宋海燕，梁麗青

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)管理中心，吉林 吉林132101；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院水利與土木工程學(xué)院，吉林 吉林 132101）

龍膽藥材中龍膽多糖的提取工藝研究

宋海燕1，梁麗青2

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)管理中心，吉林 吉林132101；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院水利與土木工程學(xué)院，吉林 吉林 132101）

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法對回流法提取龍膽多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。最佳工藝參數(shù)為：提取溫度為100℃、料液比為1∶27.86 （g∶mL）、提取時(shí)間3.70h，藥材粒徑0.245mm。在此條件下，水溶性龍膽多糖的提取率達(dá)到11.08%，與響應(yīng)面預(yù)測值基本吻合。該法操作簡便、成本低，為工業(yè)龍膽多糖的大量生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)。

龍膽草；多糖；提取；響應(yīng)面

龍膽草屬多年生草本植物，主要分布于黑龍江、吉林、遼寧等地，龍膽草中的有效成分具有清濕熱、利肝膽、健胃、殺菌、消炎等作用［1］，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中被用作苦味健胃藥。

多糖作為龍膽中草藥的有效成分之一［2-3］，具有抗過敏、降血脂［4］、抗凝血［5］等多種活性，同時(shí)具有提高雛雞等家禽的免疫［6］、抗腫瘤［7］等多種功能，是理想的免疫增強(qiáng)劑。龍膽多糖也是一種具有增效減毒雙重作用的天然藥物［8］，所以對龍膽多糖的提取進(jìn)行研究具有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。然而目前國內(nèi)外對龍膽的研究主要集中在苦苷類化合物方面［9］，而對其多糖的研究相對較少且不夠深入。中藥龍膽多糖類物質(zhì)與其他植物多糖一樣有著廣闊的生物活性，因此對龍膽多糖的深入研究是非常必要的［10］。本文研究了回流法提取龍膽多糖的工藝條件，為進(jìn)一步開發(fā)利用龍膽藥材提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍膽藥材（市售），粉碎過篩（0.42mm、0.25mm、0.178mm、0.15mm、0.12mm）。

無水乙醇，苯酚，濃硫酸，葡萄糖（均為分析純）。

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHZ-D型循環(huán)水式真空泵，DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，F(xiàn)A2004型電子天平，RT-08型多功能粉碎機(jī)，722型可見分光光度計(jì)，電熱恒溫水浴鍋，DF-101S型集熱式磁力加熱器，80-1型電動離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上［11-12］，采用苯酚濃硫酸法，精確稱量于60℃恒干的葡萄糖1.0g，加入蒸餾水溶解、搖勻、定容到1000mL，配置成0.1mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別精密量取5、10、15、20、25、30、35mL，依次置于7個(gè)50mL容量瓶中，加蒸餾水定容搖勻，得到7個(gè)不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL，置于7個(gè)10mL的帶塞比色管，加入新制的5%苯酚溶液1mL，搖勻，立即加入5mL濃硫酸，充分搖勻，于室溫放置30min，另取1mL蒸餾水做空白對照，490nm下用722可見分光光度計(jì)測定吸光度。以吸光度A為橫坐標(biāo)，葡萄糖濃度C （μg·mL-1）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 龍膽多糖的提取工藝流程及單因素實(shí)驗(yàn)

精確稱量烘干的1.0g龍膽藥材若干份，放入圓底燒瓶，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件，加熱回流提取。提取完成后，將提取液3000r·min-1離心15min，上清液減壓抽濾，收集濾液，瓶底藥渣及燒瓶用少量蒸餾水洗滌后，繼續(xù)抽濾，合并兩次濾液，即為龍膽多糖粗提液。將粗提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)，濃縮到一定體積，加入無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)占到80%。4℃放置過夜，沉淀，減壓抽濾，沉淀用無水乙醇反復(fù)洗滌，得龍膽多糖。用適量蒸餾水溶解，配成一定濃度的溶液，分析多糖含量，按照下式計(jì)算提取率，并考察提取時(shí)間、藥材粒徑、料液比、提取溫度等單因素對龍膽多糖提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面具體因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 回流提取多糖工藝優(yōu)化響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels of RSM for polysaccharides extraction technology using heat reflux method

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

實(shí)驗(yàn)制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸曲線和直線方程見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

回歸分析表明，吸光度在10～70mg·mL-1范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)良好，葡萄糖含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系，可用于多糖含量的準(zhǔn)確分析。

2.2 回流法提取龍膽多糖的因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用回流法提取龍膽多糖，研究提取時(shí)間、藥材粒徑、料液比、提取溫度4個(gè)單因素對多糖提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見圖2、圖3、圖4、圖5。

圖2 提取時(shí)間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides

圖3 藥材粒徑對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of particle size on extraction rate of polysaccharides

圖4 料液比對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides

圖5 溫度對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides

由圖2、圖3、圖4、圖5可知，回流法提取龍膽多糖的最佳提取條件為：提取時(shí)間4h、粒徑為0.25mm、料液比為1∶30、提取溫度為100℃。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 回流法提取多糖工藝的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Design and results of RSM for reflux extraction of polysaccharides

利用Design-Expert軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，得到數(shù)學(xué)模型：

模型的可靠性可由方差分析及相關(guān)系數(shù)來考察，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程方差分析Table3 Analysis of variance of regression equations

從表3中可得，模型的F=34.31，P＜0.005，證明試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性。在總的作用因素中，X1、X3、X項(xiàng)（P＜0.05）的影響是顯著的，而X2、X3兩因素之間的交互作用P＞0.05，表明其對多糖提取率的影響不顯著。各具體因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，各因子間的交互作用影響不顯著，可忽略。失擬項(xiàng)F=0.74，其校正決定系數(shù)，說明該模型能很好地描述試驗(yàn)結(jié)果，可以用此模型來分析和預(yù)測加熱回流法提取龍膽多糖的工藝結(jié)果。

2.3.2 提取工藝的響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

為了更直觀地表現(xiàn)兩個(gè)因素對多糖提取率的影響，可以令其它兩因素水平值為零，即以提取時(shí)間、提取溫度、料液比3個(gè)因素中一個(gè)因素取零水平時(shí)，另兩個(gè)因素對多糖提取率的影響進(jìn)行分析。圖6直觀地反映了各因素交互作用對響應(yīng)值的影響。

圖6 各兩因素交互作用對影響龍膽苦苷提取率的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots showing the interaction of 2 different parameters on the extraction efficiency of polysaccharides

由圖6可知，提取溫度對多糖提取率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，隨著提取時(shí)間、料液比的增加或減小，響應(yīng)值變化較大；提取時(shí)間、料液比對響應(yīng)值的影響較小，曲線較為平滑，其數(shù)值增加或減少，響應(yīng)值變化較小。通過對回歸方程求一階偏導(dǎo)，可求得龍膽多糖的最佳提取工藝條件為：提取溫度100℃，料液比1∶27.86，提取時(shí)間3.70h，龍膽多糖提取率的最大值可達(dá)到11.28%。

2.4 多糖提取率的驗(yàn)證結(jié)果

準(zhǔn)確稱取粒徑0.25mm的干燥龍膽草樣品1.0g，根據(jù)“2.3”項(xiàng)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定的最佳提取工藝，即按照料液比1∶28加入28mL蒸餾水，在100℃下提取3.70h，平行試驗(yàn)3次。龍膽草中龍膽多糖的平均提取率達(dá)到11.08%，與響應(yīng)面預(yù)測值基本吻合，表明該方法模型選擇合理，試驗(yàn)結(jié)果理想，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

以龍膽藥材為實(shí)驗(yàn)原料，采用回流法提取龍膽多糖?？疾炝肆弦罕取⑻崛r(shí)間、藥材粒徑、提取溫度等4個(gè)單因素對龍膽多糖提取率的影響。在單因素基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化了水溶性龍膽多糖的提取工藝條件。最終確定最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶27.86、提取時(shí)間

3.7 h，提取溫度100℃，在此工藝下龍膽多糖的提取率達(dá)到11.08%?；亓魈崛》ú僮骱啽?，不需要昂貴的設(shè)備，易于工業(yè)化中試規(guī)模生產(chǎn)。對龍膽多糖提取工藝的系統(tǒng)探索，不僅為工業(yè)化龍膽多糖的大量生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支撐，而且進(jìn)一步提高了龍膽藥用資源的利用率，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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Extraction Process of Polysaccharide from GentianaScabraBge

SONG Hai-yan1， LIANG Li-qing2
（1.Experimental Managing Center， Jilin Agriculture Science and Technology College， Jilin 132101， China； 2.College of Hydraulic & Civil Engineering， Jilin Agriculture Science and Technology College， Jilin 132101， China）

The heat reflux extraction process of polysaccharides from gentiana scabra bge was studied.Response surface methodology （RSM） was employed to optimize the extraction conditions on the basis of investigating single factors.The optimal technological conditions were as followed： extraction temperature 100℃， solid to liquid ratio 1：27.86， extraction time 3.7h and particle size of 0.25mm.Under these conditions， the extraction rate of water soluble gentian polysaccharide reached 11.08%， which was well close with the predicted values obtained from RSM.The method proposed in this study was easy to operate， low cost and provided certain therical base for the industrial mass scale production of polysaccharides in Gentiana scabra bge.

Gentiana scabra bge； polysaccharide； extraction； response surface methdology

R 284.2

A

1671-9905（2016）09-0028-04

宋海燕（1987-），女，河北省邢臺市人，碩士研究生，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物活性成分的提取及純化。Tel： 15843289508；E-mail：844503608@qq.com

2016-07-11