傅品來范志勇張競之李　黎彭志允田　寧蘇碧瑩吳　栓

（1.廣東省中西醫(yī)結合醫(yī)院，廣東　佛山528200；2.廣東省中醫(yī)院，廣東　廣州510120；3.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣東　廣州510260）

·研究報告·

模擬手法壓力刺激對頸性眩暈血瘀證患者血清損傷后內皮細胞的影響*

傅品來1范志勇2△張競之3李黎2彭志允1田寧1蘇碧瑩1吳栓1

（1.廣東省中西醫(yī)結合醫(yī)院，廣東佛山528200；2.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州510120；3.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣東廣州510260）

目的觀察模擬手法壓力刺激對頸性眩暈血瘀證患者血清損傷的人臍靜脈內皮細胞的影響及機制。方法將培養(yǎng)的頸性眩暈血瘀證患者血清損傷的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC-C）分為血瘀證組（DMEM+10%患者血清+0mmHg）、低壓組（DMEM+10%患者血清+90mmHg）和高壓組（DMEM+10%患者血清+180mmHg），健康對照組（DMEM培養(yǎng)液細胞+10%健康人血清+0mmHg），于相應壓力干預實驗后，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學變化，MTT法檢測其活性，硝酸還原酶法檢測一氧化氮（NO）濃度，放射免疫分析技術測定內皮素（ET）。結果經(jīng)過低壓力刺激干預后細胞形態(tài)有一定變化，細胞活性有所提高，增加NO釋放、抑制細胞ET釋放，而高壓力刺激則無顯著影響。結論頸性眩暈血瘀證患者血清可以損傷血管內皮細胞，適當?shù)膲毫Υ碳つ茉鰪娂毎幕钚院途S持細胞的形態(tài)結構，壓力刺激調節(jié)血管內皮細胞血管舒縮活性物質ET、NO合成釋放，這可能是手法發(fā)揮活血化瘀功效的細胞生物學機制之一。

推拿手法壓力刺激頸性眩暈內皮細胞

【Abstract】Objective：To study the effect and mechanism of stress stimulation ofmanipulation on endothelial cellswith serum induced injury in patientswith blood stasis syndrome of cervical vertigo.M ethods：The cultivated HUVEC-C of injury induced by the serum of the patient of blood stasis syndrome（BSS）were divided into blood stasis syndrome group（DMEM+10%serum of the patient+0 mmHg），low pressure group（DMEM+10% serum of the patient+90 mmHg），high pressure group（DMEM+10%serum of the patient+180 mmHg）and healthy control group（DMEM cell of nutrient solution+10%healthy human serum+0mmHg）.After corresponding stress intervenes in the experiment，the change of its configuration was put upside down under themicroscope and observed，and its activity was tested by MTT assay，nitric reductase assay to measure NO concentration and radioimmunoassay（RIA）tomeasure ET.Results：After intervention of low stress stimulation，the cell configuration had some changes.Cell activity increased.It could increase NO release and inhibit release of ET.However，there was no obvious effectunder the high stress stimulation.Conclusion：The serum of the patientof blood stasis syndrome（BSS）can injure the vascular endothelial cell.Appropriate stress stimulation can increase the cell activity and maintain the cell configuration.Stress stimulation can regulate the synthetic release of ET and NO of vascular active substances in vascular endothelial cell，which may be one ofmechanisms of cell biology through technique effects of activating blood circulation to dissipate blood stasis.

【Key words】Manipulationmaneuver；Stress stimulation；Cervical vertigo；Endothelial cell

血管內皮細胞損傷在頸性眩暈及和血瘀證發(fā)病中起到重要作用，中醫(yī)推拿通過調控血管內皮功能治療頸性眩暈具有良好效果，推拿起效往往又通過手法操作時產生的活血化瘀效應。從目前研究看，推拿治療頸性眩暈產生活血化瘀效應的研究多著眼于頸部軟組織、骨關節(jié)等層面，如松解痙攣的頸部肌群、糾正錯縫

關節(jié)，增加椎動脈血流量等，這些研究畢竟屬于宏觀層面的研究，缺少細胞分子等微觀層面的探討，給臨床、教學、科研帶來了諸多不便，嚴重制約中醫(yī)推拿的發(fā)展。要想在細胞分子等微觀層面探討推拿活血化瘀效應的細胞力學機制，那么構建推拿對細胞的力學加載模型必不可少［1-2］。本課題利用頸性眩暈血瘀證患者血清損傷培養(yǎng)的正常臍靜脈內皮細胞建立血管內皮損傷模型，采用能屏蔽體內各種干擾因素的體外細胞生物學實驗為研究手段，實施壓力刺激模擬一維推拿力學手法，形成具有病證結合特點的推拿對損傷細胞的力學加載模型，觀察血管內皮細胞形態(tài)學變化及合成釋放血管舒縮活性物質內皮素（ET）和一氧化氮（NO）的變化，為手法機械力學刺激“活血化瘀”理論提供細胞生物力學方面的基礎?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1細胞來源及試劑人臍靜脈內皮細胞株（HUVEC-C）購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產品；南美胎牛血清為Gibco公司產品；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產品；NO試劑盒（南京建成生物工程研究所）；ET放免試劑盒（北京東亞免疫技術研究所），其他試劑如碳酸氫鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、葡萄糖均為國產分析純。1.2病例選擇收集2015年8月至2015年11月廣東省中西醫(yī)結合醫(yī)院康復科門診及住院確診，頸性眩暈血瘀證患者20例為患者組。頸性眩暈的診斷標準參照全國第2屆頸椎病專題座談會制定的診斷分型標準［3］及《中藥新藥臨床研究指導原則》［4］制定。1）發(fā)病常與頸部體位改變有關；2）頭痛，發(fā)作性或慢性頭痛，頭痛位于枕部；3）后頸部觸診檢查，患者棘突多有病理性移位，相應的關節(jié)囊部位腫脹、壓痛；4）仰頭或轉頭試驗陽性，作該試驗可誘發(fā)眩暈，惡心，耳鳴，視力減退，或卒倒；5）可伴發(fā)神經(jīng)根癥狀；6）X線平片可見正位片雙側鉤椎關節(jié)變尖，側方增生，棘突移位偏向一側；側位片生理曲度消失、變直，椎間隙狹窄，項韌帶鈣化；斜位片可見椎間孔變小，鉤椎關節(jié)骨質增生；7）經(jīng)顱多普勒超聲（TCD），一側或雙側椎-基底動脈血流速度降低，腦血流量相對減少（一部分為流速加快）。血瘀證診斷參照1986年修訂的診斷標準［5］。選擇2015年8月至2015年9月廣東省中西醫(yī)結合醫(yī)院招募健康志愿者20例為對照組。

1.3血清收集患者組及對照組均空腹取血，置入無菌帶帽不抗凝干燥試管，自凝后離心（4℃，2000 r/min，15min），取上清液置無菌EP管，凍存于-20℃，備用［6-7］。酶標儀680型為美國Bio-rad公司產品。倒置相差顯微鏡及攝影裝置為德國Leica公司等。

1.4細胞培養(yǎng)取人臍靜脈內皮細胞株人臍靜脈內皮細胞株（HUVEC-C），所有操作均采用對數(shù)生長期細胞。解凍復蘇后以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，以0.25%胰酶消化傳代。用于共聚焦顯微鏡觀察的細胞種于0.5×0.5 cm2的蓋玻片上，所有操作均采用對數(shù)生長期細胞。

1.5細胞損傷模型的建立及傳代培養(yǎng)靜態(tài)培養(yǎng)頸性眩暈血瘀證血管內皮細胞：參考相關文獻及預實驗［7-9］擬定。取頸性眩暈血瘀證患者血清（含體積分數(shù)為10%的CV患者血清培養(yǎng)液），干預人臍靜脈內皮細胞（取對數(shù)生長期），造成頸性眩暈血瘀證引起的血管內皮細胞損傷。傳代培養(yǎng)：倒置相差顯微鏡鏡下觀察和記錄細胞形態(tài)變化，細胞成鋪路石樣，單層生長、多形性、多梭形鑲嵌排列，每2～3日更換1次培養(yǎng)基，當細胞長滿瓶壁的80%以上時傳代。

1.6細胞加力前培養(yǎng)［10-11］取對數(shù)生長期細胞，棄培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶+0.1%EDTA混合消化液消化細胞，約3～5 min；當瓶底出現(xiàn)針孔樣透明時，用含10%小牛血清的DMEM終止消化細胞，調整細胞密度，按2×105/mL接種于6孔培養(yǎng)板；顯微鏡下見細胞完全貼壁生長后，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；棄含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，準確更換含5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液3mL，再培養(yǎng)24 h，使細胞同步化，備用。

1.7分組將實驗血管內皮細胞樣本隨機分組，1）健康組：9000μL DMEM+1000μL健康人血清+0 mmHg壓力刺激。2）血瘀組：9000μL DMEM+1000μL血瘀證患者血清+0mmHg壓力刺激。3）低壓力組：9000μL DMEM+1000μL血瘀證患者血清+90 mmHg壓力刺激。4）高壓力組：9000μL DMEM+1000μL血瘀證患者血清+180mmHg壓力刺激。比較力學刺激對血管內皮細胞生物學狀況的影響。

1.8細胞力學加載方法1）低壓力組及高壓力組：將壓力刺激組的血管內皮細胞置于壓力裝置中，然后移入37℃含5%CO2孵箱中，通過進氣閥向高壓鍋內持續(xù)供應氣體以調節(jié)壓力穩(wěn)定在預定的水平。維持壓力裝置內的壓力分別達到90 mmHg和180 mmHg，每組每次加壓時間都為2 h，兩次加力間隔24 h，共加力2次，加力完成后取出細胞培養(yǎng)板，觀察并提取細胞上清液或固定蓋玻片上培養(yǎng)細胞以備檢測。2）健康組及血瘀證組：將血管內皮細胞置于37℃含5%CO2孵箱中，不施加壓力刺激，于壓力組實驗開始同步培養(yǎng)，實驗結束后取出細胞培養(yǎng)板，提取細胞培養(yǎng)液以備檢測。1.9指標檢測1）細胞的形態(tài)觀察：HUVEC-C細胞經(jīng)過干預后于倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)。2）MTT法檢測細胞活性：將用不同條件培養(yǎng)基干預的每組8個復孔內皮細胞分別加入20μL MTT（5 mg/mL），孵育4 h，傾去上清液，每孔加二甲基亞砜（DMSO）150μL，振蕩10 min，使藍紫色結晶充分溶解，實驗結束后，在全自動酶標儀570 nm波長處測定各孔的OD值。3）對細胞內分泌功能的影響：細胞培養(yǎng)液中NO的測定采用硝酸還原酶法測定各組細胞培養(yǎng)上清液中NO含量，按試劑盒操作步驟進行；細胞培養(yǎng)液中ET的測定采用放射免疫分析技術檢測。各組取上清液500μL，用高速冷凍離心機制成干粉，然后稀釋成100μL的待測樣品進行實驗。按ET測定試劑盒所述的均相競爭法和非平衡法處理樣品，利用放射免疫γ計數(shù)器測定樣品中ET含量［12］。

1.10統(tǒng)計學處理應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗；與對照組的比較用單因素方差分析和組間q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1各組細胞形態(tài)比較倒置相差顯微鏡下觀察如圖1。1）健康組：細胞呈扁平狀、長梭形、多角形或橢圓形，鑲嵌狀緊密排列，細胞核居中稍微隆起，部分細胞輪廓亦不清。2）血瘀證組：細胞多呈多角形或橢圓形，部分甚至呈圓形，細胞間隙變寬，部分細胞輪廓不清，大多細胞胞漿中有暗色顆粒，細胞碎片較多。3）低壓力組：細胞呈長梭形、多角形或橢圓形，鑲嵌狀緊密排列，部分細胞胞漿中有暗色顆粒，部分細胞輪廓亦不清。4）高壓力組：多數(shù)細胞收縮變形，部分呈橢圓形，細胞碎片較多，部分細胞輪廓不清，細胞間隙變寬，大多細胞胞漿中有暗色顆粒。

圖1　倒置相差顯微鏡下觀察（200倍）

2.2MTT法檢測細胞活性見表1。血瘀證組與健康組比較，細胞活性差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），加不同壓力刺激干預后，低壓力組與血瘀證組相比，細胞活性差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），高壓力組和與血瘀證組相比，細胞活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。高低壓力組比較細胞活性差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表1　各組患者血清對細胞活性及內分泌功能影響比較（

表1　各組患者血清對細胞活性及內分泌功能影響比較（

與血瘀證組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與高壓力組比較，▲P＜0.01。

組別n OD值ET（pg/mL）NO（μmol/L）健康組8血瘀證組8低壓力組8 0.435±0.011△△0.226±0.013 0.332±0.036△△▲126.409±3.744△△71.276±8.693△△218.320±17.908 27.023±3.893 178.833±40.856△41.065±9.372△▲高壓力組8 0.252±0.039 204.380±32.822 27.466±3.733

2.3對細胞內分泌功能的影響見表1。1）血瘀證組與健康組比較，ET含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），加不同壓力刺激干預后，低壓力組與血瘀證組相比，ET含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），高壓力組與血瘀證組相比ET含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。高低壓力組比較ET含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。2）血瘀證組與健康組比較，NO含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），加不同壓力刺激干預后，低壓力組與血瘀證組相比，NO含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。高壓力組和與血瘀證組相比NO含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。高低壓力組比較NO含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

3　討　論

血瘀證見于臨床多科疾病，血管內皮損傷為其共同的病理基礎。因此臨床同樣要重視血管內皮功能損傷在頸性眩暈發(fā)病中的作用。目前中藥的活血化瘀效應已經(jīng)得到很好的研究共識，而推拿療法雖然療效確切，但許多機制尚未明確，而尤其是推拿活血化瘀效應還缺少微觀上的探討，因此本次研究以推拿對頸性眩暈血瘀證患者血清誘導的血管內皮細胞損傷模型作為研究的突破口，然后運用細胞生物力學技術模擬推拿力學刺激對損傷模型進行干預，因此有可能從微觀角度闡明推拿治療頸性眩暈的活血化瘀效應是由手法機械刺激改變血管內皮細胞功能的調節(jié)作用所致［13-15］。

本次研究從血管內皮細胞形態(tài)學變化、細胞活性、細胞內分泌功能分析了壓力刺激對頸性眩暈血瘀證患者血清誘導的血管內皮細胞損傷模型的機制。從細胞形態(tài)學看：頸性眩暈血瘀證患者的血管內皮損傷的程度明顯，和健康組、壓力刺激組有明顯區(qū)別；從細胞活性看：和健康組相比，頸性眩暈血瘀證患者血清可以降低血管內皮細胞的活性，而經(jīng)過低壓力刺激后細胞的OD值明顯提高，但是和健康組相比還是有較大差異，同時表明適當?shù)牧W干預能增強細胞的活性和維持細胞的形態(tài)結構；從細胞內分泌功能看：采用了最常用的血管舒縮因子ET及NO進行檢測，NO是最主要的血管舒張因子，而ET是迄今所知的最強力的血管收縮因子，ET和NO的平衡對維持正常的血管內皮功能起到至關重要的作用，本次實驗也表明低壓力刺激在一定程度增加NO釋放、而抑制細胞ET釋放，這些均表明一定的低壓力刺激對損傷的血管內皮細胞具有一定的修復作用。

當然推拿作為機械力刺激的一種，不僅僅表現(xiàn)為壓力刺激，手法在作用時往往還包括了牽張力、剪切力的多種形式，而且還存在不同力學動力學參數(shù)的組合，如力學刺激的力量、頻率、時間，不同的發(fā)力形式、不同手法力學參數(shù)的組合勢必對損傷的血管內皮細胞模型產生不同的影響結果，這些均值得我們作進一步探討。

［1］范志勇，查和萍，陳利國，等.病證結合思維對細胞推拿模型構建的啟示［J］.按摩與康復醫(yī)學雜志，2012，3（11）：69-70.

［2］范志勇，查和萍，陳利國，等.細胞推拿模型的構建及作用機制研究進展［J］.上海中醫(yī)藥大學學報，2011，34（5）：42-43.

［3］孫宇，陳琪福.第二屆頸椎病專題座談會紀要［J］.中華外科雜志，1993，31（8）：472-474．

［4］中華人民共和國衛(wèi)生部.中藥新藥臨床研究指導原則［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002：349．

［5］第二屆全國活血化瘀研究學術會議.血瘀證診斷標準［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，1987，7（3）：129.

［6］張競之，陳利國，賈會欣，等.高血壓病血瘀證患者血清對HUVEC-C形態(tài)、活性的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2011，38（2）：206-208.

［7］張競之，陳小憶，金偉孝，等.丹皮酚對高血壓病血瘀證患者血清損傷的HUVEC-C形態(tài)學、活性的影響［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2012，14（6）：29-31.

［8］陳利國，胡小勤.論病證結合血瘀證血管內皮細胞損傷模型的建立［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，2007，27（3）：267-269.

［9］彭志允，陳利國，范志勇，等.丹參酮ⅡA對血管內皮細胞損傷后vWF和TMmRNA的表達的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（3）：708-710.

［10］江瑜，陳波，李程，等.體外壓力刺激對血管內皮細胞ET-1、PGI2、IFN-β和TNF-α合成釋放影響的研究［J］.按摩與康復醫(yī)學，2015，6（18）：134-136.

［11］李程，江瑜，陳磊，等.動態(tài)力學刺激對血管內皮細胞血管舒縮活性物質ET-1和PGI-2合成釋放影響的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2014，1（1）：封2.

［12］李眺，陳利國，李權，等.川芎嗪配伍黃芪多糖對血管內皮細胞的保護作用［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（11）：2672-2674.

［13］范志勇，陳利國，張志堅，等.從細胞力學的角度探討手法力學刺激所致細胞應力效應［J］.中國康復，2013，28（3）：216-218.

［14］范志勇，吳山，林應強，等.基于微觀血瘀探討血管內皮細胞損傷在頸性眩暈中的發(fā)病機制［J］.成都中醫(yī)藥大學學報，2014，37（3）：124-126.

［15］陳波，江瑜，張小珊，等.機體非神經(jīng)組織力學敏感細胞的研究與針推治療作用機理的新思考［J］.貴陽中醫(yī)學院學報，2012，34（1）：9-12

Effect of Stress Stimulation of M anipulation on Endothelial Cells w ith Serum Induced Injury in Patients w ith Blood Stasis Syndrome of Cervical Vertigo

FU Pinlai，F(xiàn)AN Zhiyong，ZHANG Jingzhi，et al.Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Guangdong Provincial，Guangdong，F(xiàn)oshan 528200，China.

R255.3

A

1004-745X（2016）09-1656-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.004

2016-06-20）

國家自然科學基金項目（81373520）；廣東省自然科學基金（2015A030313345）；廣東省建設中醫(yī)藥強省科研立項（20141038）；廣東省佛山市科技局醫(yī)學類科技攻關項目（201308177）

（電子郵箱：fzystrong@163.com）