鄭艷萍，劉映玲，黃慧芳，鄭敏，許雙虹，賴意芬深圳市中醫(yī)院兒科，深圳 518033

小兒止咳顆粒對哮喘大鼠氣道重塑影響的實驗研究

鄭艷萍，劉映玲，黃慧芳，鄭敏，許雙虹，賴意芬
深圳市中醫(yī)院兒科，深圳 518033

目的：觀察小兒止咳顆粒對哮喘模型大鼠血清及肺組織中基質金屬蛋白酶（MMP-9）、基質金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP-1）的表達，以及對肺組織形態(tài)學變化的影響，探討其對咳嗽變異性哮喘氣道重塑的作用。方法：36只SD雌性大鼠隨機分為空白對照組、病理模型組、地塞米松組、小兒止咳顆粒低、中、高劑量組，每組6只。除空白對照組外，其他各組分別于第1天、第8天腹腔注射新鮮配制的雞卵白蛋白（OVA）氫氧化鋁懸液。第15天上午病理模型組以10 mL/kg生理鹽水灌胃，地塞米松組以0.3 mg/kg地塞米松灌胃，小兒止咳顆粒低、中、高劑量組分別以12.5 g/kg、25 g/kg、50 g/kg小兒止咳顆粒溶液灌胃，每天1次，共給藥40天。藥物干預2小時后，行雞卵白蛋白溶液霧化吸入30min激發(fā)哮喘（空白對照組使用生理鹽水），連續(xù)4周，每天1次。治療結束后收集血清、肺組織。檢測血清MMP-9、TIMP-1含量；免疫組織化學法檢測肺組織中MMP-9、TIMP-1表達；HE染色觀察肺組織的病理形態(tài)；Masson染色觀察肺組織中膠原纖維的沉積程度。結果：與空白對照組比較，病理模型組大鼠的血清MMP-9與TIMP-1水平均明顯升高（P＜0.01），提示哮喘大鼠造模成功；與病理模型組比較，地塞米松組以及小兒止咳顆粒低、中、高劑量組中血清MMP-9和TIMP-1水平顯著降低（P＜0.05）。在肺組織形態(tài)學方面，病理模型組氣道壁明顯增厚，肺泡間隔不均勻增厚、增寬，氣管黏膜皺璧增多，肺泡壁明顯增厚、充血，氣管及血管周圍可見灶狀炎性細胞浸潤，可見輕-中度肺氣腫，毛細血管及細支氣管周邊可見較多膠原纖維沉積，小兒止咳顆粒干預后上述病理表現(xiàn)得到改善，高劑量的小兒止咳顆粒療效優(yōu)于地塞米松。結論：小兒止咳顆粒下調MMP-9與TIMP-1的表達，減少ECM在氣道的沉積，改善氣道炎癥，從而逆轉氣道重塑，達到治療哮喘的目的。

哮喘；氣道重塑；小兒止咳顆粒；血清基質金屬蛋白酶 （MMP-9）；血清基質金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP-1）；動物實驗；大鼠

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是一種特殊類型的哮喘，其發(fā)病機制及治療原則與哮喘相同［1］。氣道重塑是指在慢性炎癥刺激下所發(fā)生的氣道壁結構改變，是慢性哮喘氣道的重要病理特點。氣道重塑有利于氣道高反應性的維持，進一步發(fā)展可導致不可逆的氣道阻塞和肺功能損害，細胞外基質在氣道沉積與降解的失衡是引起氣道重塑的重要原因。

本科室應用小兒止咳顆粒治療小兒CVA 10余年，臨床療效顯著。我們通過觀察各實驗組大鼠血清及肺組織中基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9、基質金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）-1的表達，以及肺組織病理形態(tài)學的變化，來探討小兒止咳顆粒對CVA氣道重塑的作用。

1　材料與方法

1.1動物分組與處理雌性SD大鼠36只，體重190±10 g，SPF級，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心。隨機分為空白對照組、病理模型組、地塞米松組，以及小兒止咳顆粒低、中、高劑量組，每組6只。實驗大鼠先適應性飼養(yǎng)1周，除空白對照組外，其他各組采用雞卵白蛋白（OVA）致敏并反復多次激發(fā)的方法建立大鼠哮喘模型［2］。模型組大鼠分別于第1天、第8天腹腔注射新鮮配制的OVA氫氧化鋁懸液。從腹腔注射OVA氫氧化鋁懸液致敏第15天上午開始給予干預措施：小兒止咳顆粒以生理鹽水（NS）溶解，高劑量組以50 g/kg灌胃（以原生藥計算，下同），中劑量組以25 g/kg灌胃，低劑量組以12.5 g/kg灌胃，地塞米松組以0.3 mg/kg灌胃，病理模型組以10 mL/kg生理鹽水灌胃，每天1次，共給藥40天。在施予藥物干預2小時后行超聲霧化以激發(fā)哮喘，每次吸入1% OVA混懸液，霧化時間為30 min，哮喘激發(fā)連續(xù)4周，每天1次?？瞻讓φ战M以等量NS代替OVA氫氧化鋁溶液腹腔注射及OVA溶液霧化吸入。觀察大鼠一般狀態(tài)，以呼吸急促、咳嗽，嚴重者呈深、慢呼吸或呼吸節(jié)律不整，行動遲滯或俯伏不動等表現(xiàn)為激發(fā)成功。

1.2藥物與主要試劑小兒止咳顆粒，由深圳市中醫(yī)院制劑室制備，10 g/包，由百部、紫菀、款冬花、桔梗、荊芥、牛蒡子、枳殼、陳皮、茯苓、甘草組成。雞卵白蛋白（OVA）為美國sigma公司產(chǎn)品。地塞米松溶液購自南京森貝伽生物科技有限公司。ELISA試劑盒為武漢華美生物工程有限公司產(chǎn)品。MMP-9、TIMP-1免疫組織化學法（Immunohistochmeistry，IHC）試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3標本采集與處理最后一次給藥2 h后，摘除眼球取血，離心取上清。采用ELISA方法，按試劑盒操作，測定血清中MMP-9、TIMP-1水平。處死大鼠，暴露胸腔剪取左肺中葉，4%多聚甲醛固定，石臘切片后進行蘇木精-伊紅染色法（HE）染色及Masson染色，顯微鏡下觀察肺組織的炎癥改變及氣道壁膠原沉積情況，并行IHC觀察MMP-9、TIMP-1的表達情況。

1.4統(tǒng)計學方法使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)檢測重復3次取均值，計量資料以（±s）表示，多個樣本均數(shù)間的比較用單因素方差分析（One-wayANOVA），檢驗水平α設為0.05。

2　實驗結果

2.1各組大鼠血清MMP-9和TIMP-1水平比較見表1。與空白對照組比較，病理模型組大鼠的血清MMP-9與TIMP-1水平均明顯升高（P＜0.01），提示哮喘大鼠造模成功。而經(jīng)地塞米松以及低、中、高劑量小兒止咳顆粒干預后，血清MMP-9水平顯著降低（與病理模型組比較，P＜0.01），其下降幅度與小兒止咳顆粒的劑量正相關，劑量越大，MMP-9水平下降越顯著，其中中劑量組的下降幅度與地塞米松組相當，而高劑量組的下降幅度大于地塞米松組（P＜0.01）。而血清TIMP-1方面，與病理模型組比較，地塞米松組及小兒止咳顆粒各劑量組均顯著降低（P＜0.05），其降低幅度與小兒止咳顆粒的劑量也呈正相關，劑量越大，TIMP-1水平下降越顯著，其中高劑量組的降低幅度優(yōu)于地塞米松組（P＜0.01）。

表1　各組大鼠血清MMP-9與TIMP-1水平比較（±s）ng/mL

表1　各組大鼠血清MMP-9與TIMP-1水平比較（±s）ng/mL

與空白對照組比較，①P＜0.01；與病理模型組比較，②P＜0.01，③P＜0.05；與地塞米松組比較，④P＜0.01

組別空白對照組病理模型組地塞米松組小兒止咳顆粒低劑量組小兒止咳顆粒中劑量組小兒止咳顆粒高劑量組n 6 6 6 6 6 6 M M P-9 153.96±6.96 407.44±20.11①244.15±21.08②304.47±14.03②234.82±19.65②190.15±22.35②④TIM P-1 144.15±14.47 330.64±58.93①246.39±54.90③266.75±32.54③216.80±29.53③180.32±30.11③④

2.2各組大鼠肺組織MMP-9的表達情況結果見圖1～6。對各組大鼠的肺組織行IHC檢測MMP-9表達，光鏡下觀察并攝片。如圖1，空白對照組大鼠的肺組織切片中可見：細支氣管上皮、肺泡間隔巨噬細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、炎性細胞MMP-9表達呈弱陽性（+/-）。圖2中，病理模型組則呈強陽性（+++）。圖3中，經(jīng)地塞米松干預后，MMP-9表達下調至陽性（+）。圖4～6，經(jīng)低劑量、中劑量、高劑量小兒止咳顆粒干預后，大鼠肺組織中MMP-9表達呈不同程度下降，分別為++～+++、++、+。

2.3各組大鼠肺組織TIMP-1的表達情況見圖7～12。IHC檢測TIMP-1后，光鏡下觀察、攝片。圖7，正常對照組大鼠的肺組織切片中可見：細支氣管上皮、肺泡間隔巨噬細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、炎性細胞TIMP-1表達呈陽性（+）。圖8，病理模型組則呈強陽性（+++）。圖9，地塞米松的干預使TIMP-1表達下調至中陽性（++）。圖10～12，低劑量、中劑量、高劑量小兒止咳顆粒的干預，也可使大鼠肺組織中TIMP-1的表達呈不同程度下降，分別為++～+++、++、+。

2.4各組大鼠肺組織HE染色結果見圖13～18。通過HE染色，觀察各組大鼠肺組織的形態(tài)學，特別是炎癥情況。圖13，正常對照組大鼠肺組織切片支氣管管腔平整，管壁未見增厚，未見明顯水腫，肺泡間隔未見增寬，少量炎性細胞浸潤。圖14，病理模型組與空白對照比較，氣道壁明顯增厚，可見較多杯狀細胞，肺泡間隔不均勻增厚，氣管黏膜皺璧增多，肺泡壁明顯增厚、充血，氣管及血管周圍可見灶狀炎性細胞浸潤，表現(xiàn)為輕-中度肺氣腫。圖15，相比病理模型組，地塞米松組大鼠病理反應明顯減輕，肺支氣管壁稍增厚，可見杯狀細胞，部分肺泡擴張融合，呈輕-中度肺氣腫，局部肺泡間隔增寬，少量淋巴細胞浸潤，少量肺泡間隔毛細血管充血。圖16～18，小兒止咳顆粒高劑量組與中劑量組大鼠肺組織切片可見：氣管壁炎性細胞浸潤程度明顯減輕，支氣管壁和基底膜增厚，可見少量杯狀細胞，肺泡間隔輕度增厚，與病理模型組比較明顯減輕。小兒止咳顆粒高劑量組對大鼠肺組織的病理改善情況優(yōu)于地塞米松組，但中劑量組、低劑量組的肺組織病理改善程度不如地塞米松組。

2.5各組大鼠肺組織的膠原沉積情況見圖19～24。通過Masson染色，可觀察到各組大鼠肺組織中膠原纖維的沉積程度，從而了解肺組織的氣道重塑情況。圖19，空白對照組大鼠肺組織切片可見：肺泡間隔正常，毛細血管周邊、細支氣管周邊可見少量綠染的膠原纖維（1～5%）。圖20，病理模型組則表現(xiàn)為：重度增寬的肺泡間隔，毛細血管及細支氣管周邊可見較多綠染的膠原纖維（20～30%）。圖21，經(jīng)過地塞米松處理，可見：輕度增寬的肺泡間隔，毛細血管與細支氣管周邊可見少量綠染的膠原纖維（5～10%）。圖22，低劑量組：重度增寬的肺泡間隔，毛細血管及細支氣管周邊可見較多綠染的膠原纖維（10～20%）。圖23，中劑量組：輕度增寬的肺泡間隔，毛細血管及細支氣管周邊可見少量綠染的膠原纖維（5～10%）。圖24，高劑量組：輕度增寬的肺泡間隔，毛細血管周邊，細支氣管周邊可見少量綠染的膠原纖維（1～5%）。

3　討論

圖1　空白對照組（MMP-9，IHC）

圖2　病理模型組（MMP-9，IHC）

圖3　地塞米松組（MMP-9，IHC）

圖4　低劑量組（MMP-9，IHC）

圖5　中劑量組（MMP-9，IHC）

圖6　高劑量組（MMP-9，IHC）

圖7　空白對照組（TIMP-1，IHC）

圖8　病理模型組（TIMP-1，IHC）

圖9　地塞米松組（TIMP-1，IHC）

圖10　低劑量組（TIMP-1，IHC）

圖11　中劑量組（TIMP-1，IHC）

圖12　高劑量組（TIMP-1，IHC）

圖13　空白對照組（HE，100×）

圖14　病理模型組（HE，100×）

圖15　地塞米松組（HE，100×）

圖16　低劑量組（HE，100×）

圖17　中劑量組（HE，100×）

圖18　高劑量組（HE，100×）

圖19　空白對照組（Masson）

圖20　病理模型組（Masson）

圖21　地塞米松組（Masson）

圖22　低劑量組（Masson）

圖23　中劑量組（Masson）

圖24　高劑量組（Masson）

CVA多以持續(xù)或反復發(fā)作的咳嗽為主要表現(xiàn)，一般無典型支氣管哮喘常見的喘息、氣促等癥狀，但CVA與支氣管哮喘的病理生理特征十分類似［3～4］，被認為是一種特殊類型的哮喘［1］。因為缺乏咳嗽變異性哮喘的動物模型，目前多借用支氣管哮喘動物模型進行咳嗽變異性哮喘的研究。哮喘是由多種氣道炎性細胞和結構細胞及細胞組分參與的反復發(fā)作的氣道慢性炎癥性疾?。?］。慢性炎癥的長期存在，可導致上皮細胞的脫落、增生，平滑肌細胞的增生、肥大，細胞外基質（extracellular matrixc，ECM）沉積，血管通透性增加，毛細血管再生等氣道結構改變，即氣道重塑。ECM在氣道沉積與降解的失衡是引起氣道重塑的重要原因。MMPs可降解ECM中多種蛋白質成分，是調節(jié)ECM動態(tài)平衡最重要的酶系，MMP-9是其中最主要的成員。而TIMP-1是MMPs的特異性抑制物，可由各種組織細胞和炎癥細胞分泌，可抑制MMP-9產(chǎn)生，抑制ECM降解。MMP-9與TIMP-1兩者的平衡在哮喘氣道壁ECM沉積和重構中處于極重要的地位［6～7］。正常生理情況下，MMP-9和TIMP-1保持平衡狀態(tài)，維持ECM降解和沉積的平衡。哮喘狀態(tài)下，肺組織MMP-9異常升高，可促進上皮成纖維細胞的增殖、活化，導致膠原纖維大量增生，促進氣道重構；而TIMP-1也異常升高，可加重ECM在氣道內沉積，干擾組織修復，促使上皮纖維化，促進氣道重塑的發(fā)生發(fā)展［6，8］。綜上所述，氣道炎癥是造成氣道高反應性的原因，而氣道重塑則是哮喘難以根治的最重要原因，ECM的沉積和降解則是氣道重塑的最重要環(huán)節(jié)。

CVA可歸屬于中醫(yī)“咳嗽”范疇，但CVA又與一般的咳嗽不同，其咳嗽癥狀有陣發(fā)性、忽發(fā)忽止、反復性發(fā)作、受風加劇、多伴咽癢等風邪特點，所以亦有人根據(jù)其發(fā)病特點從“哮證”論治。臨床所見，本病多由風邪誘發(fā)，治不得法，或強止其咳，或閉門留痰，往往造成咳嗽遷延難愈?？紤]到患兒稚陰稚陽之體，我們主張CVA的用藥宜溫潤平和，重在理肺止咳，復其肅降，略兼疏散風邪，因而采用止嗽散化裁，創(chuàng)制小兒止咳顆粒，由百部、紫菀、款冬花、桔梗、荊芥、牛蒡子、枳殼、陳皮、茯苓、麥芽、甘草等藥組成。經(jīng)本科臨床應用多年，療效顯著。

本研究結果提示：哮喘大鼠的血清與肺組織中存在高水平的MMP-9與TIMP-1，小兒止咳顆粒干預可下調其表達，而且其作用強度與劑量呈正相關。在肺組織形態(tài)學方面，病理模型組氣道壁明顯增厚，肺泡間隔不均勻增厚、增寬，氣管黏膜皺璧增多，肺泡壁明顯增厚、充血，氣管及血管周圍可見灶狀炎性細胞浸潤，表現(xiàn)為輕-中度肺氣腫，毛細血管及細支氣管周邊可見較多膠原纖維沉積。而小兒止咳顆粒干預后上述病理表現(xiàn)得到改善，高劑量的小兒止咳顆粒療效優(yōu)于地塞米松。通過本研究發(fā)現(xiàn)，小兒止咳顆?？赏ㄟ^下調MMP-9與TIMP-1的表達，減少ECM在氣道的沉積，改善氣道炎癥，從而逆轉氣道重塑，達到治療哮喘的目的，為小兒止咳顆粒治療CVA提供了科學的實驗依據(jù)，有利于更進一步臨床推廣應用。

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［3］Takemura M，Niimi A，Matsumoto H，et al.Clinical，physiological and anti-inflammatory effect of montelukast in patients with cough variant asthma［J］.Respiration，2012，83（4）：308-315.

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［7］何承輝，邢建國，康小龍，等.香青蘭總黃酮對哮喘大鼠肺組織基質金屬蛋白酶及其抑制劑的影響［J］.中國醫(yī)科大學學報，2013，42（8）：686-688.

［8］田金娜，李建保，劉小凡.丹龍定喘湯對哮喘小鼠氣道重塑及MMP-9，TIMP-1的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（5）：164-166.

（責任編輯：駱歡歡，鄭鋒玲）

Experiment Research of Effect of Xiaoerzhike Granules on Airway Remodeling of Asthmatic Rats

ZHENG Yanping，LIU Yingling，HUANG Huifang，ZHENG Min，XU Shuanghong，LAI Yifen

Objective：To observe the effect of Xiaoerzhike granules on expression of matrix metalloproteinase（MMP-9）and tissue inhibitors of matris metalloproteinase（TIMP-1）in asthmatic rats serum and lung tissue，meanwhile on lung tissue morphological changes，and to discuss its effect on cough variant asthma（CVA）airway remodeling.Methods：Thirty-six cases of female rats were divided into blank control group，pathological model group，hexadecadrol group，low，mid and high dose of Xiaoerzhike granules group，6 cases in each group.All groups except blank control group，were intraperitoneally injected by chicken ovalbumin（OVA）aluminum hydroxide suspension on the 1st day and 8th day respectively.On the morning of 15th day，the pathological model group was given 10 mL/kg normal saline gavage，hexadecadrol group was given 0.3 mg/kg hexadecadrol gavage，low，mid and high dose of Xiaoerzhike granules group were given gavage respectively of 12.5 g/kg，25 g/kg and 50 g/kg of Xiaoerzhike granules solution，one time a day，for 40 days.After 2 hours of drug intervention，atomization inhaled chicken ovalbumin solution for 30min to induce asthma（normal saline was used in blank control group），one time a day，for 4 consecutive weeks.Collected serum and lung tissue after treatment.Detected levels of MMP-9 and TIMP-1 in serum；detected expressions of MMP-9 and TIMP-1 in lung tissue by immunohistochemical method；observed pathomorphism of lung tissue by HE dying，and deposit level of collagenous fiber in lung tissue by Masson dying.Results：Comparing with blank control group，the levels of MMP-9 and TIMP-1 in serum were increased obviously in pathological model group（P＜0.01），which means asthmatic rats models were established successfully.Comparing with pathological model group，the levels of MMP-9 and TIMP-1 in hexadecadrol group，low，mid and high dose of Xiaoerzhike granules group were all decreased obviously（P＜0.05）.In terms of lung histomorphology，port wall in model group thickened obviously，alveolar septum thickened and widened unevenly，tracheal mucosa plica increased，alveolar wall thickened and was congestive obviously，focal inflammatory cells infiltrated around weasand and blood vessel，light-moderate emphysema could be found，many collagenous fiber deposit could be found around blood capillary and bronchiole.All symptoms above mentioned were improved after intervention of Xiaoerzhike granules，and the effect of high dose of Xiaoerzhike granules group was superior to that of hexadecadrol group.Conclusion：Xiaoerzhike granules can reduce expressions of MMP-9 and TIMP-1，cut down deposit of extracellular matrix（ECM）in air passage，improve airway inflammation，thereby reverse airway remodeling，achieve the aim of treating asthma.

Asthma；Airway remodeling； Xiaoerzhike Granules；Serum Matrix Metalloproteinases（MMP-9）；Tissue Inhibitors of Matris Metalloproteinase（TIMP-1）；Animal experiment；Rat

R285.5

A

0256-7415（2016）07-0282-05

10.13457/j.cnki.jncm.2016.07.121

2016-03-02

深圳市科技創(chuàng)新委員會項目（JCYJ20140408153413103）

鄭艷萍（1969-），女，副主任醫(yī)師，研究方向：小兒呼吸系統(tǒng)疾病。