覃琴，王琛，喬世剛，周迅

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，蘇州 215004)

1 引 言

缺血性心肌病具有高發(fā)病率和高死亡率的特點，是世界常見的死亡原因之一。有效及時地恢復(fù)冠狀動脈血流是減少心肌梗死，提高患者存活率的有效途徑。然而再灌注會導(dǎo)致心臟出現(xiàn)嚴重的心率失常、收縮舒張功能障礙以及心肌梗死范圍增加等一系列并發(fā)癥[1-2]。已證實吸入麻醉藥預(yù)處理與后處理能減少心肌缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion, I/R)損傷[3-4]。2003年Kemp BE首次報道腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是哺乳動物體內(nèi)一個復(fù)雜的異源性三聚體結(jié)構(gòu)，一直被作為一個“細胞內(nèi)燃料計”或“能量調(diào)節(jié)器”而被人們所關(guān)注。近來研究表明，AMPK的激活在調(diào)節(jié)機體氧化應(yīng)激、KATP通道、細胞增值和死亡中均發(fā)揮重要作用[5-6]，這些機制可能與AMPK激活后發(fā)揮I/R心肌保護作用有關(guān)。并且AMPK作為調(diào)節(jié)細胞內(nèi)自噬/溶酶體途徑的上游信號通路，一直以來都是人們關(guān)注的熱點[7-9]。我們在前期研究的基礎(chǔ)上，通過給予AMPK激活抑制劑Compound C,觀察心肌損傷程度和檢測p-AMPK/t-AMPK蛋白表達及其通路下游自噬相關(guān)蛋白表達變化，進一步探討七氟烷后處理產(chǎn)生的心肌保護機制。

2 材料與方法

2.1 動物I/R模型建立及分組

健康雄性成年SD大鼠50只，質(zhì)量270～320 g，SPF級，由昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司提供，許可證編號[scxk(蘇)2014-0006]。所有的實驗操作均經(jīng)蘇州大學(xué)實驗動物使用及保護委員會許可。

50只大鼠建立在體心肌I/R模型，戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠后，于右側(cè)頸內(nèi)靜脈及頸內(nèi)動脈置入充滿肝素的導(dǎo)管，用于靜脈給藥、動脈血氣分析或監(jiān)測動脈血壓。氣管切開并插入氣管導(dǎo)管，連接ALC-V9動物呼吸機，行呼氣末正壓通氣，吸入氧濃度33%，調(diào)節(jié)呼吸頻率或潮氣量，維持pH 7.35～7.45、PaCO2 25～40 mmHg、PaO2 90～150 mmHg (1mmHg=0.133KPa)。采用智能恒溫控制儀維持大鼠體溫在36 ℃～37 ℃。于大鼠第5肋間行左胸切開術(shù)，打開心包，6～0無損傷縫合線在左心耳下緣結(jié)扎左冠狀動脈前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)，縫線末端穿入自制圈套管，平衡30 min。用止血鉗夾緊圈套管以阻斷LAD血供，若心外膜發(fā)紺蒼白，心電圖示一過性心律失常，ST段弓背向上抬高表示缺血模型成功；松開圈套管進行再灌注，可見心外膜重新充血證明再灌注成功[10]，大鼠因再灌注期頻發(fā)心律失常刪除。

I/R模型建立成功后，隨機將50大鼠分為5組：對照組(Sham組)，不缺血維持5 h；I/R組，平衡30 min，缺血30 min，再灌注4 h；七氟烷后處理組(SP組)，平衡30 min，缺血30 min，在缺血27 min時，給予大鼠吸入2.5%七氟醚(批號：H20130816，Maruishi Pharmaceutical公司，日本)3 min，再灌注開始后2 min繼續(xù)吸入七氟醚后停止，共5 min；DMSO組，平衡30 min，缺血30 min，再灌注開始后靜脈給予等量的Compound c溶劑二甲亞砜(DMSO)，再灌注4 h； Compound c組(Com c組)，平衡30 min，缺血30 min，再灌注開始后靜脈給予AMPK抑制劑Compound c 250 g/kg[11]，再灌注4 h。通過生物信號采集處理系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測并記錄各組大鼠平衡15、缺血15 min、再灌注1、2和4 h等時間點心率、平均動脈壓(MAP)和心率-收縮壓乘積(rate-pressure product, RPP)。

2.2 TTC法測定心肌梗死范圍

大鼠心肌再灌注4 h時，再次阻斷LAD，頸內(nèi)靜脈注射5%伊文思藍1 ml使左心室正常區(qū)域藍染，迅速取出心臟分離出左心室，用干冰速凍5 min,使用大鼠心臟切片器橫斷分割成6塊2 mm厚的組織塊。將左心室中藍染的正常組織與未染色的左心室缺血區(qū)組織分離。采用TTC染色法，將心肌組織放入1% TTC中，置于37℃恒溫水浴箱15 min，4%多聚甲醛過夜以固定組織。立式顯微鏡下將左心室分成正常(藍染區(qū)域)、缺血未梗死區(qū)(TTC染色后紅色區(qū)域)和缺血梗死區(qū)(TTC染色后灰白色區(qū)域)3部分，并分別用電子天平稱重，計算缺血區(qū)心肌質(zhì)量(缺血未梗死區(qū)心肌質(zhì)量+梗死區(qū)心肌質(zhì)量)占左心室心肌質(zhì)量的百分比、缺血梗死區(qū)心肌質(zhì)量占缺血區(qū)心肌質(zhì)量的百分比，心肌梗死范圍以梗死區(qū)心肌質(zhì)量占缺血區(qū)心肌質(zhì)量的百分比表示[10]。

2.3 Western Blot法測定p-AMPK/t-AMPK、LC3、P62蛋白表達

隨機將30大鼠分為5組，每組6只。再灌注4 h迅速取下心臟，-80 ℃液氮冷凍保存。取約300 mg左心室心尖部組織，剪碎，置于勻漿器最底部，加入Western細胞裂解液，蛋白酶抑制劑(PMSF)和磷酸酶抑制劑(PST)，低溫下超聲細胞破碎儀裂解3次。裂解后，低溫下靜置半小時，將裂解后的組織勻漿移至1.5 ml EP管中，將EP管放入離心機中，4℃下1 500 g離心30 min，取上清分裝于1.5 ml離心管中，并于低溫冰箱中保存。所有操作均必須在冰面進行。運用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定提取的蛋白樣品的濃度，并用裂解液將其調(diào)至相同蛋白濃度。在樣品中加入上樣緩沖液混勻，95 ℃煮5 min，使蛋白質(zhì)充分變性，并于低溫冰箱中凍存。BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0010S，碧云天生物技術(shù)研究所)測定蛋白樣品的蛋白含量，并用裂解液調(diào)至相同濃度值，97 ℃金屬浴持續(xù)加熱5 min。每個樣品取20 μg蛋白于12%聚丙烯酰胺凝膠(BIO-RAD公司，美國)分離蛋白，電泳完畢轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(Millipore公司，美國)，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入一抗p-AMPK(1∶1000，批號：2535，Cell Signaling公司，美國)、一抗LC3(1∶1000，批號：136F3，Santa Cruz公司，美國)、一抗P62(1∶1000，批號：8G10，Santa Cruz公司，美國)、內(nèi)參GAPDH(1:1000，批號：AG019，碧云天生物技術(shù)研究所)，4℃一抗孵育過夜。TBST溶液漂洗3遍后加入二抗搖床孵育2 h。采用ECL試劑盒(批號：34077，Thermo公司，美國)顯色；最后進行增強化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，將PVDF膜放入發(fā)光液(免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑AB液，批號：0609*025，Merck公司，德國)中，移置暗室，曝光后自動洗片機顯影，定影。采用Image軟件測定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值反映心肌組織p-AMPK/t-AMPK、LC3、P62蛋白表達水平。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組血流動力學(xué)指標(biāo)比較

平衡15min，各組間心率、MAP和RPP比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在缺血期和再灌注期，除Sham組外，其余各組MAP和RPP較平衡期下降(P<0.05)；與SP組比較，DMSO組差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，I/R組和Com c組MAP和RPP下降(P<0.05)。各組再灌注期間大鼠死亡率無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠血流動力學(xué)變化的比較

注：與平衡期比較，P<0.05；與I/R組比較，P<0.05;與SP組比較，P<0.05

3.2 各組心肌梗死范圍比較

各組心肌缺血區(qū)域所占比例比較無明顯差異(P>0.05)。與I/R組(55.2±11.6%)比較，SP組(36.8±17.2%)心肌梗死范圍減少(P<0.05)；與SP組比較，Com c組(56.6 ± 13.2%)梗死范圍增大(P<0.05)；SP組和DMSO組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2，圖1)。

3.3 Western Blot檢測結(jié)果

與I/R組比較，SP組和DMSO組p-AMPK/t-AMPK蛋白表達上調(diào)而LC3 Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表達下調(diào)(P<0.05)；與SP組比較，Com c組p-AMPK/t-AMPK蛋白表達下調(diào)而LC3 Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表達上調(diào)(P<0.05)(見圖2、圖4)。

表2 各組缺血再灌注心肌各部分質(zhì)量及比值

注：與Sham組比較，aP<0.05，bP<0.01；與I/R組比較，cP<0.05；與SP組比較，eP<0.05

與Sham組比較，bP<0.01；與I/R組比較，dP<0.01；與SP組比較，fP<0.01

與Sham組比較，aP<0.05，bP<0.01；與I/R組比較，cP<0.05；與SP組比較，eP<0.05

與Sham組比較，aP<0.05，bP<0.01；與I/R組比較，cP<0.05；與SP組比較，eP<0.05

4 討論

AMPK是一個復(fù)雜的異源性三聚體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，一個催化亞基α亞基，兩個調(diào)節(jié)亞基β亞基和γ亞基。其α亞基172位蘇氨酸的磷酸化結(jié)合后可以激活A(yù)MPK的活性。多種病理和生理狀態(tài)下如缺血低氧、運動、AMP/ATP比例的升高以及促炎因子等，均可以使AMPK磷酸化激活[12-13]。激活的AMPK通過多種途徑促進ATP的生成以及脂肪酸的氧化，因此AMPK一直被稱為細胞內(nèi)能量調(diào)節(jié)器，在心肌I/R損傷中，已有研究證明激活的AMPK對心肌具有保護作用[5-6]，這與我們實驗研究結(jié)果一致，七氟烷后處理組心肌梗死范圍減少，具有心肌保護效應(yīng)，同時 p-AMPK/t-AMPK蛋白表達上調(diào)；給予AMPK抑制劑Compound c后p-AMPK/t-AMPK蛋白表達受到抑制，心肌梗死范圍增加，心肌保護效應(yīng)消失。

自噬是細胞內(nèi)溶酶體降解長壽蛋白質(zhì)及損傷的細胞器從而維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡的一種生物過程[14]。只有完整的自噬流形成自噬溶酶體才能發(fā)揮細胞保護作用[15]。自噬在正常情況下表達水平相對較低，在某些應(yīng)激的情況下可使其激活適應(yīng)應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮保護作用。然而，研究發(fā)現(xiàn)在死亡的細胞內(nèi)存在著大量的自噬體[16]，過量的自噬可以導(dǎo)致細胞的死亡(即Ⅱ型程序性死亡)。Kabeya等2000年研究發(fā)現(xiàn)LC3因能始終靶向定位于自噬體膜上直到與溶酶體溶合，是目前確認的唯一可信的自噬體標(biāo)記物，LC3的水平在某種程度上反映了自噬小體的數(shù)量。P62是一種泛素結(jié)合蛋白,與蛋白質(zhì)的泛素化密切相關(guān)，它參與多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控及自噬過程[17]。自噬過程中，P62與泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)合，再與定位于自噬小體內(nèi)膜上的 LC3-II 蛋白形成復(fù)合物，一同在自噬溶酶體內(nèi)降解。因此，出現(xiàn)自噬時，在細胞質(zhì)中P62蛋白不斷被降解；當(dāng)自噬活性減弱、自噬功能缺陷時，P62蛋白會在細胞質(zhì)中不斷累積，P62是反映自噬活性的標(biāo)記蛋白之一，其含量間接反映自噬小體清除水平[18]。

已有研究發(fā)現(xiàn)缺血和再灌注兩個階段中自噬是持續(xù)進行的，吞噬包裹所形成的自噬泡需要與溶酶體結(jié)合消化才能形成完整的自噬過程(即完整的自噬流)，然而I/R破壞了其結(jié)合的過程，從而使得自噬泡大量的聚集最終導(dǎo)致自噬性死亡[9]。同時也有報道七氟烷后處理修復(fù)完整的自噬流，恢復(fù)再灌注期間溶酶體功能，發(fā)揮I/R心肌保護作用[19]。缺血期通過AMPK通路激活的自噬對心肌發(fā)揮保護作用，而再灌注時通過Beclin-1途徑激活的自噬則發(fā)揮出相反的作用[8]。近期有研究報道通過激活A(yù)MPK信號通路，保護自噬泡與溶酶體結(jié)合即自噬流，從而抑制再灌注期間細胞內(nèi)ROS的生成和細胞死亡[20]。這與我們研究相符，七氟烷后處理上調(diào)p-AMPK/t-AMPK蛋白的表達，說明AMPK信號通路參與了七氟烷后處理保護機制，給予AMPK抑制劑Compound c后此保護作用消失；同時七氟烷后處理降低再灌注后自噬體標(biāo)志性蛋白LC3和溶酶體功能損傷標(biāo)志性蛋白P62的表達，說明七氟烷后處理可以修復(fù)再灌注后自噬流的破壞，對在體心肌I/R損傷發(fā)揮保護作用。此外，比較SP組和I/R組的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予AMPK的抑制劑Compound c增加了LC3和P62蛋白的表達，這表明AMPK信號通路對細胞內(nèi)自噬流具有重要的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，七氟烷后處理對大鼠在體心肌I/R損傷具有保護作用，其機制可能是通過激活A(yù)MPK信號通路，使AMPK磷酸化，從而保護了自噬流，促使自噬體與溶酶體結(jié)合，使得自噬發(fā)揮其消化降解代謝產(chǎn)物并循環(huán)利用的作用，對心肌I/R損傷產(chǎn)生保護作用，這對今后我們研究七氟烷后處理產(chǎn)生心肌保護作用的機制提供了新思路。