

[14] Li F，Zhang YY，Jing XM， et al. The influence of forepaw palmar sensorimotor deprivation on learning and memory in young rats [J]. Neurosci Res，2009，63（1）：17-23.

[15] Wang YT，Tan QR，Sun LL，et al. Possible therapeutic effect of a Traditional Chinese Medicine， Sinisan， on chronic restraint stress related disorders [J]. Neurosci Lett，2009，449（3）：215-219.

[16] Bartolomucci A，de Biurrun G，Czeh B，et al. Selective enhancement of spatial learning under chronic psychosocial stress [J]. Eur J Neurosci，2002，15（11）：1863-1866.

[17] Osuna-Marínez U，Reyes-Esparza J，Rodríguez-Fragoso L，et al. Cactus （Opuntia ficus-indica）：a Review on its Antioxidants Properties and Potential Pharmacological Use in Chronic Diseases [J]. Nat Prod Chem Res，2014，2：153.

[18] Karym E，Youssef E，Asmaa B，et al. Nopal Cactus （Opuntia ficus-indica） as a Source of Bioactive Compounds for Nutrition， Health and DiseaseMolecules [J]. Molecules，2014，19（9）：14879-14901.

[19] Abdelkarim G，F(xiàn)atma B，Mounir C，et al. The Preventive Approach of Biocompounactives （2）： A Review in Recent Advances in Common Fruits [J]. Int J Food Sci Nutr，2015，4（2）：189-207.

[20] 王萬(wàn)銘，王金芳.仙人掌多糖對(duì)慢性別腦低灌注小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的改善作用[J].神經(jīng)損傷與功能重建， 2015， 10（1）：68-69.

[21] 潘建萍，鐘禹霖，李文，等.仙人掌多糖對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞缺氧/缺糖再給氧損傷的保護(hù)作用[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2015，2（23）：4376.

[22] 李莉梅，李恒，朱苗，等.野生仙人掌多糖對(duì)DPPH·、N02-的清除能力及其還原能力研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（15）：121-123.

（收稿日期：2015-10-30 本文編輯：趙魯楓）