梁飛燕，張科明，盧日剛

(1.廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西南寧 530021；2.廣西食品藥品檢驗所，廣西南寧 530021)

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QuEChERS方法凈化UPLC-MS檢測豬肉中35種獸藥殘留

梁飛燕1，張科明2，盧日剛2

(1.廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西南寧 530021；2.廣西食品藥品檢驗所，廣西南寧 530021)

[目的]建立QuEChERS方法提取和凈化、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS)檢測豬肉中35種獸藥殘留的方法。[方法]豬肉樣品分別用Na2EDTA-Mcllvaine(pH 4.0)溶液和2.5%乙酸乙腈提取后，得到的溶液以NaCl和無水Na2SO4為脫水劑，-NH2為吸附劑進行凈化濃縮后，在電噴霧正離子模式下，以多反應監(jiān)測(MRM)方法進行檢測，基質(zhì)空白加標曲線外標法進行定性和定量分析。[結(jié)果]35種獸藥在0.5～50.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，4個不同濃度添加水平的平均回收率為60%～110%，相對偏差(RSD)均小于10%，檢出限(LOD，S/N=3∶1)為0.02～1.20 μg/kg，定量限(LOQ，S/N=10∶1)為0.07～4.00 μg/kg。[結(jié)論]該方法簡單、快速、可靠、靈敏、高效，可用于豬肉中多獸藥殘留的分析檢測和監(jiān)控。

獸藥殘留；檢測；QuEChERS；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

獸藥殘留(residues of veterinary drug)是“獸藥在動物源食品中的殘留”的簡稱，根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)食品中獸藥殘留聯(lián)合立法委員會的定義，獸藥殘留是指動物產(chǎn)品的任何可食部分所含獸藥的母體化合物及(或)其代謝物，以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)。濫用獸藥極易造成動物源食品中有害物質(zhì)的殘留，這不僅對人體健康造成直接危害，而且對畜牧業(yè)的發(fā)展和生態(tài)環(huán)境也造成極大危害。動物源食品中的獸藥殘留已逐漸成為全世界關(guān)注的一個焦點。因此，嚴格監(jiān)控動物源性食品中的獸藥殘留具有重要的意義。

目前，我國關(guān)于動物源性食品中獸藥殘留檢測的國家標準[1-4]大部分都是以分類檢測為主，一個樣本要進行多次檢驗，需要耗費極大的人力、物力、財力和時間。同時，動物源性食品種類繁多，樣品基質(zhì)復雜，檢測目標物種類和組分多，理化性質(zhì)差異大，是獸藥殘留分析檢測技術(shù)的重大難題。近年來，關(guān)于獸藥殘留檢測報道的相關(guān)文獻中，樣品前處理技術(shù)主要有：固-液萃取法[5-8]、固相萃取法[9-10]、基質(zhì)固相分散技術(shù)[11-12]、QuEChERS方法[13-14]等，檢測技術(shù)有：高效液相色譜法[15-16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17-18]、液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜法[19-20]。QuEChERS方法是近年來發(fā)展起來的樣品前處理技術(shù)，具有快速、簡易、環(huán)保、價廉的優(yōu)點，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時具備了色譜和質(zhì)譜的優(yōu)點，對基質(zhì)復雜的樣品具有選擇性強、靈敏度高、分離能力強以及能提供分子量和結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點，已成為當前檢測獸藥殘留的重要手段。常用的獸藥有磺胺類及其增效劑、β-受體激動劑、四環(huán)素類、喹諾酮類、抗病毒類、孕激素類、蛋白同化激素類等，此類獸藥極性差異大，難以用一種方法同時進行檢測分析，現(xiàn)鮮有文獻報道此類獸藥殘留同時測定的方法。因此，為簡化分析檢測方法，提高提取和凈化效率，提高檢測靈敏度，建立快速、有效、高通量的多獸藥殘留分析方法，筆者對豬肉中的多獸藥殘留進行了考察，建立了QuEChERS方法凈化，UPLC-MS方法同時檢測了磺胺類及其增效劑、β-受體激動劑、四環(huán)素類、喹諾酮類、抗病毒類、孕激素類、蛋白同化激素類共7類35種獸藥。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標準品。19種磺胺類及其增效劑：磺胺甲噻二唑、磺胺二甲異噁唑、磺胺氯噠嗪、磺胺噻唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺二甲異嘧啶鈉鹽、琥珀酰磺胺噻唑、磺胺喹噁啉、磺胺噁唑，購自Dr.Ehrenstorfer GmbH；磺胺嘧啶、磺胺甲(基異)噁唑、磺胺苯吡唑、甲氧芐啶，購自中國食品藥品檢定研究院。5種β-受體激動劑：鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺(鹽酸鹽)、沙丁胺醇、克侖潘特鹽酸鹽，購自Dr.Ehrenstorfer GmbH；馬噴特羅鹽酸鹽，購自WITEGA。4種四環(huán)素類：四環(huán)素鹽酸鹽、土霉素、金霉素鹽酸鹽，購自Dr.Ehrenstorfer GmbH；美滿霉素，購自中國食品藥品檢定研究院。3種喹諾酮類：諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星，購自中國食品藥品檢定研究院。1種抗病毒類：金剛烷胺，購自中國食品藥品檢定研究院。1種孕激素類：黃體酮，購自中國食品藥品檢定研究院。2種蛋白同化激素類：睪酮、甲睪酮，購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2主要試劑與耗材。檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸、冰醋酸、氯化鈉、無水硫酸鈉，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉，分析純，廣東光華科技股份有限公司；-NH2吸附劑，實驗室專用，安譜；乙腈、甲酸，色譜純，德國默克公司；試驗用水，GB/T 6682規(guī)定的一級水；去離子水，美國密理博公司；微孔濾膜(0.22 μm、尼龍)，安譜；15、50 mL塑料離心管，CNW。

1.1.3主要儀器設備。安捷倫1290超高效液相色譜儀串聯(lián)Triple Quad 5500三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；FS25勻漿機，福祿克公司；VORTEX GENIE-2渦旋振蕩儀，SCIENTIFIC INDUSTRIES，INC.；S180H超聲波清洗器，艾爾瑪公司；ROTANTA 460R離心機，海蒂詩公司；N-EVAPTM112氮吹儀，美國Organomation Associates，Inc.。

1.1.4溶液的配制。Mcllvaine緩沖溶液：取0.1 mol/L檸檬酸溶液1 000 mL與0.1 mol/L Na2HPO4溶液625 mL混勻。Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH 4.0)：稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉放入1 625 mL Mcllvaine緩沖溶液中，振搖使其溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0。

1.2方法

1.2.1樣品前處理。稱取勻漿后的豬肉樣品2.0 g于50 mL離心管中，加入Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液(pH 4.0)5.0 mL，搖勻，超聲5 min，渦旋1 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液置另一50 mL離心管中，殘渣再精密加入2.5%乙酸乙腈溶液20 mL，搖勻，超聲5 min，渦旋1 min，10 000 r/min離心5 min，合并2次提取的上清液置同一50 mL離心管中，加入NaCl 2.0 g，無水Na2SO42.0 g，渦旋5 min，5 ℃10 000 r/min離心5 min。精密吸取上清液10 mL置15 mL離心管中，加入-NH2吸附劑200 mg，渦旋5 min，5 ℃ 10 000 r/min離心5 min。精密吸取上清液5.0 mL置15 mL離心管中，50 ℃氮氣吹干，加入0.1%甲酸-25%乙腈水溶液1.0 mL，超聲5 min，渦旋1 min，用0.22 μm濾膜過濾，取濾液上機測定。

1.2.2色譜-質(zhì)譜條件。色譜條件：XBridge? BEH C18，2.5 μm，4.6×100 mm；流動相為A，0.1%甲酸水溶液；B，0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～2.0 min，95%～80% A；2.0～4.0 min，80%～75% A；4.0～7.0 min，75%～45% A；7.0～11.0 min，45%～10% A；11.0～16.0 min，10% A；流速0.5 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：掃描模式為正離子(ESI+)；采集方式為多反應監(jiān)測(MRM)；離子源溫度650 ℃，霧化氣壓力(GSI)3.79×105Pa；輔助氣壓力3.79×105Pa；氣簾氣壓力(CUR)：2.41×105Pa；碰撞氣體速度為中流速；電噴霧電壓(IS)為5 500 V；去簇電壓(DP)130.0 V、碰撞室入口電壓(EP)為10.0 V、出口電壓(CXP)13.0 V；35種目標化合物母離子、碎片離子(定量離子、定性離子)及其碰撞電壓(CE)詳見表1。

表1　35種目標化合物質(zhì)譜參數(shù)

接下表

續(xù)表1

2　結(jié)果與分析

2.1儀器條件的優(yōu)化

2.1.1流動相的優(yōu)化。流動相的離子強度和酸堿度均會影響目標物的峰形和分離效果。通過查閱相關(guān)文獻[21-23]，該試驗考察了6種流動相：①0.01 mol/L乙酸銨溶液(用甲酸調(diào)節(jié)pH至4.5)-乙腈；②0.01 mol/L乙酸銨溶液(用甲酸調(diào)節(jié)pH至4.5)-甲醇；③0.01 mol/L乙酸銨溶液(用甲酸調(diào)節(jié)pH至4.5)-0.01 mol/L乙酸銨乙腈溶液；④0.1%甲酸溶液-乙腈；⑤0.1%甲酸溶液-甲醇；⑥0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸乙腈溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當流動相為0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸乙腈溶液時(圖1)，各化合物的峰形對稱性好，靈敏度高，基線噪音明顯降低，故選擇了0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸乙腈溶液作為流動相。

圖1　流動相⑥分離效果Fig.1　The isolation effect of mobile phases ⑥

2.1.2色譜柱條件的優(yōu)化。該試驗考察了如下色譜柱：CORTECSTMC18，2.7 μm，4.6×100 mm；XBridge? BEH C18，2.5 μm，4.6×100 mm；XBridgeTMphenyl，3.5 μm，2.1×150 mm；ACQUITY UPLC? CSHTM C18，1.7 μm，3.0×150 mm；Poroshell 120 EC-C18，2.7 μm，4.6×50 mm；CAPCELL PAK C18MGⅢ-H，3 μm，2.0 mm I.D.×100 mm；Inertsil C8-3，2 μm，2.1×100 mm。通過比較發(fā)現(xiàn)，C8和phenyl填料對目標物的保留能力弱，峰形較寬，分離度不好；CORTECS、MGⅢ對大部分磺胺類、喹諾酮類的保留性均較差；CSH、Poroshell雖然對目標物的保留能力好，但是峰形較寬不理想；采用BEH的C18色譜柱時，35種目標物的保留能力好，峰形對稱性良好，故該試驗采用了BEH的C18色譜柱。

2.2樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的選擇。該試驗查閱了相關(guān)文獻[24-25]，考察了4種不同的溶劑進行提?。孩?.1 mol/L檸檬酸-0.2 mol/L Na2HPO4溶液(8∶5，V∶V，pH 4)；②Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH 4.0)；③5%的乙酸乙腈；④5%的氨水乙腈。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當提取溶劑中含有絡合劑時，由于絡合了與四環(huán)素類和喹諾酮類化合物中螯合的金屬離子，使得四環(huán)素類和喹諾酮類被釋放出來，提取回收率明顯提高；磺胺類、四環(huán)素類和喹諾酮類化合物在堿性條件時會降解，提取回收率大大降低；提取溶劑中適當?shù)乃岫龋欣诳共《绢?、孕激素、蛋白同化激素類化合物的提取；?受體激動劑、抗病毒類、孕激素、蛋白同化激素在酸、堿條件下均比較穩(wěn)定，提取效果相當。

鑒于35種化合物理化性質(zhì)差異大，用一種溶劑很難將全部化合物提取完全，故該試驗還考察了2種溶劑復提取的方式：①0.1 mol/L檸檬酸-0.2 mol/L Na2HPO4溶液(8∶5，V∶V，pH 4)→5%的乙酸乙腈；②Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH 4.0)→5%的乙酸乙腈。通過試驗發(fā)現(xiàn)，2種溶劑復提取的提取效果均優(yōu)于單一溶劑提取的效果，采用含有絡合劑的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH 4.0)→5%的乙酸乙腈作為提取溶劑，35種化合物的提取回收率比較理想。各種提取溶劑的提取回收率如圖2所示。

圖2　6種提取溶劑的平均提取回收率Fig.2　The average recovery of 6 extraction solvents

由于β-受體激動劑、四環(huán)素類、喹諾酮類、抗病毒類、孕激素類、蛋白同化激素類中含有堿性基團，適當?shù)乃岫雀谏鲜龌衔锏奶崛?。為此該試驗還考察了1.0%、2.5%、5.0%、7.0%的乙酸乙腈的提取效果，發(fā)現(xiàn)磺胺類和四環(huán)素類化合物對酸度比較敏感，酸度過低，電離程度低而使得提取回收率偏低；當酸度>5%時，部分磺胺可能會降解，故該試驗采用了2.5%的乙酸乙腈。

2.2.2凈化條件的優(yōu)化。QuEChERS方法意為：快速(quick)、簡單(easy)、便宜(cheap)、高效(effective)、耐用(rugged)和安全(safe)[26]，該法常用的吸附劑有：C18、-NH2吸附劑、中性氧化鋁、酸性氧化鋁、硅藻土、硅鎂吸附劑、乙二胺-N-丙基丙烷(PSA)/硫酸鎂。通過對上述吸附劑的凈化效果和吸附作用進行考察，結(jié)果如圖3所示：中性氧化鋁、酸性氧化鋁、乙二胺-N-丙基丙烷(PSA)/硫酸鎂、硅鎂吸附劑、硅藻土對四環(huán)素類、喹諾酮類化合物、孕激素均有不同程度的吸附，且凈化效果不理想，基線噪音大，干擾峰多。C18和-NH2吸附劑對35種目標化合物的吸附能力相對較小，提取回收率良好，但-NH2吸附劑凈化效果比C18的明顯，雜質(zhì)峰干擾少。同時該試驗還考察了吸附劑用量對凈化效果和提取回收率的影響：100 mg-NH2吸附劑、200 mg-NH2吸附劑、400 mg-NH2吸附劑、200 mg-NH2吸附劑+200 mg C18，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吸附劑用量對于響應小、靈敏度低的物質(zhì)如四環(huán)素類影響比較大，當用量為200 mg-NH2吸附劑時，基線噪音小，凈化效果明顯，提取回收率良好，故該試驗采用了200 mg-NH2做為吸附劑。

圖3　7種吸附劑的平均提取回收率Fig.3　The average recovery of 7 adsorbents

2.2.3復溶溶劑的選擇。復溶溶劑中有機相的比例和酸堿度均會影響目標化合物溶解，同時進樣時還會影響到色譜的基線和峰形，即造成溶劑效應。該試驗根據(jù)各目標化合物的溶解性能，考察了以下溶劑：①0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸乙腈(85∶15)，②水-乙腈(85∶15)，③0.1%甲酸-25%乙腈水溶液，④0.1%甲酸-50%乙腈水溶液。通過比較發(fā)現(xiàn)，甲酸的存在，更利于含有堿性基團物質(zhì)的溶解；當有機相中乙腈的濃度大于25%時，非極性物質(zhì)如孕激素、蛋白同化類激素能更好地溶解，故該試驗采用了0.1%甲酸-25%乙腈水溶液作為復溶溶劑。

2.3基質(zhì)效應的消除在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法中，基質(zhì)效應的產(chǎn)生可能是基質(zhì)與待分析組分在離子化過程中發(fā)生競爭，使得目標化合物的碎片離子生成的效率和離子強度顯著地減低或增高，從而影響測量結(jié)果的精密度和準確性。為了抵消基質(zhì)效應對測定結(jié)果的影響，該試驗對以下方法進行了比較：①純標準物質(zhì)線性；②基質(zhì)空白加標線性：將空白樣品按前處理方法提取凈化后，在提取液中添加目標化合物配制成系列標準曲線，再按已定的色譜質(zhì)譜條件進行檢測[27]；③隨行加標線性：取空白樣品，加入一定量的標準溶液，與樣品同時進行提取和凈化得到的線性。用上述3種線性分別對同一加標回收率溶液計算回收率進行比較發(fā)現(xiàn)，通過基質(zhì)空白加標線性的方法能夠很好地消除基質(zhì)帶來的影響，得到的線性、加標回收率均能滿足食品殘留檢測的要求。

2.4方法線性、精密度、檢出限、定量限和準確度為了消除基質(zhì)效應，該試驗采用了基質(zhì)空白溶液配制標準曲線。以濃度為橫坐標，各化合物提取得到的定量離子峰的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算相關(guān)系數(shù)，得到35種目標化合物在濃度為0.5～50.0 ng/mL范圍內(nèi)，色譜峰面積和濃度呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.995以上；同一標準曲線溶液連續(xù)進樣6次，各化合物定量離子峰的峰面積RSD均<4%，儀器精密度良好。

同時，取空白豬肉樣品，采用逐級稀釋的方法添加適量的標準品溶液，按照“1.2.1”項下的步驟同法處理，“1.2.2”項下的色譜-質(zhì)譜條件進樣，得到空白樣品加標色譜圖，以各化合物定量離子質(zhì)譜圖峰高按照信噪比(S/N)為1∶3、1∶10分別計算檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。得到35種目標化合物檢出限范圍為0.02～1.20 μg/kg，定量限范圍為0.07～4.00 μg/kg。通過與動物源性食品獸藥殘留檢測方法相關(guān)國家標準[1-4]比較，該方法檢出限低、靈敏度較高，可滿足豬肉中獸藥殘留檢測的要求。

取空白豬肉樣品，按照2、4、20、100 μg/kg的濃度水平添加標準品溶液，一式4份，渦旋1 min，靜置30 min后按照“1.2.1”項下的步驟同法處理，“1.2.2”項下的色譜-質(zhì)譜條件進樣，根據(jù)各組分的峰面積計算加標回收率。同時制備同一添加水平(20 μg/kg)6份用于測定重復性。結(jié)果35種目標化合物4個不同濃度添加水平平均回收率在60%～110%，相對標準偏差均小于10%，整體回收率水平和方法重復性良好，符合食品檢測的要求。

2.5樣品測定對分別購自超市、市場等的10份豬肉樣品，采用該試驗建立的方法進行測定，同時做加標樣品(20 μg/kg)進行質(zhì)量控制，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)陽性樣品，樣品測定色譜圖見圖4，加標樣品提取回收率良好，各目標化合物的提取回收率在62%～83%，加標樣品色譜圖見圖5。

圖4　豬肉樣品色譜Fig.4　Chromatogram of pork samples

圖5　加標樣品色譜Fig.5　Chromatogram of spiked sample

3　結(jié)論與討論

該試驗建立了QuEChERS凈化、結(jié)合UPLC-MS方法同時檢測豬肉中磺胺類及其增效劑、β-受體激動劑、四環(huán)素類、喹諾酮類、抗病毒類、孕激素類、蛋白同化激素類共7類35種獸藥的方法。與國家標準相比，該方法克服了單一種類獸藥殘留檢驗操作繁瑣、檢驗周期長、成本高的缺點，實現(xiàn)了多類理化性質(zhì)差異大的獸藥殘留的同時測定。該方法操作簡單、快速、靈敏、準確、高通量，適用于豬肉中多獸藥殘留的篩查和監(jiān)測。

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Determination of 35 Kinds of Veterinary Drugs Residues in Pork by QuEChERS Purification-UPLC-MS

LIANG Fei-yan1,ZHANG Ke-ming2,LU Ri-gang2

(1.Guangxi-Asean Center for Food and Drug Safety Control,Nanning,Guangxi 530021;2.Guangxi Institute for Food &Drug Control,Nanning,Guangxo 530021)

[Objective]To establish the QuEChERS purification-UPLC-MS detection method of 35 kinds of veterinary drugs residues in pork.[Method]The pork samples were extracted by Na2EDTA-Mcllvaine (pH 4.0) and 2.5% acetic acid acetonitrile respectively,the solution obtained was purified and concentrated by using the dehydrating agent of NaCl and anhydrous Na2SO4and the adsorbent of -NH2,and then was detected in electrospray ionization in positive ion mode with the method of multiple reaction monitoring (MRM),qualitative and quantitative analysis was conducted by matrix spiked blank curve external standard method.[Result]The linear relations of 35 kinds of veterinary drugs were good in the range of 0.5-50.0 ng/mL concentration and the correlation coefficients were greater than 0.995,the average recovery rates of 4 different concentrations were 60%-110%,relative deviations (RSD) were less than 10%,the detection limits(LOD,S/N=3∶1) were 0.02-1.20 μg/kg,the quantitative limits (LOQ,S/N=10∶1) were 0.07-4.00 μg/kg.[Conclusion]The method is simple,rapid,reliable,sensitive and efficient,and can be used for the detection and monitoring of multi drug residues in pork.

Veterinary drug residue;Detection;QuEChERS;Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

梁飛燕(1983- )，女，廣西南寧人，主管藥師，碩士，從事食品、保健食品、藥品的檢驗檢測與研究。

2016-07-17

S 851.34+7

A

0517-6611(2016)25-041-05