陳斯鈺,張 芮,楊云霞

(浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,浙江舟山 316022)

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赤點(diǎn)石斑魚(yú)FAS基因的克隆及序列分析

陳斯鈺,張 芮,楊云霞*

(浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,浙江舟山 316022)

[目的]研究赤點(diǎn)石斑魚(yú) (Epinephelus akaara) FAS基因的結(jié)構(gòu)與表達(dá)特性。[方法]以前期獲得的轉(zhuǎn)錄組序列作為數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用PCR技術(shù)，獲得赤點(diǎn)石斑魚(yú)FAS 基因的cDNA全序列。[結(jié)果]該序列與大黃魚(yú)(Larimichthy scrocea)FAS基因的相似度最高，為87%。該序列全長(zhǎng)8 505 bp，包括712 bp的3′UTR區(qū)、7 548 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)以及245 bp的5′UTR區(qū)，可編碼2 515個(gè)氨基酸。經(jīng)預(yù)測(cè)，該蛋白分子量為274.03 ku，等電點(diǎn)為5.98，其屬于親水性蛋白。通過(guò)Real-time PCR方法獲得FAS在赤點(diǎn)石斑魚(yú)各個(gè)組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，其在心臟中表達(dá)量最高，其次是在肝臟中。FAS基因的進(jìn)化與物種進(jìn)化一致。[結(jié)論]該研究為進(jìn)一步研究赤點(diǎn)石斑魚(yú)脂肪代謝奠定理論基礎(chǔ)，也為赤點(diǎn)石斑魚(yú)在養(yǎng)殖方面的工作提供基礎(chǔ)資料。

赤點(diǎn)石斑魚(yú)；FAS基因；組織分布

赤點(diǎn)石斑魚(yú)(Epinephelus akaara)俗稱(chēng)紅斑、紅過(guò)魚(yú)，隸屬于鱸形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)石斑魚(yú)屬(Epinephelus)，是我國(guó)南方名貴的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)[1]。其屬于亞熱帶暖溫性底層魚(yú)類(lèi)，多生活于巖礁底質(zhì)的海域，一般不結(jié)成大群，喜光線較暗區(qū)域，主要攝食魚(yú)類(lèi)和蝦類(lèi)[2]，主要分布于北太平洋西部，我國(guó)產(chǎn)于舟山群島以南經(jīng)臺(tái)灣海峽至南海、北部灣一帶海域。赤點(diǎn)石斑魚(yú)富含EPA、DHA等高不飽和脂肪酸，可預(yù)防心血管等疾病發(fā)生。赤點(diǎn)石斑魚(yú)肉味鮮美，又因人們認(rèn)為其身上的紅斑為吉祥之意，故市場(chǎng)上售價(jià)很高，是香港、廣東的主要養(yǎng)殖品種[3]。

FAS(fatty acid synthetase)基因是生物體內(nèi)脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，當(dāng)其表達(dá)水平和活性升高時(shí)，會(huì)顯著增加甘油三脂在體內(nèi)的沉積[4-6]；當(dāng)其活性受到抑制時(shí)，會(huì)阻滯生脂通路、減少脂肪的合成，還會(huì)造成丙二酰COA濃度的升高，降低食欲[7]。為深入了解FAS基因，很多學(xué)者對(duì)FAS功能、表達(dá)活性、調(diào)控機(jī)制等方面進(jìn)行了研究[8-14]。迄今為止，人們已分離得到人脂肪酸合成酶代謝調(diào)控基因，發(fā)現(xiàn)其脂肪酸合成酶基因位于17q25[15]，另外，牛的基因位于19q22，雞的基因位于18號(hào)染色體上[16]。此外，還有學(xué)者對(duì)綿羊肌肉中FAS基因表達(dá)的發(fā)育性變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)FAS基因mRNA水平在哈薩克羊肌肉中初生時(shí)最高(P<0.05)，隨日齡的增加呈下降趨勢(shì)；在新疆細(xì)毛羊肌肉中，F(xiàn)ASmRNA水平則表現(xiàn)出“下降-上升-下降-上升”的發(fā)育模式，其中，60日齡顯著高于90日齡(P<0.05)，其余日齡之間差異不顯著[17]。另有學(xué)者研究了不同填飼期肥肝鵝肝臟組織中不同脂肪酸沉積與脂肪酸合成酶FAS基因mRNA的表達(dá)豐度及相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)FAS基因mRNA的表達(dá)對(duì)肥肝鵝肝臟中脂肪的沉積具有填飼前、中期快速增加，填飼后期下降的調(diào)控作用[18]。熊文中等[19]研究發(fā)現(xiàn)，豬脂肪組織中脂肪酸合成酶和酮體脂肪量具有極顯著(P<0.01)的正相關(guān)關(guān)系。

關(guān)于FAS基因在哺乳動(dòng)物上的研究已很深入，而在魚(yú)類(lèi)上，研究者對(duì)FAS的研究?jī)H局限于FAS活性研究，對(duì)其基因研究相對(duì)較少。目前，GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)上僅見(jiàn)預(yù)測(cè)的斑馬魚(yú) Danio rerio FAS基因mRNA全序列 (GenBank:XM_001923608.2) 以及吉富羅非魚(yú) Oreochromis niloticus (GenBank:GU433188.1)、黑鯛 Acanthopagrusschlegelii (GenBank:EU780581.1)、軍曹魚(yú) Rachycent roncanadum (GenBank:FJ842647.1)、點(diǎn)帶石斑魚(yú)Epinephelus coioides (GenBank:FJ196231.1)、黑青斑河豚 Tetraodonnigroviridis (GenBank:CAF94659.1)等少數(shù)魚(yú)類(lèi)的FAS基因部分mRNA序列。關(guān)于赤點(diǎn)石斑魚(yú)的FAS基因，目前尚未見(jiàn)相關(guān)方面的研究。筆者以赤點(diǎn)石斑魚(yú)為研究對(duì)象，研究赤點(diǎn)石斑魚(yú)FAS基因的克隆及序列分析，為進(jìn)一步研究赤點(diǎn)石斑魚(yú)脂肪代謝奠定理論基礎(chǔ)，也為赤點(diǎn)石斑魚(yú)在養(yǎng)殖方面的工作提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料赤點(diǎn)石斑魚(yú)來(lái)自浙江海洋大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。將赤點(diǎn)石斑魚(yú)暫養(yǎng)7 d后，選擇外觀無(wú)明顯病狀、較為健康的赤點(diǎn)石斑魚(yú)。在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行無(wú)RNA操作：將其解剖后，獲得頭腎、腦、腸、脾、腹肌、肝、鰓、胃、心臟、背肌等組織。將各組織用錫箔紙包裹，做好標(biāo)記后，放入-80 ℃的冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2引物設(shè)計(jì)在NCBI網(wǎng)站上下載與赤點(diǎn)石斑魚(yú)相似的其他魚(yú)類(lèi)FAS基因序列，即大黃魚(yú) (Larimichthys crocea KP889061.1)、軍曹魚(yú)(Rachycentron canadum FJ842648.1)、羅非魚(yú) (Oreochromis niloticus GU433188.1)、南極鱈魚(yú) (Notothenia coriiceps XM_010792091.1) 的FAS基因序列，遵循引物設(shè)計(jì)原則，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0[20]和評(píng)估軟件PrimerSelect設(shè)計(jì)上、下游引物。由測(cè)序結(jié)果獲得FAS基因片段，同時(shí)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，獲得赤點(diǎn)石斑魚(yú)FAS基因的開(kāi)放閱讀框(Open read frame ,ORF) 序列,設(shè)計(jì)半定量RT-PCR反應(yīng)引物。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。EA-fas-CF：3′-CTTGATGGGTGTGGAGGTTCG-5′，EA-fas-CR：3′-AGTCTCGGCTGATGTTCTTGTG-5′；EA-fas-RT-ZF：3′-GCCAACAGCAAGCCAGAATCTC-5′，EA-fas-RT-ZR：3′-GCAGCAGTGGAGCCCTCAAT-5′；β-actin-F：3′-CGACCTCACAGACTACCT-5′，β-actin-R：3′-AACGGAACCTCTCATTGC-5′。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1總RNA的提取并檢測(cè)。取各新鮮組織于Eppendorf 離心管中,采用Trizol法，通過(guò)取樣、處理、去蛋白、沉淀、洗滌、干燥、溶解等步驟，提取各個(gè)組織的總RNA。并將所提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.2cDNA模板的制備及FAS基因序列全長(zhǎng)的獲得。根據(jù)RNA的檢測(cè)濃度，取各組織RNA 2 μL于Eppendorf離心管中，再加入2.0 μL Buffer、0.5 uL oligo(dT)、0.5 μL Random.6、0.5 μL mix，最后加4.5 μL RNase FreedH2O補(bǔ)足。將PCR儀反應(yīng)程序設(shè)置為37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，最后加入40.0 μL ddH2O進(jìn)行稀釋?zhuān)@得cDNA模板，放入4 ℃冰箱中備用。

利用合成的引物(EA-fas-CF、EA-fas-CR)，并結(jié)合腦、胃、心臟等模板進(jìn)行中間片段的PCR擴(kuò)增。根據(jù)說(shuō)明書(shū)添加如下反應(yīng)體系：10×Buffer 3.0 μL、dNTP 2.0 μL、上下引物各0.4 μL、rTaq 0.2 μL、模板0.6 μL、ddH2O 23.4 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。當(dāng)PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇檢測(cè)結(jié)果具有明亮條帶的PCR產(chǎn)物，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行純化、克隆，獲得基因序列，再以實(shí)驗(yàn)室前期獲得的轉(zhuǎn)錄組序列作為數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索獲得FAS基因序列，并通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast程序進(jìn)行序列驗(yàn)證。

1.3.3RT-PCR擴(kuò)增。以β-actin作為參考基因，重新設(shè)計(jì)RT-PCR引物(EA-fas-RT-CF、EA-fasR-T-CR)，以腦、腸、脾、腹肌、肝、鰓、胃、心臟、背肌作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增，每組反應(yīng)體系：premix 7.5 uL、模板 1.0 μL、上下引物各0.6 μL、ddH2O 6.3 μL。RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95.5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4數(shù)據(jù)分析所得數(shù)據(jù)采用2-ΔCt法，計(jì)算FAS基因在赤點(diǎn)石斑魚(yú)各組織中的相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果與分析

2.1總RNA檢測(cè)結(jié)果將所提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，在每個(gè)組織中均能觀察到28S、18S、5S 3條明亮、清晰的條帶。

注：1.腦；2.腸；3.脾；4.腹??；5.肝；6.鰓；7.胃；8.心臟；9.背肌。Note: 1.Brain;2.Intestine;3.Spleen;4.Abdo minal muscle;5.Liver;6.Gills;7.Stomach;8.Heart;9.Back muscle.圖1　赤點(diǎn)石斑魚(yú)9個(gè)組織的總RNA電泳分析Fig.1　Electrophoretic analysis of total RNA expression in nine tissues of Epinephelus akaara

2.2FAS基因cDNA全長(zhǎng)序列及其編碼氨基酸序列利用赤點(diǎn)石斑魚(yú)肝臟的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以及與其他物種FAS基因序列，通過(guò)PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序分析，拼接得到cDNA全序列長(zhǎng)度為8 505 bp。由ORF-Finder檢索得到，該序列由7 548 bp編碼區(qū)、712 bp的3′UTR區(qū)和245 bp的5′UTR區(qū)組成，共編碼2 515個(gè)氨基酸。經(jīng)ProtParam (http://web.expasy.org/ protparam)軟件分析，預(yù)測(cè)赤點(diǎn)石斑魚(yú)FAS蛋白質(zhì)分子量為274.03 ku，等電點(diǎn)為5.98。利用ProtScale (http://web.expasy.org/protscale)在線預(yù)測(cè)赤點(diǎn)石斑魚(yú)FAS的氨基酸親/疏水性，結(jié)果顯示，赤點(diǎn)石斑魚(yú)FAS蛋白序列中疏水性氨基酸殘基所占面積小于親水性氨基酸殘基，其中，疏水性最大值為2.689，親水性最大值為3.000，可以推測(cè)該蛋白屬于親水性蛋白。此外，經(jīng)過(guò)SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)在線預(yù)測(cè)，得知FAS蛋白有2個(gè)特有的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是PKS_ER 結(jié)構(gòu)域(位于第1 549～1 864個(gè)氨基酸)；另一個(gè)是PKS_KR結(jié)構(gòu)域(位于第1 896～2 077個(gè)氨基酸)。

2.3FAS基因的同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast程序進(jìn)行序列驗(yàn)證，結(jié)果顯示，該序列與大黃魚(yú)(Larimichthy scrocea)、深裂眶鋸雀鯛(Stegastes partitus)、羅非魚(yú)(Stegastes partitus)等的FAS基因核苷酸序列均有較高的相似度，分別為87%、86%、83%。選取NCBI上已知的魚(yú)類(lèi)及其他高等脊椎動(dòng)物的FAS基因序列，運(yùn)用軟件ClustalX進(jìn)行多序列比對(duì)分析，并以MEGA5.1軟件中的鄰接法(Neighbor Joining)構(gòu)建多物種的FAS基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(圖2)。由圖2可知，所獲得的進(jìn)化樹(shù)由2個(gè)主要分支組成，其中一支主要分支又分為兩分支，一支為各種魚(yú)類(lèi)，一支為原雞和熱帶爪蟾，另一支主要分支為人和小鼠。

圖2　基于FAS氨基酸序列構(gòu)建脊椎動(dòng)物系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(NJ樹(shù))Fig.2　Phylogenetic tree of vertebrates based on FAS a mino acid sequence

2.4赤點(diǎn)石斑魚(yú)FAS基因在各組織中的差異表達(dá)為研究赤點(diǎn)石斑魚(yú)不同組織FAS表達(dá)的差異性,通過(guò)RT-PCR對(duì)赤點(diǎn)石斑魚(yú)9個(gè)組織的FAS相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，F(xiàn)AS基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)(圖3)，但不同組織中的表達(dá)量明顯不同，心臟中相對(duì)表達(dá)量最高，為0.069；其次是肝和腸，表達(dá)量分別為0.017和0.015；而腦與脾的表達(dá)量相同，均為0.011；在腹肌、鰓、胃、背肌中的相對(duì)表達(dá)量差異不大，分別為0.007、0.003、0.002、0.003。

圖3　赤點(diǎn)石斑魚(yú)FAS基因在不同組織中的表達(dá)情況Fig.3　Tissue expression of FAS gene in different tissues of Epinephelus akaara

3　討論

脂肪酸合成酶是一種多功能酶復(fù)合物，在動(dòng)物生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，其最早是在鵝的肝臟中發(fā)現(xiàn)的，隨后研究者對(duì)人、鼠、豬、牛也進(jìn)行了相關(guān)方面的研究[21-23]。該研究獲得FAS基因全序列，其全長(zhǎng)為8 505 bp，由712 bp的3′UTR區(qū)、7 548 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)以及245 bp的5′UTR區(qū)組成，共編碼2 515個(gè)氨基酸。該序列與大黃魚(yú)FAS基因序列相似度最高，為87%，其高度保守性揭示魚(yú)類(lèi)FAS蛋白可能具有相似的功能和特性，在動(dòng)物生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用。經(jīng)預(yù)測(cè)，F(xiàn)AS蛋白屬于親水性蛋白，蛋白分子量為274.03 ku，等電點(diǎn)為5.98。且FAS蛋白具有2個(gè)特有的結(jié)構(gòu)域，分別為PKS_ER 結(jié)構(gòu)域和PKS_KR結(jié)構(gòu)域，這2個(gè)結(jié)構(gòu)域在生物脂肪酸合成過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。此外，通過(guò)構(gòu)建FAS基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)赤點(diǎn)石斑魚(yú)與大黃魚(yú)、軍曹魚(yú)親緣關(guān)系更接近，與人和小鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而與原雞、熱帶爪蟾在FAS基因進(jìn)化上比哺乳類(lèi)有更近的親緣關(guān)系。該結(jié)果不僅支持了硬骨魚(yú)類(lèi)的單系起源，也顯示脊椎動(dòng)物從水生到陸生的進(jìn)化軌跡，反映了物種間的進(jìn)化關(guān)系。

該研究通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)赤點(diǎn)石斑魚(yú)FAS基因在腦、腸、脾、腹肌、肝臟、鰓、心臟、胃、背肌等組織中均有表達(dá)，且在心臟中表達(dá)量最高，其次是在肝臟中。FAS基因的表達(dá)直接影響脂肪酸合成酶的多寡，對(duì)魚(yú)體內(nèi)脂肪酸的合成具有極大影響。關(guān)于脂肪酸合成部位，研究表明，脂肪酸的合成部位在不同物種中具有差異性，哺乳動(dòng)物主要在脂肪組織中合成脂肪酸，而家禽脂肪酸合成部位主要在肝臟，由肝臟合成的脂肪酸約占總量的90%[24]。研究發(fā)現(xiàn)，不同魚(yú)類(lèi)在不同組織中FAS基因mRNA表達(dá)量不同，瓦氏黃顙魚(yú) (Pelteobaggrus vachelli) 在腸道中表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織，肝臟組織中的表達(dá)量顯著高于肌肉、腦組織和腹腔脂肪組織[25]；匙吻鱘 (Polyodon spathula)在肝臟中表達(dá)量最高，其次是在腹腔脂肪中，在胃中表達(dá)量最低；而鳙 (Aristichthysnobilis) 在咽器官表達(dá)量最高，其次在腸道組織中，在鰓中表達(dá)量最低[26]。研究發(fā)現(xiàn)，吉富羅非魚(yú)肝臟中FASmRNA的表達(dá)豐度高于肌肉,且飼料脂肪水平能夠抑制FASmRNA表達(dá),脂肪水平越高抑制作用越明顯[27]。由于個(gè)體差異，不同物種在不同生長(zhǎng)條件下，各個(gè)組織中FAS基因mRNA表達(dá)量不同。該研究對(duì)赤點(diǎn)石斑魚(yú)不同組織中FAS基因不同表達(dá)量的探索，對(duì)脂肪酸合成調(diào)控研究具有一定的現(xiàn)實(shí)意義，通過(guò)對(duì)組織中脂肪酸合成酶量的調(diào)節(jié)，可以有效地控制魚(yú)體內(nèi)脂肪的沉積，從而提高魚(yú)肉品質(zhì)。因此，對(duì)FAS基因mRNA表達(dá)的時(shí)空性及不同條件下的表達(dá)調(diào)控需要在今后研究中進(jìn)一步探索。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)和不斷成熟，人們從分子生物學(xué)水平對(duì)脂肪代謝的調(diào)控進(jìn)行了一定探索性的研究。而該研究獲得的赤點(diǎn)石斑魚(yú)FAS基因全長(zhǎng)序列，為進(jìn)一步對(duì)赤點(diǎn)石斑魚(yú)脂肪相關(guān)的研究以及育種提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為今后研究赤點(diǎn)石斑魚(yú)與鱸魚(yú)目等近緣物種間分子進(jìn)化和遺傳分化奠定理論基礎(chǔ)。

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Cloning and Sequence Analysis of FAS Gene in Epinephelus akaara

CHEN Si-yu,ZHANG Rui,YANG Yun-xia*

(College of Fishery,Zhejiang Ocean University,Zhoushan,Zhejiang 316022)

[Objective]To research the structure and expression characteristics of FAS (Fatty Acid Synthase) gene in Epinephelus akaara.[Method]With the transcriptome sequence obtained in previous research as the database,PCR technology was used to obtain the cDNA sequence of FAS gene in E.akaara.[Result]This sequence had high similarity with that of Larimichthy scrocea (87%).The total length of FAS gene was 8 505 bp,which included 712 bp 3′UTR,7 548 bp open reading frame (ORF),and 245 bp 5′UTR.A total of 2 515 amino acids were encoded.The protein molecular weight was 274.03 ku,isoelectric point was 5.98,and it belonged to the hydrophilic protein.Results of Real-time PCR showed that FAS gene had the highest expression in heart,followed with liver.Evolution of FAS gene was in accord with that of species.[Conclusion]This research lays theoretical basis for the fat metabolism of E.akaara,and provides basic data for the cultivation of E.akaara.

Epinephelus akaara;FAS gene;Tissue distribution

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目(2016R411016)；浙江海洋學(xué)院科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(Q1418)；浙江海洋大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(xj201512)。

陳斯鈺(1995- )，女，浙江紹興人，本科生，專(zhuān)業(yè)：水產(chǎn)養(yǎng)殖。*通訊作者，講師，博士，從事動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)研究。

2016-07-08

S 965.334

A

0517-6611(2016)25-109-03