張璐璐，陳士強(qiáng)，李海鳳，劉慧萍，4，戴　毅，4，高　勇，陳建民

（1揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225007；3揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)，江蘇揚(yáng)州 225012；4江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014）

小麥-長(zhǎng)穗偃麥草7E抗赤霉病易位系培育

張璐璐1，陳士強(qiáng)2，李海鳳3，劉慧萍1，4，戴毅1，4，高勇1，陳建民1

（1揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225007；3揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)，江蘇揚(yáng)州 225012；4江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014）

【目的】將二倍體長(zhǎng)穗偃麥草7E染色體導(dǎo)入主栽小麥背景，培育小麥-長(zhǎng)穗偃麥草7E染色體抗赤霉病易位系，為小麥抗赤霉病遺傳改良利用外源優(yōu)良基因提供新種質(zhì)。【方法】利用中國(guó)春-長(zhǎng)穗偃麥草7E代換系DS7E（7B）與揚(yáng)麥16雜交的F2種子進(jìn)行60Co輻射（30 000 rad）和種植，表現(xiàn)型選擇收獲存活M1植株的種子，從M2連續(xù)通過(guò)表型農(nóng)藝性狀選擇、單花滴注法進(jìn)行赤霉病抗性鑒定和長(zhǎng)穗偃麥草7E染色體或染色體臂特異分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增篩選，最后在M4代對(duì)中選材料以長(zhǎng)穗偃麥草基因組DNA為探針進(jìn)行基因組原位雜交（genomic in situ hybridization，GISH）證實(shí)?！窘Y(jié)果】M1選擇了赤霉病發(fā)病率不同的13個(gè)單株進(jìn)行繁殖。利用前期開(kāi)發(fā)的長(zhǎng)穗偃麥草7E染色體和7EL、7ES特異標(biāo)記檢測(cè)13株的后代M2單株，獲得含有長(zhǎng)穗偃麥草7EL片段7株和7ES片段14株；對(duì)21株M2衍生的222個(gè)M3植株進(jìn)行特異標(biāo)記檢測(cè)，共選擇含有長(zhǎng)穗偃麥草7EL片段13株和7ES片段3株；利用來(lái)自12株M3的后代（M4）進(jìn)行GISH，共9株M3的后代具有小麥-長(zhǎng)穗偃麥草易位染色體，體細(xì)胞染色體2n=42。2株M3的后代顯示附加2條長(zhǎng)穗偃麥草染色體短臂，體細(xì)胞染色體2n=44。連續(xù)多年多途徑的篩選，獲得4份材料，3份材料均為長(zhǎng)穗偃麥草7E染色體長(zhǎng)臂易位系，命名為T(mén)W-7EL1、TW-7EL2和TW-7EL3。1份為7E染色體短臂附加系，命名為W-DA7ES，最后所獲得的材料是源自M1代2個(gè)單株。連續(xù)3年赤霉病抗性鑒定結(jié)果表明長(zhǎng)穗偃麥草7EL易位系抗性高，發(fā)病率明顯低于中國(guó)春和揚(yáng)麥16，與蘇麥3號(hào)相當(dāng)，而7ES附加系的赤霉病抗性明顯較低，發(fā)病率明顯高于7EL易位系?！窘Y(jié)論】通過(guò)赤霉病抗性鑒定、染色體特異分子標(biāo)記篩選和GISH證實(shí)相結(jié)合培育了小麥-長(zhǎng)穗偃麥草7EL抗赤霉病易位系，長(zhǎng)穗偃麥草易位片段鑒定快速和準(zhǔn)確。二倍體長(zhǎng)穗偃麥草7E染色體長(zhǎng)臂中含有抗小麥赤霉病的基因。

小麥；長(zhǎng)穗偃麥草；赤霉??；易位系

0　引言

【研究意義】小麥（Triticum aestivum L.）是世界上最早栽培的農(nóng)作物之一，也是總產(chǎn)量?jī)H次于玉米的第二大糧食作物。由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）引起的小麥赤霉?。‵usarium head blight，F(xiàn)HB）是一種世界性病害，嚴(yán)重影響了小麥產(chǎn)量和品質(zhì)，而且感染麥粒中禾谷鐮刀菌的次生代謝產(chǎn)物，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康［1］。中國(guó)是小麥赤霉病受害面積最大的國(guó)家，近年來(lái)更有不斷擴(kuò)大受害面積的趨勢(shì)，除長(zhǎng)江中下游及東北三江平原外，在豫、魯、陜等地也有發(fā)展，在全國(guó)每年受害面積約700萬(wàn)hm2，占小麥種植面積的四分之一，每年因赤霉病損失產(chǎn)量約200萬(wàn)—300萬(wàn)噸［2］。隨著小麥育種中少數(shù)親本的反復(fù)使用和耕作制度的變化，栽培小麥種內(nèi)遺傳變異急劇減少，繼續(xù)在栽培小麥種內(nèi)挖掘新的優(yōu)良種質(zhì)效果有限，使得小麥高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗病育種進(jìn)展不盡人意。為了拓寬小麥的遺傳變異類(lèi)型，提高小麥的育種效率，通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交從小麥近緣野生種中引入有益基因，并利用這些有益基因培育小麥新品種，已成為人們的共識(shí)和小麥新品種選育的重要途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】小麥的野生近緣物種是小麥寶貴的基因資源庫(kù)。二倍體長(zhǎng)穗偃麥草（Thinopyrum elongatum （Host） A. L?ve，2n=2x=14，EE），具有抗鹽、抗旱、大穗、多花、優(yōu)質(zhì)、繁殖能力和適應(yīng)性強(qiáng)、抗病蟲(chóng)害等許多優(yōu)良性狀［3-5］。利用RFLP等標(biāo)記確定長(zhǎng)穗偃麥草的E組7條染色體分別與小麥染色體A、B、D組7個(gè)部分同源群具有部分同源關(guān)系，表明長(zhǎng)穗偃麥草E基因組與小麥A、B、D基因組的遺傳分化程度相對(duì)較?。?］。因此，在普通小麥遺傳改良中可以方便地利用長(zhǎng)穗偃麥草的遺傳基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)小麥-長(zhǎng)穗偃麥草全套附加系赤霉病接種鑒定發(fā)現(xiàn)，1E染色體上存在赤霉病抗性基因［7］，硬粒小麥-長(zhǎng)穗偃麥草1E染色體附加系的研究中也認(rèn)為1E染色體上存在赤霉病抗性基因［8］；除此之外，研究表明在7E染色體也具有赤霉病抗性基因，并將該抗性基因定位在7E長(zhǎng)臂上［9-11］。培育小麥附加系、代換系和易位系是利用外源種質(zhì)改良小麥的一條重要途徑，其中，易位系以其導(dǎo)入外源染色體小片段僅含優(yōu)良目標(biāo)基因的優(yōu)點(diǎn)，它比附加系及代換系在作物育種中的意義更重大。易位系可以直接作為品種在生產(chǎn)上推廣利用，例如小麥-黑麥1BL/1RS易位系攜有多種小麥葉部病害的抗性基因，同時(shí)具有廣泛的適應(yīng)性和高產(chǎn)的遺傳效應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于世界各國(guó)栽培小麥的品種改良中［12-13］。目前，主要是通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交材料經(jīng)輻射［14-17］、ph1b［18-19］、組織培養(yǎng)［20］、殺配子染色體［21］等途徑使染色體發(fā)生斷裂后發(fā)生錯(cuò)誤重接而培育易位系。通過(guò)眾多科學(xué)家多年研究獲得小麥與多個(gè)近緣種的易位系，如小麥與簇毛麥［22］、小麥與大賴(lài)草［23］、小麥與黑麥［24］、小麥與中間偃麥草［25-26］以及小麥與百薩偃麥草［27］等物種間染色體易位系。其中，電離輻射容易誘導(dǎo)染色體斷裂重接而產(chǎn)生各種染色體結(jié)構(gòu)變異，是易位系培育的常用方法［28］。在獲得的小麥-長(zhǎng)穗偃麥草易位系中，偃麥草染色體是來(lái)源于十倍體長(zhǎng)穗偃麥草（Th. ponticurn， 2n = 70）的一對(duì)部分同源染色體7ell和7el2，與7E染色體具有部分同源性［29］。赤霉病抗性研究表明7el1的代換系和易位系均沒(méi)有抗性，而臂間易位（7DS·7el2L）具有抗性［30］。利用ph1b突變體與7DS·7el2L臂間易位雜交，將其中的抗赤霉病基因（Fhb7）定位于7el2的長(zhǎng)臂上，并獲得聚合了Fhb1與Fhb7 2個(gè)抗赤霉病基因的育種材料［31］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】綜上所述，小麥與多個(gè)近緣種產(chǎn)生的易位系中多數(shù)是以中國(guó)春小麥為背景，在抗赤霉病育種中作為親本的可利用性不高。二倍體長(zhǎng)穗偃麥草也具有赤霉病抗性，研究表明其抗性基因位于1E和7E染色體［7-11］，但未見(jiàn)在主栽小麥背景培育7E染色體易位系的成功報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用60Co輻射處理小麥-長(zhǎng)穗偃麥草7E代換系DS7E（7B）與揚(yáng)麥16雜交的F2種子，在輻射后代的繁殖過(guò)程中，首先進(jìn)行表現(xiàn)型篩選，選擇赤霉病抗性相對(duì)較強(qiáng)又具有長(zhǎng)穗偃麥草相關(guān)特征的單株種植，繼續(xù)進(jìn)行赤霉病抗性和農(nóng)藝性狀選擇，在此基礎(chǔ)上利用長(zhǎng)穗偃麥草7E染色體特異標(biāo)記對(duì)獲選單株進(jìn)行PCR檢測(cè)，最后通過(guò)基因組熒光原位雜交（genomic in situ hybridization，GISH）進(jìn)行小麥-長(zhǎng)穗偃麥草抗赤霉病易位系確認(rèn)。利用赤霉病抗性鑒定、分子標(biāo)記篩選和GISH確認(rèn)3種方法相結(jié)合培育小麥-長(zhǎng)穗偃麥草抗赤霉病易位系的途徑，選擇目標(biāo)明確，選擇效率高，培育周期短，為小麥異源易位系的培育提供了有效途徑。所獲小麥-長(zhǎng)穗偃麥草7E抗赤霉病易位系為小麥品種改良和小片段易位系的研究提供了新種質(zhì)或基礎(chǔ)材料。

1　材料與方法

1.1植物材料

所用材料包括長(zhǎng)穗偃麥草（Th. elongatum，2n=2x=14）、中國(guó)春-長(zhǎng)穗偃麥草7E附加系（DA7E）、7E長(zhǎng)臂附加系（DA7EL）、7E短臂附加系（DA7ES），中國(guó)春-長(zhǎng)穗偃麥草7E代換系（DS7E（7B））、揚(yáng)麥16（Y16）、中國(guó)春（CS）、蘇麥3號(hào)（SU3）和安農(nóng)8455（AN8455）。揚(yáng)麥16、蘇麥3號(hào)和安農(nóng)8455引自江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，其他材料由加拿大農(nóng)業(yè)部Ottawa研究中心的Dr.FEDAK研究員提供。

1.2長(zhǎng)穗偃麥草特異標(biāo)記篩選

提取供試材料的基因組DNA［32］，通過(guò)PCR進(jìn)行分子標(biāo)記篩選。用于染色體或染色體臂鑒定的分子標(biāo)記為筆者前期開(kāi)發(fā)的長(zhǎng)穗偃麥草特異標(biāo)記［33-35］。PCR反應(yīng)體系為模板DNA（100 ng·μL-1）1 μL、上游引物和下游引物各1 μL（10 μmol·L-1）、10×PCR緩沖液2.5 μL、2.5 mmol·L-1的dNTP 2 μL、5 U·μL-1的Taq酶0.3 μL，ddH2O定容至25 μL。PCR反應(yīng)過(guò)程為94℃ 5 min；94℃ 45 s，根據(jù)不同引物在50—60℃退火1 min，72℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.3易位系培育途徑

利用揚(yáng)麥16與DS7E（7B）雜交，60Co輻射（輻射劑量為30 000 rad）F2種子，收獲成活M1植株自交種子為M2群體。從M2開(kāi)始進(jìn)行農(nóng)藝性狀、赤霉病抗性和染色體特異分子標(biāo)記的篩選，各世代的中選植株均單株收獲進(jìn)行繁殖，最后對(duì)含有7E染色體特異標(biāo)記擴(kuò)增的M4抗性材料進(jìn)行基因組原位雜交，獲得小麥-長(zhǎng)穗偃麥草7E抗赤霉病易位系（圖1）。

1.4赤霉病抗性鑒定

圖1　輻射法培育小麥-長(zhǎng)穗偃麥草抗赤霉病易位系Fig. 1　Development of wheat -Th. elongatum translocation lines with FBH resistance by radiation

對(duì)輻射后的各世代均進(jìn)行赤霉病抗性選擇，選擇的M1單株赤霉病抗性表現(xiàn)不同，但具有長(zhǎng)穗偃麥草的特征，M2以后的單株選擇要求既具有7E染色體特異分子標(biāo)記擴(kuò)增，而赤霉病抗性表現(xiàn)又要好。M1赤霉病抗性以自然發(fā)病率（病穗率）進(jìn)行篩選，從M2開(kāi)始采用單花滴注法進(jìn)行赤霉病的抗性鑒定，接種21 d后調(diào)查發(fā)病情況。發(fā)病結(jié)果調(diào)查以單株為單位，匯總各單株結(jié)果平均后作為整行的抗性表現(xiàn)。發(fā)病率以病小穗數(shù)除以總小穗數(shù)的病小穗率表示。

1.5基因組原位雜交

細(xì)胞學(xué)制片方法參考GILL等［36］的方法并稍加改進(jìn)。將經(jīng)前處理和固定后的根尖洗滌后在2%的醋酸洋紅中浸泡24 h以上，制片時(shí)切下根尖分生組織于載玻片上，滴加45%的醋酸進(jìn)行壓片，選擇染色體分散好的制片，-70℃冷凍后揭開(kāi)蓋玻片，系列酒精脫水處理保存?zhèn)溆?。按照Z(yǔ)HANG等［37］的方法進(jìn)行基因組原位雜交，以二倍體長(zhǎng)穗偃麥草基因組DNA通過(guò)缺口平移法進(jìn)行地高辛標(biāo)記作為探針，中國(guó)春基因組DNA為封阻，具體比例為探針總濃度：封阻總濃度=1∶50，在安裝有CCD相機(jī)的Olympus熒光顯微鏡下觀察雜交信號(hào)并拍照。

2　結(jié)果

2.1長(zhǎng)穗偃麥草特異分子標(biāo)記的篩選

利用揚(yáng)州大學(xué)陳建民教授實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的標(biāo)記［33-35］對(duì)中國(guó)春-長(zhǎng)穗偃麥草7E附加系（DA7E）、7E長(zhǎng)臂附加系（DA7EL）、7E短臂附加系（DA7ES）、二倍體長(zhǎng)穗偃麥草（2X）以及中國(guó)春（CS）、揚(yáng)麥16（Y16）進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，進(jìn)一步對(duì)7E染色體、7ES、7EL染色體臂的標(biāo)記進(jìn)行選擇。共選擇7E染色體標(biāo)記4個(gè)（7E染色體標(biāo)記對(duì)7EL、7ES同樣擴(kuò)增），7EL標(biāo)記11個(gè)，7ES標(biāo)記6個(gè)，標(biāo)記名稱(chēng)及序列見(jiàn)表1。

表1　小麥-長(zhǎng)穗偃麥草7E染色體易位系鑒定所用分子標(biāo)記Table 1　Molecular marker for identifying wheat- Th. elongatum 7E chromosome translocation lines

2.2基于特異分子標(biāo)記選擇目標(biāo)單株

在M1選擇了具有長(zhǎng)穗偃麥草特征、株型比較好、赤霉病發(fā)病率不同的13個(gè)單株。利用7E染色體和7E染色體長(zhǎng)臂及短臂標(biāo)記對(duì)13個(gè)株行中M2單株進(jìn)行PCR檢測(cè)，部分結(jié)果如圖2所示。第1株行出現(xiàn)2株 7E擴(kuò)增，未見(jiàn)臂的擴(kuò)增。第2株行出現(xiàn)5株7E擴(kuò)增，出現(xiàn)3株7ES擴(kuò)增。第3株行出現(xiàn)3株7E擴(kuò)增，出現(xiàn)3株7EL擴(kuò)增。根據(jù)PCR檢測(cè)和表現(xiàn)型結(jié)果，分別選擇其中可能含有長(zhǎng)穗偃麥草7EL片段7株和長(zhǎng)穗偃麥草7ES片段14株，次年株行種植M3。

圖2　M2單株分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果Fig. 2　The PCR detection results of molecular markers for M2plants

利用7E染色體和7EL、7ES特異標(biāo)記對(duì)21株M2衍生的222個(gè)M3植株的DNA進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)2個(gè)以上標(biāo)記擴(kuò)增和表現(xiàn)型的標(biāo)準(zhǔn)，共獲得含有長(zhǎng)穗偃麥草7EL片段13株，含有長(zhǎng)穗偃麥草7ES片段3株（圖3和圖4）。不難看出，盡管上代選擇具有7ES片段的單株比較多，但一代自交繁殖后，繼續(xù)選擇得到的短臂單株變少了。當(dāng)7E染色體與小麥染色體發(fā)生易位后，向后代的傳遞比較穩(wěn)定，而單獨(dú)存在的染色體臂向后代的傳遞可能比較容易丟失。

2.3擴(kuò)增分子標(biāo)記單株的赤霉病抗性鑒定

對(duì)獲得標(biāo)記擴(kuò)增的M2、M3單株利用單花滴注法進(jìn)行赤霉病抗性鑒定，選擇具有赤霉病抗性和分子標(biāo)記擴(kuò)增的單株進(jìn)行繁殖，對(duì)M4單株同樣進(jìn)行赤霉病抗性鑒定。由表2可見(jiàn)，最后獲得的材料可追溯到M1代2個(gè)單株，赤霉病發(fā)病率明顯不同。這兩個(gè)單株在衍生后代過(guò)程中，一般上代具有特異標(biāo)記擴(kuò)增并赤霉病抗性好的單株，下代的赤霉病抗性表現(xiàn)也好并具有特異標(biāo)記擴(kuò)增，赤霉病抗性和特異標(biāo)記具有共分離特征。標(biāo)記篩選區(qū)別了7EL和7ES染色體組成的單株，這些單株也表現(xiàn)了赤霉病抗性的差別，連續(xù)3年的接種鑒定表明，具7EL植株組成的株行赤霉病抗性每年均好于中國(guó)春、揚(yáng)麥16和安農(nóng)8455，與蘇麥3號(hào)相當(dāng)，而且也好于具7ES植株組成的株行，意味著7EL具有抗赤霉病的基因。

圖3　M3單株7EL分子標(biāo)記檢測(cè)Fig. 3　The PCR results of 7EL-specific molecular markers for M3plants

2.4基因組原位雜交（GISH）檢測(cè)和易位系的特征

對(duì)于M2、M3中連續(xù)2年均有分子標(biāo)記擴(kuò)增和赤霉病抗性較高單株衍生的后代（M4），可認(rèn)為帶有長(zhǎng)穗偃麥草7E染色體。這些特異標(biāo)記擴(kuò)增的單株中，7E染色體有3種存在方式，完整的7E染色體、小麥染色體與7E的易位染色體以及7EL或7ES的附加染色體臂。利用經(jīng)7EL特異分子標(biāo)記檢測(cè)過(guò)的12株M3代的后代進(jìn)行GISH，共9株的后代具有小麥-長(zhǎng)穗偃麥草易位染色體，體細(xì)胞染色體2n=42。這些植株來(lái)源于3個(gè)M2單株，分別命名為T(mén)W-7EL1、TW-7EL2和TW-7EL3（T：易位；W：小麥；7EL：長(zhǎng)穗偃麥草7E染色體長(zhǎng)臂；數(shù)字：易位系序號(hào)）。TW-7EL1和TW-7EL2易位系均為整臂易位（圖5-A）。而TW-7EL3易位系中即存在整臂易位也存在小片段易位染色體，還在分離中。選擇經(jīng)7ES分子標(biāo)記驗(yàn)證過(guò)的2株M3后代進(jìn)行GISH，結(jié)果顯示附加2條長(zhǎng)穗偃麥草染色體短臂，是來(lái)自1個(gè)M2單株后代，命名為W-AD7ES1，體細(xì)胞染色體2n=44（圖5-B），未見(jiàn)完整的7E染色體。

圖4　M3單株7ES分子標(biāo)記檢測(cè)Fig. 4　The PCR results of 7ES-specific molecular markers for M3plants

表2　小麥-長(zhǎng)穗偃麥草易位系系譜及不同世代的標(biāo)記檢測(cè)和赤霉病抗性鑒定Table 2　The pedigree， marker detection and FBH resistance identification for translocation lines in different generations

圖5　小麥-長(zhǎng)穗偃麥草7E染色體易位系的GISH結(jié)果Fig. 5　GISH result of wheat-Th.elongatum 7E chromosome translocation lines

表3　7EL易位系和7ES附加系的主要農(nóng)藝性狀Table 3　The main agronomic traits of 7EL translocation lines and 7ES addition line

對(duì)GISH檢測(cè)的小麥-長(zhǎng)穗偃麥草純合易位系和附加系進(jìn)行農(nóng)藝性狀的考察（表3）。小麥-長(zhǎng)穗偃麥草7EL易位系株高與中國(guó)春類(lèi)似，而長(zhǎng)穗偃麥草7ES附加系株高與Y16接近。易位系和附加系間的穗長(zhǎng)、花藥成熟情況也呈現(xiàn)明顯的差別。由圖6可以看出，7EL易位系的穗長(zhǎng)較7ES附加系長(zhǎng)，且小穗之間間距較大。穗型類(lèi)似于中國(guó)春，7ES附加系的部分花藥短小且干癟，沒(méi)有花粉，呈不育的狀態(tài)，而7EL易位系的花藥碩大飽滿(mǎn)，與中國(guó)春類(lèi)似。

圖6　小麥-長(zhǎng)穗偃麥草7EL易位系及7ES附加系的花藥和穗子Fig. 6　The spikes and anthers of 7EL translocation lines and 7ES addition line

3　討論

3.1赤霉病抗性基因所在染色體臂

長(zhǎng)穗偃麥草是小麥屬的近緣野生種，是小麥遠(yuǎn)緣雜交育種的重要親本材料，一直被認(rèn)為是小麥遺傳改良重要的外源基因庫(kù)。目前研究表明其染色體上攜帶對(duì)赤霉病具有很好抗性的基因。劉登才等［7］利用染色體附加系為材料研究發(fā)現(xiàn)，其赤霉病抗性主要?dú)w功于1E染色體的作用，同時(shí)3E、4E和6E染色體可能有作用微弱的基因存在。通過(guò)研究還發(fā)現(xiàn)赤霉病的抗性基因位于長(zhǎng)穗偃麥草的7E染色體上，并定位于7E長(zhǎng)臂上［9-11］，但有人通過(guò)單花滴注法接種7E的2個(gè)端體附加系，則將抗赤霉病的基因定位在7E短臂上［38-39］。

通過(guò)2年標(biāo)記選擇，本研究獲得穩(wěn)定的帶有長(zhǎng)穗偃麥草7E染色體的材料，分別來(lái)自不同的M2單株，GISH結(jié)果明顯分為小麥-長(zhǎng)穗偃麥草7EL易位系和7ES附加系。對(duì)這些材料連續(xù)3年的禾谷鐮刀菌接種進(jìn)行赤霉病抗性篩選，結(jié)果表明，長(zhǎng)穗偃麥草7EL易位系的赤霉病抗性相對(duì)于長(zhǎng)穗偃麥草7ES附加系要好，也比親本的抗性好，這與以往的研究結(jié)果一致［9-11］，支持抗赤霉病基因位于長(zhǎng)穗偃麥草7E染色體長(zhǎng)臂上。

3.2小片段易位系的獲得

利用電離輻射是誘導(dǎo)染色體異源易位的一種有效方法［15］。輻射后染色體的斷裂是隨機(jī)的，既有本身染色體也有外源染色體，本研究的輻射后代中未見(jiàn)完整的7E染色體充分證實(shí)了這一點(diǎn)。通過(guò)輻射培育易位系的頻率很高，BIE等［16］通過(guò)電離輻射普通小麥-簇毛麥雙二倍體的花粉，然后將這些花粉授于中國(guó)春小麥，從61份M1材料中檢測(cè)到普通小麥——簇毛麥間易位染色體98條，易位出現(xiàn)頻率高達(dá)72.1%。根據(jù)本研究所獲易位系的系譜分析，小麥-長(zhǎng)穗偃麥草7EL易位系和7ES附加系就是來(lái)自2株M1，通過(guò)這2株M1后代的分子標(biāo)記檢測(cè)和抗性鑒定而最后獲得。

通過(guò)GISH檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)獲得的都是染色體的整臂易位系和附加系，并未出現(xiàn)小片段易位。利用種子進(jìn)行輻射，電離輻射的主要效應(yīng)是誘導(dǎo)染色體一次斷裂，而且染色體斷裂也最容易發(fā)生在著絲粒區(qū)域或著絲粒附近，因而產(chǎn)生的易位主要是整臂易位和較大的末端易位，中間插入易位的頻率很低［15，22-23，40-41］。另一種原因是輻射的劑量不夠大，導(dǎo)致染色體臂斷裂的頻率不高；第三點(diǎn)可能是輻射的放射源種類(lèi)問(wèn)題，利用快中子對(duì)小麥-黑麥雙二倍體與普通小麥品種綿陽(yáng)11雜交種子進(jìn)行輻射，獲得小麥-黑麥外源小片段易位、外源大片段易位和羅伯遜易位，隨著輻射劑量的增加，小片段易位的頻率也增加［24］。所以，想要獲得小片段的易位系，可以對(duì)獲得的整臂易位系通過(guò)輻射成熟中花粉進(jìn)行授粉，使外源染色體二次斷裂和重接，從其雜交后代中進(jìn)行選擇［17］。

本研究采用60Co輻射種子，將田間赤霉病抗性鑒定、分子標(biāo)記篩選和基因組原位雜交驗(yàn)證3種方法相結(jié)合，培育小麥-長(zhǎng)穗偃麥草抗赤易位系。該培育方法有較多優(yōu)點(diǎn)，目標(biāo)染色體明確，標(biāo)記選擇效率高，培育周期短，為小麥異源易位系的創(chuàng)建提供了有效途徑。在易位系培育的標(biāo)記檢測(cè)過(guò)程中，先用7E染色體特異標(biāo)記對(duì)所有單株進(jìn)行檢測(cè)，再對(duì)陽(yáng)性單株進(jìn)行長(zhǎng)穗偃麥草7EL、7ES特異標(biāo)記檢測(cè)。理論上染色體特異引物檢測(cè)出的植株，有3種情況：標(biāo)記所在的片段是長(zhǎng)臂、標(biāo)記所在的片段是短臂，或者是長(zhǎng)、短臂都有。在分子標(biāo)記的檢測(cè)中，理論上染色體標(biāo)記檢測(cè)的植株總數(shù)和7EL、7ES標(biāo)記分別檢測(cè)的總數(shù)應(yīng)該相等，而實(shí)際上7EL、7ES標(biāo)記分別檢測(cè)的植株總數(shù)每代總是小于染色體標(biāo)記檢測(cè)的總數(shù)。有時(shí)染色體標(biāo)記能檢測(cè)的單株，7EL或7ES標(biāo)記卻無(wú)法檢測(cè)到。究其原因，在開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的時(shí)候，用的是正常附加系、代換系和親本的DNA，標(biāo)記在染色體上的物理位置不清楚。而經(jīng)過(guò)輻射誘變處理的小麥植株中，染色體因斷裂-重接而發(fā)生缺失、倒位、易位等一系列結(jié)構(gòu)畸變，在DNA水平上則表現(xiàn)為DNA片段的重排而產(chǎn)生堿基序列變異，而且這種變化會(huì)持續(xù)幾秒甚至若干年，有的染色體損傷可以修復(fù)，而有的損傷可能進(jìn)一步加重［42-44］。PCR能擴(kuò)增的片段相對(duì)于整條染色體來(lái)說(shuō)只是一段很微小的DNA，電離輻射的次級(jí)效應(yīng)將使這個(gè)很小的區(qū)段在易位系和附加系培育過(guò)程中可能發(fā)生持續(xù)的變異而產(chǎn)生遺傳多樣性，加上標(biāo)記擴(kuò)增的區(qū)段不同，導(dǎo)致某些區(qū)段用染色體標(biāo)記能檢測(cè)，而利用染色體臂標(biāo)記分別檢測(cè)卻未能檢測(cè)［45］。本研究是利用分子標(biāo)記檢測(cè)和赤霉病抗性鑒定相結(jié)合的方法對(duì)后代進(jìn)行選擇，最后獲得的是整臂易位系，一些小片段的易位在選擇過(guò)程中因沒(méi)有擴(kuò)增分子標(biāo)記而被淘汰。開(kāi)發(fā)更多的染色體特異標(biāo)記并確定它們?cè)谌旧w上的位置，對(duì)輻射后代小片段易位系的選擇具有重要作用。

3.3小麥-長(zhǎng)穗偃麥草7EL易位系的應(yīng)用

小麥異源易位系是小麥遺傳改良中最有用的資源，尤其是小片段的易位系可以直接作為親本與小麥雜交，豐富小麥基因庫(kù)，在小麥育種中發(fā)揮重要的作用。本研究所獲小麥-長(zhǎng)穗偃麥草7EL易位系，屬于Robertsonian易位，是小麥與其他近緣種培育的易位系中常見(jiàn)類(lèi)型［12-13，27，46-50］，是向小麥導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)的一種優(yōu)良遺傳中間材料和染色體研究材料，一直是小麥遺傳育種研究者青睞的特殊種質(zhì)。抗赤霉病基因（Fhb7）定位于7el2L上，并聚合了Fhb1與Fhb7 2個(gè)抗赤霉病基因［31］就是利用7DS·7el2L臂間易位材料。利用所獲得的整臂易位系，繼續(xù)輻射，可獲得大量的結(jié)構(gòu)變異體，如獲得7E染色體不同長(zhǎng)度片段的缺失變異體，就可以進(jìn)行分子標(biāo)記在7E染色體上物理定位，也可以獲得小麥-長(zhǎng)穗偃麥草7E小片段易位系和與其連鎖的分子標(biāo)記，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選抗赤霉病的小片段易位系。也可作為親本參與抗赤霉病小麥的培育，在雜交后代中，農(nóng)藝性狀的選擇可按常規(guī)進(jìn)行，而赤霉病抗性早代可借助分子標(biāo)記輔助選擇，保留農(nóng)藝性狀良好并具有長(zhǎng)穗偃麥草7EL標(biāo)記的單株進(jìn)行繁殖，在高世代后再進(jìn)行赤霉病抗性鑒定，可以節(jié)省早代赤霉病抗性鑒定，培育具有長(zhǎng)穗偃麥草抗赤霉病基因的小麥高產(chǎn)品種。

4　結(jié)論

利用60Co（30 000 rad）輻射揚(yáng)麥16與小麥-長(zhǎng)穗偃麥草代換系DS7E（7B）雜交的F2種子，通過(guò)染色體特異分子標(biāo)記篩選和基因組原位雜交驗(yàn)證，從衍生的M4代中獲得長(zhǎng)穗偃麥草7E長(zhǎng)臂易位系和短臂附加系，連續(xù)3年的赤霉病抗性鑒定表明7EL易位系的赤霉病抗性明顯高于7ES附加系，表明赤霉病抗性基因位于7EL。通過(guò)赤霉病抗性鑒定、染色體特異分子標(biāo)記篩選和GISH證實(shí)相結(jié)合從輻射后代中培育小麥-近緣種染色體易位系，易位片段鑒定快速和準(zhǔn)確，培育周期短。

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［49］ QI L， PUMPHREY M， FRIEBE B， ZHANG P， QIAN C， BOWDEN R， ROUSE M， JIN Y， GILL B. A novel Robertsonian translocation event leads to transfer of a stem rust resistance gene （Sr52） effective against race Ug99 from Dasypyrum villosum into bread wheat. Theoretical and Applied Genetics， 2011， 123: 159-167.

［50］ QI Z， DU P， QIAN B， ZHUANG L， CHEN H， CHEN T， SHEN J，GUO J， FENG Y， PEI Z. Characterization of a wheat-Thinopyrum bessarabicum （T2JS-2BS·2BL） translocation line. Theoretical and Applied Genetics， 2010， 121: 589-597.

（責(zé)任編輯李莉）

Development of Wheat -Thinopyrum elongatum Translocation Lines Resistant to Fusarium Head Blight

ZHANG Lu-lu1， CHEN Shi-qiang2， LI Hai-feng3， LIU Hui-ping1，4， DAI Yi1，4， GAO Yong1， CHEN Jian-min1
（1College of Bioscience and Biotechnology， Yangzhou University， Yangzhou 225009， Jiangsu；2Lixiahe Region Agricultural Scientific
Research Institute of Jiangsu， Yangzhou 225007， Jiangsu；3Yangzhou Polytechnic College， Yangzhou 225012， Jiangsu；4Jiangsu Provincial Key Lab for Agrobiology， Nanjing 210014）

【Objective】The objective of this study was to transfer the chromosome 7E of Thinopyrum elongatum into cultivated common wheat （Triticum aestivam L.） to develop translocation lines resistant to Fusarium Head Blight （FHB） and thereby to provide new germplasm for improving FHB resistance in common wheat.【Method】The F2seeds from the cross between Yangmai16 and DS7E（7B） were radiated using60Co （at 30 000 rad）， DS7E（7B） being a substitution line in which the chromosome 7B of ChineseSpring common wheat was substituted with the chromosome 7E of Th. elongatum. The survived M1plants were harvested， after visual selection for agronomic traits. The M2to M4populations were selected for agronomic traits， FHB resistance under single drop injection with Fusarium graminearum， and molecular markers specific to the chromosome and chromosomal arm of 7E for Th. elongatum， followed by cytological confirmation for the presence of 7E chromosomes using Th. elongatum genomic DNA as probe by genomic in situ hybridization （GISH）. 【Result】Thirteen M1plants with varying degrees of FHB resistance were selected， and the corresponding M2plants were examined for the presence of previously developed molecular markers specific to chromosome 7E . Seven plants were found to carry the long arm of 7E and 14 were found to carry the short arm of 7E. After selfing， 13 plants carrying markers specific to the long arm of 7E chromosome and 3 plants carrying markers specific to the short arm of 7E chromosome were identified out of 223 M3plants. GISH analysis was conducted for the progenies （M4） derived from 12 M3plants and it was found that the progenies from nine of the M3lines were wheat-Th. elongatum translocation lines （2n=42）， and those from two other M3plants were chromosome addition lines with the short arm of 7E （2n=44）. Continued selection led to the development of three translocation lines carrying the long arm of 7E， which were named as TW-7EL1， TW-7EL2 and TW-7EL3， respectively. A fourth line was a chromosome addition line with the short arm of 7E and was named as W-DA7ES. These four lines were derived from two different M1plants. Evaluation of FHB resistance indicated that the translation lines were similar to Sumai 3 in FHB resistance， better than Chinese Spring and Yangmai 16， while the addition line was considerably poorer in FHB resistance.【Conclusion】Translocation lines with chromosome 7EL that are resistant to FHB were developed effectively and accurately by joint use of phenotypic selection，screening for chromosome-specific molecular markers to 7E， and genomic in situ hybridization. The chromosome 7EL of Th.elongatum carries FHB-resistant genes.

wheat； Thinopyrum elongatum； Fusarium head blight； translocation lines

2016-04-11；接受日期：2016-06-01

國(guó)家自然科學(xué)基金（31071406）、國(guó)家自然科學(xué)-青年基金（31501303）、江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（49114042015K003）

聯(lián)系方式：張璐璐，E-mail：1401757469@qq.com。陳士強(qiáng)，E-mail：sqchen1116@163.com。張璐璐和陳士強(qiáng)為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者陳建民，Tel：0514-87979286；E-mail：jmchen@yzu.edu.cn