羅德梅，李文紅，王 倩，杜文靜，孟 巖，李慧君，閆 怡，馮 寧，馬秀敏，羅 莉

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·論著·

Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清抗角蛋白抗體和抗環(huán)瓜氨酸肽抗體及類風(fēng)濕因子的檢測(cè)分析

羅德梅，李文紅，王 倩，杜文靜，孟 巖，李慧君，閆 怡，馮 寧，馬秀敏，羅 莉

目的對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠血清抗角蛋白抗體(AKA)、抗環(huán)瓜氨酸肽(Anti-CCP)抗體及類風(fēng)濕因子(RF)進(jìn)行檢測(cè)，并分析其與人類類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的血清免疫學(xué)是否相似。方法2014年11月—2015年3月，15只SPF級(jí)7～8周健康雌性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取5只作為空白對(duì)照組，10只用于建立CIA模型，最終8只造模成功(CIA模型組)。造模成功后，采集CIA模型組和空白對(duì)照組大鼠股動(dòng)脈血，常規(guī)分離血清，分別采用間接免疫熒光(IIF)法檢測(cè)兩組大鼠血清AKA，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)Anti-CCP抗體和RF-IgM抗體；分離膝關(guān)節(jié)滑膜，用40 g/L多聚甲醛固定作為病理標(biāo)本，進(jìn)行HE染色。結(jié)果CIA模型組大鼠血清AKA陽性5例，空白對(duì)照組均陰性?？瞻讓?duì)照組和CIA模型組大鼠血清Anti-CCP抗體及RF-IgM抗體水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。空白對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理HE染色可見滑膜細(xì)胞排列清晰，組織學(xué)結(jié)構(gòu)正常，未見增生，無明顯炎性細(xì)胞聚集和浸潤(rùn)；CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理HE染色可見滑膜細(xì)胞排列紊亂，毛細(xì)血管增生，滑膜增生明顯，滑膜下大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)論CIA大鼠血清中出現(xiàn)AKA陽性，與人類RA的血清免疫學(xué)類似，適用于RA的基礎(chǔ)研究。

關(guān)節(jié)炎,類風(fēng)濕；大鼠,Wistar；類風(fēng)濕因子；抗角蛋白抗體；抗環(huán)瓜氨酸肽抗體

羅德梅，李文紅，王倩，等.Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清抗角蛋白抗體和抗環(huán)瓜氨酸肽抗體及類風(fēng)濕因子的檢測(cè)分析[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(27)：3287-3290.[www.chinagp.net]

LUO D M,LI W H,WANG Q,et al.Detection analysis of serum anti-keratin antibody,anti-cyclic citrullinated peptide antibody and rheumatoid factor in rats with type Ⅱ collagen-induced arthritis[J].Chinese General Practice，2016，19(27)：3287-3290.

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性自身免疫性疾病(AID)，以關(guān)節(jié)滑膜、軟骨損害為主要表現(xiàn)，早期常表現(xiàn)為對(duì)稱性多關(guān)節(jié)腫痛，病情反復(fù)后逐漸進(jìn)展為關(guān)節(jié)畸形、關(guān)節(jié)功能喪失，從而嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。大量研究證實(shí)，在RA的發(fā)病過程中，多種細(xì)胞因子及炎性遞質(zhì)共同參與其中，包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、各種細(xì)胞因子及膠原酶等[2]；T淋巴細(xì)胞活化的同時(shí)又激活了B淋巴細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗角蛋白抗體(AKA)、抗環(huán)瓜氨酸肽 (Anti-CCP) 抗體、類風(fēng)濕因子(RF)等。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(typeⅡcollagen induced arthritis，CIA)模型大鼠血清中AKA、Anti-CCP抗體、RF-IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)，并分析其免疫特點(diǎn)和人類RA是否相似。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2014年11月—2015年3月，SPF級(jí)7～8周健康雌性Wistar大鼠15只，體質(zhì)量(180±20)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)期間由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)研究部進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1CIA大鼠模型的建立15只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取5只作為空白對(duì)照組，其余10只用于建立CIA模型(CIA造模組)。造模過程：參照文獻(xiàn)[3]方法，將牛Ⅱ型膠原(美國(guó)SIGMA公司)溶于提前預(yù)冷的0.1 mol/L的冰乙酸溶液中，最終濃度為 4 mg/ml，4 ℃過夜；將等體積的完全弗氏佐劑加入牛Ⅱ型膠原冰乙酸溶液中，在冰浴條件下使二者充分乳化；于大鼠左足跖肉墊及尾根部多點(diǎn)皮內(nèi)注射牛Ⅱ型膠原乳劑(0.2 ml/只)進(jìn)行初次免疫?？瞻讓?duì)照組5只大鼠則在大鼠左足跖肉墊及尾根部進(jìn)行多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液(0.2 ml/只)。初次免疫后第8天，使用上述乳劑于CIA造模組大鼠左足跖肉墊及尾根部再次加強(qiáng)免疫；空白對(duì)照組仍在大鼠左足跖肉墊及尾根部進(jìn)行多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液(0.2 ml/只)。每日用游標(biāo)卡尺記錄兩組大鼠左足踝關(guān)節(jié)腫脹情況。

自初次免疫后，每周參照關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)(AI)[3]對(duì)兩組大鼠進(jìn)行評(píng)分，直至第3周末。AI評(píng)分具體操作如下：依據(jù)大鼠關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)分為0～4分，0 分即無關(guān)節(jié)炎癥狀，1 分為單個(gè)爪或趾(指)紅腫，2 分為2個(gè)關(guān)節(jié)受累，3 分為2 個(gè)以上關(guān)節(jié)受累，4 分為爪和趾(指)均發(fā)生嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎。每只大鼠AI評(píng)分為4只包括趾(指)在內(nèi)的整個(gè)爪評(píng)分之和。初次免疫后第3周末，AI評(píng)分≥6分提示造模成功，可用于實(shí)驗(yàn)[3]。剔除未發(fā)病的2只大鼠，剩余8只大鼠AI評(píng)分均≥6分，造模成功(CIA模型組)?？瞻讓?duì)照組5只大鼠均未出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹表現(xiàn)。

1.2.2檢測(cè)指標(biāo)造模成功后，兩組大鼠均以10%水合氯醛溶液0.3 ml/100 g 腹腔麻醉，采集股動(dòng)脈血，常規(guī)分離血清。AKA(1∶10)的檢測(cè)采用間接免疫熒光(IIF)法，以大鼠食管中1/3冷凍切片為底物，以局限于角質(zhì)層板層狀、線狀熒光為陽性，AKA試劑盒購自德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司。Anti-CCP抗體和RF-IgM抗體的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法，Anti-CCP抗體試劑盒購自德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司，RF-IgM抗體試劑盒購自加拿大Hermes Criterion Biotechnology公司。均嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行操作。分離膝關(guān)節(jié)滑膜，用40 g/L多聚甲醛固定作為病理標(biāo)本，采用熒光顯微鏡(EUROStarⅡ，addcare2000全自動(dòng)酶免分析儀)觀察HE染色結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1AI評(píng)分結(jié)果CIA模型組初次免疫后第2周末部分大鼠出現(xiàn)左足踝及足跖關(guān)節(jié)腫脹，第3周末上述關(guān)節(jié)腫脹程度加重，足跖呈鼓槌樣，無法負(fù)重，AI評(píng)分均≥6分；空白對(duì)照組大鼠未出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹表現(xiàn)，AI評(píng)分均為0分(見圖1)。

注：CIA=Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎，AI=關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)

圖1兩組大鼠AI評(píng)分

Figure 1AI score of rat in two groups

2.2AKA、Anti-CCP抗體及RF-IgM抗體檢測(cè)結(jié)果CIA模型組大鼠AKA陽性5例，空白對(duì)照組均陰性(見圖2，本文圖2、3彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)?？瞻讓?duì)照組和CIA模型組大鼠血清Anti-CCP抗體、RF-IgM抗體均陰性?？瞻讓?duì)照組和CIA模型組血清Anti-CCP抗體和RF-IgM抗體水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

Table 1Comparsion of serum Anti-CCP and RF-IgM antibody of rats between two groups

組別只數(shù)Anti-CCP抗體RF-IgM抗體空白對(duì)照組51.07±0.011.11±0.24CIA模型組81.06±0.032.61±0.51t值0.118.44P值0.360.71

注：CIA=Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎，Anti-CCP=抗環(huán)瓜氨酸肽，RF=類風(fēng)濕因子

圖2　兩組大鼠血清AKA間接免疫熒光結(jié)果(×400)

Figure 2Indirect immunofluorescence results of serum AKA of rats in two groups

2.3關(guān)節(jié)滑膜病理結(jié)果空白對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理HE染色可見滑膜細(xì)胞排列清晰，組織學(xué)結(jié)構(gòu)正常，未見增生，無明顯炎性細(xì)胞聚集和浸潤(rùn)；CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理HE染色可見滑膜細(xì)胞排列紊亂，毛細(xì)血管增生，滑膜增生明顯，滑膜下大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖3)。

圖3　兩組大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理結(jié)果(HE染色，×200)

3　討論

RA是一種臨床常見的自身免疫性疾病，病因尚未闡明。其主要發(fā)病機(jī)制是由T細(xì)胞介導(dǎo)的異常免疫反應(yīng)，自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化后分泌細(xì)胞因子，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體，自身抗體的產(chǎn)生是自身免疫性疾病的特征性表現(xiàn)[4-5]。目前，研究RA疾病的動(dòng)物模型包括佐劑性關(guān)節(jié)炎模型(ajudvant arthritis，AA)和CIA。AA雖然在制作上方便簡(jiǎn)單，可廣泛應(yīng)用于多種動(dòng)物[6]，但其與RA有較大差異，病變具有自限性；CIA是由Ⅱ型膠原誘發(fā)的一種免疫性炎癥模型，已被公認(rèn)為是研究RA的經(jīng)典動(dòng)物模型。本研究對(duì)CIA模型組大鼠血清中AKA、Anti-CCP抗體和RF進(jìn)行分析，探討其與人類RA的血清免疫學(xué)是否類似。

3.1關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)和HE染色本研究中，空白對(duì)照組5只大鼠均未出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹表現(xiàn)；CIA模型組部分大鼠在初次免疫第 2周末出現(xiàn)后踝及足跖關(guān)節(jié)腫脹，第3周末上述關(guān)節(jié)腫脹程度加重，足跖呈鼓槌樣，無法負(fù)重，AI評(píng)分≥6分；病理HE染色顯示，空白對(duì)照組大鼠滑膜細(xì)胞排列清晰，組織學(xué)結(jié)構(gòu)正常，未見增生，無明顯炎性細(xì)胞的聚集和浸潤(rùn)，而CIA模型組關(guān)節(jié)滑膜增生明顯，滑膜細(xì)胞排列紊亂，毛細(xì)血管增生，滑膜下大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說明造模成功。

3.2AKA、Anti-CCP抗體、RF-IgM抗體AKA是一種能與大鼠食管角質(zhì)層反應(yīng)的IgG抗體，有文獻(xiàn)報(bào)道AKA對(duì)RA的診斷靈敏度較低，特異度較高[7]，被認(rèn)為是RA最特異的生物學(xué)指標(biāo)，并在RA早期甚至臨床癥狀出現(xiàn)前即可出現(xiàn)。本研究中，CIA模型組大鼠血清中AKA陽性率為5/8，空白對(duì)照組大鼠血清AKA均陰性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]。盡管RF是第一個(gè)公認(rèn)的RA免疫標(biāo)志物，對(duì)RA診斷的靈敏度為50%～90%，特異度為50%～95%，但Anti-CCP抗體的靈敏度、特異度在國(guó)內(nèi)外均被肯定優(yōu)于RF，其檢測(cè)在動(dòng)物模型中未見報(bào)道[8]。本研究CIA模型組大鼠血清中僅檢測(cè)到Anti-CCP抗體和RF-IgM抗體低水平表達(dá)，未檢測(cè)到Anti-CCP、RF-IgM抗體陽性。也有文獻(xiàn)報(bào)道CIA模型中腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性因子的滴度升高，未檢測(cè)到RF陽性[9]，本研究結(jié)果與其相似?？紤]原因可能為本研究中CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜雖有增生、滑膜細(xì)胞排列紊亂、滑膜下大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，但病變時(shí)間短，關(guān)節(jié)軟骨的破壞程度尚輕，與文獻(xiàn)報(bào)道的Anti-CCP抗體陽性者出現(xiàn)骨質(zhì)破壞較陰性者嚴(yán)重[10]相符；也可能與Anti-CCP抗體是判斷RA預(yù)后的免疫指標(biāo)有關(guān)。

綜上所述，CIA模型大鼠的免疫特點(diǎn)和人類RA較為相似，進(jìn)一步證實(shí)CIA模型大鼠適用于RA的基礎(chǔ)研究。但本研究納入樣本量較小，今后應(yīng)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)：羅德梅進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；李文紅進(jìn)行資料收集；王倩、杜文靜、孟巖、李慧君、閆怡、馮寧進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；馬秀敏、羅莉進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：趙躍翠)

Detection Analysis of Serum Anti-Keratin Antibody,Anti-Cyclic Citrullinated Peptide Antibody and Rheumatoid Factor in Rats with Type Ⅱ Collagen-induced Arthritis

LUODe-mei,LIWen-hong,WANGQian,DUWen-jing,MENGYan,LIHui-jun,YANYi,FENGNing,MAXiu-min,LUOLi.

TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,ChinaCorrespondingauthor:MAXiu-min,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;E-mail:maxiumin1210@163.comLUOLi,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;E-mail:luoli.6@163.com

ObjectiveTo detect serum anti-keratin antibody (AKA),anti-cyclic citrullinated peptide (Anti-CCP) antibody and rheumatoid factor (RF) in rats type Ⅱ collagen-induced arthritis (CIA),and to analyze whether they are similar with serum immunology of human rheumatoid arthritis (RA).MethodsAfter one-week adaptive feed,among 15 healthy female Wistar rats (SPF level) aged 7 to 8 weeks,5 were selected as blank control group by random number table method,and 10 for building type Ⅱ CIA model from November 2014 to March 2015,and finally 8 rats′ modeling was successfully built(CIA model group).After successful modeling,femoral artery blood of rats in CIA model group and blank control group was collected,and serum was routinely separated,serum AKA of rats in two groups and Anti-CCP antibody and RF-IgM antibody were detected by indirect immunofluorescence (IIF) method and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method respectively;40 g/L paraformaldehyde fixation was used as pathological specimens to isolate synovium of knee joint.The pathological specimens were conducted with HE staining.ResultsSerum AKA of 5 cases (5/8) were positive in CIA model group,all were negative in blank control group.There was no significant difference in levels of serum Anti-CCP antibody and RF-IgM antibody between rats in blank control group and CIA model group (P>0.05).Pathological HE staining observation of joint synovium of rats in blank control group presented clear arrangement of synovial cells,normal histology structure,no hyperplasia,no significant accumulation and infiltration of inflammatory cells;pathological HE staining observation of joint synovium of rats in CIA model group showed disordered arrangement of synovial cells,capillary proliferation,significant synovial hyperplasia,synovial infiltration of large amount of inflammatory cells.ConclusionSerum of CIA rats group in shows positive AKA,which is similar with serum immunology of human RA,and suits for basic research of RA.

Arthritis,rheumatoid；Rats,Wistar；Rheumatoid factor；Anti-keratin antibody；Anti-cyclic citrullinated peptide antibody

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014211C047)

830011新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(羅德梅，王倩，杜文靜，孟巖，馮寧，馬秀敏，羅莉)；頭屯河區(qū)中心醫(yī)院(李文紅)；新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(李慧君，閆怡)

馬秀敏，830011新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院；E-mail：maxiumin1210@163.com

羅莉，830011新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院；E-mail：luoli.6@163.com

R 593.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.27.006

2016-02-10；

2016-07-15)