喻運(yùn)珍　余少梅　熊文靜　張生元　徐志強(qiáng)　鄭翠華　周汝珍

摘要：以CCl4誘導(dǎo)的草魚（Ctenopharyngodon idellus）急性肝損傷模型為基礎(chǔ)，考察姜黃素對(duì)肝臟組織的保護(hù)作用。對(duì)草魚腹腔注射不同劑量CCl4-橄欖油后，分別于不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性，確定CCl4-橄欖油最佳注射劑量和作用時(shí)間；以建立的草魚急性肝損傷模型為基礎(chǔ)，采用不同濃度姜黃素（5、25、75、150、300 mg/kg）進(jìn)行灌胃給藥，觀察草魚血清和肝臟組織中相關(guān)生化指標(biāo)變化情況。結(jié)果表明，用15%的CCl4-橄欖油腹腔注射（劑量為0.1 mL/10 g魚體重）24 h后，使草魚血清中GPT、GOT水平升高（P<0.05）；同時(shí)，150 mg/kg姜黃素能顯著（P<0.05）抑制血清中GOT和GPT水平的升高。姜黃素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的草魚肝組織損傷具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：草魚（Ctenopharyngodon idellus）；CCl4；姜黃素；肝損傷

中圖分類號(hào)：S943 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）06-1514-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.038

草魚（Ctenopharyngodon idellus）是中國(guó)“四大家魚”之一，是淡水養(yǎng)殖的主要品種，隸屬于硬骨魚類鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬。隨著魚類集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，養(yǎng)殖密度的迅速提高、人工配合飼料大量投喂、不規(guī)范藥物的使用、水體環(huán)境的日趨惡化、飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的失衡與缺失以及飼料中存在有毒物質(zhì)等不利影響因素越來(lái)越多，造成養(yǎng)殖魚類代謝失衡，特別是對(duì)魚類肝臟損害極為嚴(yán)重[1，2]。在魚類中，肝臟是中間代謝的主要器官，也是重要的營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存器官，易受多種病原體入侵，因此肝臟是毒理學(xué)、藥理學(xué)等學(xué)科研究的主要對(duì)象之一[3，4]。

中草藥制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中日益受到重視，其安全、無(wú)殘留、毒副作用小，不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，目前漁用的保肝護(hù)肝國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)藥物只有肝膽利康散[5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗HIV、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂和抗老年癡呆等作用[6-8]。目前關(guān)于姜黃素治療各種原因引起的肝損傷的研究較多，姜黃素對(duì)由CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞毒性有保護(hù)作用[9]，能顯著降低血清中轉(zhuǎn)氨酶活性，減輕肝細(xì)胞脂肪貯積、脂肪變性和肝臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等，保護(hù)肝細(xì)胞[10-12]，可以減輕由肝毒劑誘導(dǎo)肝臟病變產(chǎn)生的膠原纖維和細(xì)胞炎癥因子，防治或減輕肝纖維化，預(yù)防腫瘤細(xì)胞增殖而抑制肝臟腫瘤生成[13]。然而將姜黃素用于水產(chǎn)領(lǐng)域的保肝作用研究少有報(bào)道，本研究旨在探索姜黃素對(duì)草魚肝損傷的保護(hù)作用，為進(jìn)一步開發(fā)魚類免疫調(diào)節(jié)和保肝中草藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康草魚，體重（50±5.0） g，購(gòu)于武漢市武湖青魚良種場(chǎng)。

CCl4（分析純）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；不同濃度CCl4-橄欖油溶液（V/V，下同），配成9%、12%、15%、18%及21%的濃度。

羧甲基纖維素鈉購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，肝膽利康散購(gòu)于武漢市中博水產(chǎn)生物有限公司，姜黃素購(gòu)于寧波制藥有限公司。肝膽利康散和姜黃素分別用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成不同試驗(yàn)濃度。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)條件 試驗(yàn)在循環(huán)過(guò)濾水族缸中進(jìn)行，裝有充分曝氣的自來(lái)水，試驗(yàn)期間pH 6.5～7.2，水溫 24～34 ℃，DO>5 mg/L。

1.2.2 急性肝損傷模型建立 健康草魚隨機(jī)分為6組，每組20 尾，禁食24 h后稱體重，按 0.1 mL/10 g腹腔注射9%、12%、15%、18%、21%的CCl4-橄欖油溶液，空白對(duì)照組注射等體積橄欖油。注射后分別于24、48、72、96 h采樣，每組取魚5尾，尾靜脈采血，4 ℃下靜置1 h后3 000 r/min離心10 min，取上清得到血清；取部分肝臟組織用10%甲醛固定。血清中的GPT、GOT活性采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定；固定的肝組織制作石蠟切片并用HE染色。若動(dòng)物在試驗(yàn)中死亡，則不進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 姜黃素藥效試驗(yàn) 草魚隨機(jī)分為8個(gè)組，每組20尾，即5個(gè)試驗(yàn)組（5、25、75、150、300 mg/kg姜黃素）、陽(yáng)性對(duì)照組（肝膽利康散100 mg/kg）、損傷組及空白對(duì)照組，空白對(duì)照組和損傷組口灌0.5%羧甲基纖維素鈉，試驗(yàn)組口灌相應(yīng)劑量藥物，按0.1 mL/10 g口灌給藥1周。禁食24 h后，按0.1 mL/10 g腹腔注射15%的CCl4-橄欖油溶液，空白對(duì)照組注射等體積橄欖油，24 h后每組取魚5尾，尾靜脈采血，4 ℃下靜置1 h后3 000 r/min離心10 min，取上清得到血清；取部分肝臟組織用10%甲醛固定。血清中的GPT、GOT活性采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定；固定的肝組織制作石蠟切片并用HE染色。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝損傷模型的評(píng)價(jià)

隨機(jī)分為6組的草魚，每組 20 尾，禁食 24 h 后稱體重，按 0.1 mL/10 g分別腹腔注射9%、12%、15%、18%、21%的CCl4-橄欖油溶液，空白對(duì)照組注射等體積橄欖油。18%和21%的CCl4溶液造模組草魚死亡率分別為40%和55%，其他濃度的處理組和對(duì)照組均沒(méi)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。對(duì)9%、12%、15%處理組分別于24、48、72、96 h進(jìn)行采樣，每組取魚5尾，尾靜脈采血。血清中GPT、GOT活性測(cè)定結(jié)果見圖1。從圖1中可以看出，9%、12%、15%的CCl4-橄欖油溶液處理24 h均能引起血清中GPT和GOT顯著升高（P<0.05），其中15%處理組相對(duì)其他兩組，升高最為顯著；GPT、GOT 24 h后開始下降，而在48 h時(shí)呈上升趨勢(shì)。肝組織切片顯微結(jié)構(gòu)見圖2，15%劑量攻毒24 h后組織會(huì)出現(xiàn)壞死及空泡，而空白對(duì)照組肝細(xì)胞分布均勻，幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有壞死和空泡（圖2）。因此，選取15% CCl4攻毒24 h進(jìn)行造模。

2.2 姜黃素藥效試驗(yàn)結(jié)果

草魚隨機(jī)分為8組，每組20尾，分為空白對(duì)照組、損傷組、試驗(yàn)組5組（5、25、75、150、300 mg/kg姜黃素）及陽(yáng)性對(duì)照組（肝膽利康散100 mg/kg），空白對(duì)照組和損傷組口灌0.5%羧甲基纖維素鈉，試驗(yàn)組口灌相應(yīng)劑量藥物，按0.1 mL/10 g口灌給藥。7 d后禁食24 h，按0.1 mL/10 g腹腔注射15%的CCl4-橄欖油溶液，空白對(duì)照組注射等體積橄欖油，24 h后每組取魚5尾，尾靜脈采血。從圖3可以看出，隨著姜黃素含量的增加，GOT和GPT活性先逐漸下調(diào)，在150 mg/kg時(shí)下調(diào)最大。25 mg/kg姜黃素開始對(duì)肝損傷有一定的保護(hù)作用，隨著濃度的升高，逐漸增強(qiáng)，150 mg/kg的保護(hù)作用達(dá)到最大，與損傷組有顯著性差異（P<0.05）。由圖4可以看出，在15%的CCl4-橄欖油溶液攻毒24 h后損傷組出現(xiàn)大量空泡和壞死，而陽(yáng)性組肝膽利康散修復(fù)能力最好，幾乎沒(méi)有壞死及空泡，150 mg/kg姜黃素試驗(yàn)組只有少量的空泡，說(shuō)明對(duì)肝損傷有一定的保護(hù)作用。因此，150 mg/kg姜黃素對(duì)草魚肝損傷的保護(hù)作用最佳。

3 小結(jié)與討論

魚類肝損傷模型是為了研究魚類肝損傷、脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化等發(fā)病原因，闡述其發(fā)生和發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制，防治策略與技術(shù)等而建立的試驗(yàn)研究模型[14]。利用具有生物學(xué)活性的肝損傷模型，高通量地篩選護(hù)肝藥物并探索其作用原理具有重要意義，但是在水產(chǎn)上，魚類保肝藥物篩選模型的研究鮮有報(bào)道[15]。其中CCl4是最早、最廣泛應(yīng)用于試驗(yàn)性肝損傷動(dòng)物模型的選擇性肝毒性物質(zhì)[16]，其成模率高、重復(fù)性好、易操作，適合誘導(dǎo)動(dòng)物肝損傷模型[17，18]，CCl4致水產(chǎn)動(dòng)物肝損傷方面的研究在建鯉中已經(jīng)有報(bào)道[19]。CCl4作為典型的肝損傷劑，可通過(guò)細(xì)胞色素P450作用分解為三氯甲烷自由基（CCl3·）[20]，CCl3·一方面選擇性地?fù)p傷小葉中央?yún)^(qū)的肝細(xì)胞，另一方面與O2迅速結(jié)合轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化三氯甲烷自由基（CCl3O2·）[21]，這些自由基通過(guò)攻擊肝細(xì)胞膜上磷脂分子引起脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷肝細(xì)胞；大量自由基無(wú)法清除，會(huì)加重脂質(zhì)過(guò)氧化[22]；肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，膜蛋白的合成受阻，胞漿內(nèi)的可溶性酶滲出，導(dǎo)致血清中的GOT、GPT活性升高[23，24]。因此，本研究選擇GOT、GPT等相關(guān)生化指標(biāo)作為肝（細(xì)胞）損傷的指標(biāo)，進(jìn)行體內(nèi)急性肝損傷模型的研究，為今后水產(chǎn)保肝藥的研制打下基礎(chǔ)。

藥效試驗(yàn)結(jié)果表明，25～300 mg/kg姜黃素能顯著抑制 CCl4誘導(dǎo)的血清中GOT、GPT的升高，說(shuō)明該濃度范圍姜黃素能夠增強(qiáng)肝細(xì)胞抵抗磷脂氧化的作用，保護(hù)生物膜完整性，且隨著濃度升高，作用增強(qiáng)，在150 mg/kg濃度下達(dá)到最大。而300 mg/kg濃度下GOT、GPT活性反而高于150 mg/kg濃度組，反映過(guò)高濃度可能不利于魚體健康，下一步將進(jìn)行姜黃素對(duì)魚體毒性的研究。150 mg/kg姜黃素作用效果顯著（P<0.05），作用效果高于國(guó)標(biāo)藥物肝膽利康散，說(shuō)明姜黃素具有開發(fā)漁用保肝制劑的潛力。

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