吳祖澤，郭瑩瑩，劉玉斌，郭彥梅，董俏言，靳繼德，姚 敏，于愛平

（1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100024；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

大腸桿菌表達(dá)的重組新蛭素的生產(chǎn)工藝

吳祖澤1，2，郭瑩瑩1，2，劉玉斌2，郭彥梅2，董俏言2，靳繼德2，姚 敏2，于愛平2

（1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100024；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

為建立可產(chǎn)業(yè)化的大腸桿菌表達(dá)的重組新蛭素（neorudin，EH）生產(chǎn)工藝，主要采取從低密度到高密度發(fā)酵的優(yōu)化思路，優(yōu)化了發(fā)酵罐培養(yǎng)基和誘導(dǎo)時(shí)間；比較了超聲破碎和反復(fù)凍融的目的蛋白提取方法；純化工藝采用離子交換層析2步法進(jìn)行:SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析和Source 15Q陰離子交換層析；所得產(chǎn)品用免疫印跡法鑒定，經(jīng)HPLC檢測純度，凝塊法檢測抗凝比活性；最后對純化產(chǎn)品進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，包括高分辨率質(zhì)譜、C-末端測序、N-末端測序、二硫鍵分析.結(jié)果顯示:優(yōu)化后的發(fā)酵工藝確定基于TB培養(yǎng)基的高密度發(fā)酵工藝，菌體OD600可達(dá)40左右，每升菌體濕質(zhì)量可達(dá)70 g左右，目的蛋白表達(dá)量約400 mg/L；菌體反復(fù)凍融離心上清經(jīng)過純化獲得的目的蛋白HPLC純度均大于97%，純化收率為26.12%，抗凝比活性為1 024 ATU/mg，用高分辨率質(zhì)譜檢測其分子質(zhì)量約為7 415.188 0 ku，N-末端、C-末端和二硫鍵均與理論相符.建立了EH在大腸桿菌中的高密度發(fā)酵和純化工藝.

新蛭素；大腸桿菌；高密度發(fā)酵；離子交換層析；抗凝活性

血栓性疾病是當(dāng)今社會(huì)最重要的致殘和致死性疾病之一，主要包括動(dòng)脈血栓及靜脈血栓等，血栓形成是其重要誘因，抗凝藥物是預(yù)防和治療該類疾病的重要手段.目前臨床上最常用的抗凝藥物主要有華法林和肝素類.這2類藥的作用機(jī)制復(fù)雜，且肝素類藥還有引起血小板減少的副作用［1-2］.水蛭素是凝血酶的特異抑制劑，水蛭素與凝血酶結(jié)合后，使凝血酶失去裂解纖維蛋白原為纖維蛋白的能力，阻止纖維蛋白的凝固，從而抑制血栓的形成［3］.但是，水蛭素在使用過程中也會(huì)出現(xiàn)一些出血副作用［4］，為了降低水蛭素的出血副作用，本實(shí)驗(yàn)室將可被凝血因子Xa（FXa）或XIa（FXIa）特異識別并切割的短肽:谷氨酸-脯氨酸-精氨酸（EPR）［5］連接至水蛭素的N-末端而構(gòu)成新蛭素（neorudin，EH），EPR封閉了水蛭素的抗凝活性，使EH只有在血栓局部才會(huì)被凝血因子Xa或XIa裂解，釋放其抗凝活性，達(dá)到靶向抗栓的作用，從而降低全身出血的風(fēng)險(xiǎn)［6-7］.

本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示:EH在多種血栓形成模型動(dòng)物體內(nèi)能發(fā)揮確切的抗栓作用，安全性評價(jià)結(jié)果顯示出其出血風(fēng)險(xiǎn)明顯低于水蛭素，具有良好的研發(fā)前景.但EH目前的生產(chǎn)工藝是在畢赤酵母中表達(dá)［8-9］，畢赤酵母發(fā)酵周期較長，生產(chǎn)效率相對偏低；本實(shí)驗(yàn)室后來采用大腸桿菌作為表達(dá)宿主菌，通過搖瓶內(nèi)表達(dá)條件的篩選，實(shí)現(xiàn)了EH在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)［10］.本研究在前期工作基礎(chǔ)上，著重研究EH在大腸桿菌重組工程菌的發(fā)酵，建立了分離純化工藝，并對純化產(chǎn)物進(jìn)行初步的結(jié)構(gòu)確證和質(zhì)量分析，以期能適應(yīng)EH將來的產(chǎn)業(yè)化.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器

40 L發(fā)酵罐（德國B.Braun Biotech International公司），AKTA-Purifier（美國GE公司），層析填料SPSepharose Fast Flow、Source 15Q（美國GE公司），高效液相色譜儀（美國 Aglient），C18色譜柱（中國TechMate，4.6 mm.I.D.×250 mm，5 μm，12 nm），電泳儀（美國BIO-RAD公司），紫外分光光度計(jì)（美國Thermo公司）.

1.1.2試劑

酵母提取物、蛋白胨（OXOID公司），IPTG （Merck公司），小鼠抗水蛭素單抗（Abcam公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠二抗（Santa Cruz公司），人凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品和牛纖維蛋白原（中國食品藥品檢定研究院），牛凝血因子Xa（BioLabs公司），鱟試劑（廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司），乙腈、甲醇（均為HPLC級，F(xiàn)isher Scientific公司），其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品.

1.1.3菌種

重組工程菌BL21（DE3）-pET-24-eh由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，并保存于-80℃冰箱.

1.1.4培養(yǎng)基

1）搖瓶種子培養(yǎng)基（LB）:蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L.

2）發(fā)酵罐培養(yǎng)基（LB）:KH2PO43 g/L，K2HPO46 g/L，（NH4）2SO42 g/L，酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，25%葡萄糖24 mL/L，1 mol/L MgSO44 mL/ L，1 mol/L CaCl20.1 mL/L.

3）LB培養(yǎng)基發(fā)酵的流加液:蛋白胨200 g/L，酵母提取物100 g/L，葡萄糖500 g/L，MgSO492 g/L.

4）發(fā)酵罐培養(yǎng)基（TB）:KH2PO43 g/L，（NH4）2SO45 g/L，酵母提取物20 g/L，蛋白胨10 g/L，甘油20 mL/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，無水CaCl20.02 g/ L，NH4Cl 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，Na2HPO4·12H2O 6 g/L.

5）TB培養(yǎng)基發(fā)酵的流加液:蛋白胨50 g/L，酵母提取物50 g/L，甘油120 mL/L，MgSO4·7H2O 1 g/L.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1一級種子和二級種子培養(yǎng)

分別取凍存菌種0.5 mL接種到2個(gè)各裝有50 mL LB培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，并各加入0.1 mL硫酸卡那霉素（100 mg/mL），37℃，230 r/min培養(yǎng)約12 h，至OD600約為1～2，此為一級種子.將一級種子按0.1%的比例加入2 L LB培養(yǎng)基中，均勻分裝在8個(gè)1 L三角瓶中，37℃，230 r/min培養(yǎng)約10 h，至OD600約為2～4，此為二級種子.

1.2.2基于LB培養(yǎng)基的低密度發(fā)酵

將二級種子液加入到含有19 L LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，起始培養(yǎng)條件為:37℃培養(yǎng)，200 r/min，通氣量為2 L/min，發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通氣量來維持罐內(nèi)溶氧值在30%～40%，每隔1 h取樣測定OD600，培養(yǎng)至約4 h時(shí)開始誘導(dǎo)，IPTG（1 mol/L）終濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h.

1.2.3基于LB培養(yǎng)基的高密度發(fā)酵

起始培養(yǎng)條件同低密度發(fā)酵，培養(yǎng)過程中，通過控制轉(zhuǎn)速、通氣量來維持罐內(nèi)溶氧在30%～40%，轉(zhuǎn)速最高控制在550 r/min，通氣量最高控制在15 L/min，培養(yǎng)至約11 h，開始流加LB培養(yǎng)基發(fā)酵的流加液，流加速度通過溶氧（溶氧保持在30% ～40%）來反饋控制，待培養(yǎng)約12 h時(shí)開始誘導(dǎo)，火焰封口法加入20 mL IPTG（1 mol/L），至終濃度約為1 mmol/L，待菌體OD600不再上升或下降時(shí)下罐，發(fā)酵過程中用50%的氨水控制pH.

1.2.4基于TB培養(yǎng)基的高密度發(fā)酵

起始培養(yǎng)條件同低密度發(fā)酵，培養(yǎng)至約5 h時(shí)，罐內(nèi)培養(yǎng)基營養(yǎng)耗盡，開始流加 TB培養(yǎng)基發(fā)酵的流加液，培養(yǎng)至約6 h時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，其余過程同1.2.3（基于LB培養(yǎng)基的高密度發(fā)酵）中方法.

在高密度培養(yǎng)的基礎(chǔ)上考察誘導(dǎo)時(shí)間對于目的蛋白表達(dá)量的影響，誘導(dǎo)時(shí)間分別為4、5、6、7、8 h. 1.2.5 細(xì)菌破碎

破碎細(xì)菌有2種方法:1）超聲法.將發(fā)酵過程中取樣所得1 mL發(fā)酵液離心，獲得菌體加入0.5 mL 50 mmol/L Gly-HCl的緩沖液（pH3.0），置于冰浴中，超聲處理程序?yàn)?25℃，功率為450 W，超聲3 s，停7 s，時(shí)間為0.5 h.超聲后離心，獲得沉淀和上清.2）反復(fù)凍融法.下罐發(fā)酵液在4℃，4 300 r/min的條件下離心20 min，收集菌體，取菌體與50 mmol/L Gly-HCl的緩沖液（pH3.0）以1∶2的體積比攪拌均勻，用-20℃和室溫條件下反復(fù)凍融的方法破碎細(xì)菌，先經(jīng)4 300 r/min離心40 min，再經(jīng)1×104r/min高速離心30 min，收集上清，-20℃保存?zhèn)溆?

1.2.6離子交換層析

所有操作均在4℃條件下進(jìn)行，緩沖液A:50 mmol/L Gly-HCl（pH3.0），緩沖液 B:A+1 mol/L NaCl；凍融所得上清以8 mL/min上預(yù)先用緩沖液A平衡好的 SP Sepharose Fast Flow陽離子交換柱（5 cm×12 cm），上樣結(jié)束后，以12 mL/min流速進(jìn)行洗脫，洗脫程序設(shè)為:緩沖液A洗2個(gè)柱體積（CV）→ 0～10%B 1CV→ 10% ～35%B 6CV→35%～100%B 3CV.檢測波長為280 nm.收集各洗脫峰，SDS-PAGE和Lowry法檢測目的蛋白峰及其蛋白濃度，保存于-20℃?zhèn)溆?

準(zhǔn)備Source 15Q陰離子交換層析所用緩沖液，緩沖液A:20 mmol/L的L-His（pH6.0），緩沖液B:A+ 1 mol/L NaCl；將陽離子交換層析收集得到的EH洗脫峰用緩沖液A稀釋5倍，然后將稀釋的樣品以8 mL/min流速上預(yù)先用緩沖液A平衡過的 Source 15Q陰離子交換柱（5 cm×9.5 cm），上樣結(jié)束后，以10 mL/min流速進(jìn)行洗脫，洗脫程序設(shè)置為:緩沖液A 2CV→0～15%B 1CV→15%～25%B 5CV→25%～100%B2CV.檢測波長為280 nm.收集各洗脫峰后測其蛋白含量和抗凝活性，將目的峰收到無熱源的容器中，凍于-20℃冰箱中.

1.2.7抗凝活性測定

將純化后樣品加生理鹽水稀釋成1 mg/mL，取稀釋后的EH供試品溶液30 μL，加入1 μL的牛源凝血因子Xa輕混勻，37℃水浴6 h，取裂解后樣品用去離子水做2倍倍比稀釋.依次取不同稀釋度的樣品各10 μL至Epprndorf管中；各加入8 IU/mL的凝血酶20 μL，輕混勻后分別再加入5 mg/mL的纖維蛋白原20 μL，輕彈混勻，加第一個(gè)樣后開始計(jì)時(shí)；室溫靜置15 min，觀察凝塊形成情況.以同體積去離子水代替裂解的EH溶液和凝血酶溶液，其他條件不變作為空白對照；以同體積去離子水代替裂解的EH溶液，其他條件不變作陽性對照；以未經(jīng)裂解的EH樣品其他條件不變作為裂解前對照.抗凝比活性計(jì)算公式為:抗凝比活性=無凝塊出現(xiàn)的最大稀釋倍數(shù)×16 ATU/mg.

1.2.8SDS-PAGE

16.5%的分離膠，5%的濃縮膠，上樣量20 μL，恒壓70 V條件下開始電泳，進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至130 V，電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍(lán)染色.

1.2.9高效液相色譜（HPLC）

采用TechMate C18色譜柱，流動(dòng)相A:H2O+ 0.1%三氟乙酸，流動(dòng)相B:乙腈+0.1%三氟乙酸，洗脫梯度為:在0～40 min時(shí)B相由5%增加至95%，洗脫速度為1 mL/min.檢測波長為214 nm.

1.2.10免疫印記法

SDS-PAGE電泳結(jié)束后，使用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，恒壓15 V，轉(zhuǎn)移20 min，轉(zhuǎn)移完成后，將PVDF膜放入封閉液（10%脫脂奶粉的TBST）中，室溫?fù)u床封閉2 h；封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含鼠水蛭素抗體（1∶1 000）的封閉液中，室溫?fù)u床孵育2 h，用TBST洗滌6次，每次5 min；取出PVDF膜，放入含羊抗鼠抗體（1∶5 000）的封閉液中，室溫?fù)u床孵育1 h，用TBST洗滌6次，每次5 min；ECL顯色.

蛋白含量采用Lowry法測定，按照《中國藥典》2010版三部進(jìn)行［11］.

1.2.12鱟試劑檢測細(xì)菌內(nèi)毒素

采用凝膠法檢測純化所得的目的蛋白內(nèi)毒素含量，具體參照《中國藥典》2010年版三部［11］.

1.2.13結(jié)構(gòu)確證

取純度＞95%的EH樣品，進(jìn)行精確質(zhì)譜、C-末端、N-末端以及二硫鍵分析:

1）用TripeTOFTM5600+質(zhì)譜儀（AB SCIEX）進(jìn)行質(zhì)譜分析；分析時(shí)長:35 min，檢測方式:正離子，母離子掃描范圍:350～4 000 m/s.

2）用Trypsin酶解樣品，酶解后的肽段通過高效液相色譜進(jìn)行分離，再通過TripleTOF 5600+進(jìn)行測試.經(jīng)過LCMSMS分析后，得到MS2圖譜，與理論C端序列進(jìn)行比對.

倒裝是將語句中的主語、謂語、賓語、狀語等顛倒順序的一種語法現(xiàn)象，常常具有強(qiáng)調(diào)語氣。常見的英語中的倒裝有全部倒裝和部分倒裝。作者在本文中都有使用,請看下列例句.

3）采用Edman降解法處理樣品，依次生成各種PTH-AA，經(jīng)液相系統(tǒng)色譜柱分離確定被測蛋白質(zhì)供試品N端的氨基酸排列順序.

4）樣品用TripleTOFTM5600+質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測掃描質(zhì)譜分析.先計(jì)算二硫鍵所在肽段在還原前后的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，再由人工匹配驗(yàn)證肽段二級質(zhì)譜，最后確定二硫鍵的連接方式.

以上分析由上海中科新生命蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析中心完成.

2　結(jié)果

2.1工程菌的發(fā)酵

2.1.1基于LB培養(yǎng)基的低密度發(fā)酵

該條件下，菌體生長曲線如圖1所示，下罐時(shí)OD600為7.2，離心得菌體濕質(zhì)量為324 g，從電泳圖（圖2）中可以看出，工程菌在超聲后目的蛋白集中在上清中，而菌體中幾乎沒有目的蛋白.

2.1.2基于LB培養(yǎng)基的高密度發(fā)酵

LB培養(yǎng)基條件下的高密度發(fā)酵生長曲線如圖3（a）所示，培養(yǎng)至約11 h時(shí)開始流加LB培養(yǎng)基發(fā)酵的流加液，總培養(yǎng)時(shí)間為20.5 h，下罐時(shí)，菌體OD600為22.8，離心得菌體濕質(zhì)量為848 g.菌體通過超聲獲得目的蛋白的電泳結(jié)果見圖3（b）.

2.1.3基于TB培養(yǎng)基的高密度發(fā)酵

圖4為TB培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體高密度發(fā)酵生長曲線，培養(yǎng)至約5 h時(shí)開始流加TB培養(yǎng)基發(fā)酵的流加液，直至下罐，下罐時(shí)OD600為42，離心得到菌體濕質(zhì)量為1 319 g.顯區(qū)別，因此為節(jié)約時(shí)間，確定誘導(dǎo)時(shí)間為4 h.

圖5為反復(fù)凍融法獲得目的蛋白的電泳結(jié)果，誘導(dǎo)時(shí)間為4、5、6、7、8 h的目的蛋白表達(dá)量并無明

搖瓶種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，罐內(nèi)培養(yǎng)基為TB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h，按上述生產(chǎn)條件重復(fù)3批，發(fā)酵液的OD600、菌體濕質(zhì)量以及目的蛋白的表達(dá)量基本穩(wěn)定，具體見表1.

表1　3批工程菌發(fā)酵結(jié)果Table 1 Expression of EH protein after fermentation

2.2分離純化

高速離心后，菌體反復(fù)凍融上清上陽離子交換層析，目的峰為峰3，從電泳圖中可以看出，具體結(jié)果見圖6.收集到的目的蛋白峰再上陰離子交換層析，目的峰為峰2，具體結(jié)果如圖7所示.

經(jīng)過2步離子交換層析獲得目的蛋白69.6 mg，整個(gè)純化過程目的蛋白回收率見表2.

2.3HPLC檢測純度

將純化所得樣品經(jīng)高效液相色譜（見圖8）分析，按面積歸一化法計(jì)算，EH純度為97.84%.

2.4免疫印跡法

2步純化后得到的EH蛋白純品，其免疫印跡法結(jié)果見圖9.

2.5凝塊法檢測蛋白抗凝比活性

純化所得EH樣品，經(jīng)過抗凝活性檢測，裂解后的EH稀釋至128倍時(shí)出現(xiàn)凝塊，沒有裂解的EH不具備抗凝活性，結(jié)果見表3.計(jì)算EH的抗凝比活性為1 024 ATU/mg.

表2　EH的純化數(shù)據(jù)Table 2 Purification parameters of EH

2.6結(jié)構(gòu)確證

1）高分辨質(zhì)譜法測定EH分子質(zhì)量為7415.1880ku，與理論值7 415.271 5 ku相近.

2）C-末端測定序列為 Phe-Glu-Ser-His-Asn-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln，與EH理論序列一致.

3）N-末端測定序列為Met-Glu-Pro-Arg-Ile-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn，與理論序列一致.

4）二硫鍵分析顯示有6個(gè)半胱氨酸，3對二硫鍵，連接方式為:Cys9-Cys17、Cys19-Cys31、Cys25-Cys42，與理論序列一致.

表3　EH的抗凝比活性Table 3 Specific anti-coagulation activity of EH protein

2.7鱟試劑檢測目的蛋白的細(xì)菌內(nèi)毒素

純化所得的EH樣品經(jīng)鱟試劑檢測，內(nèi)毒素含量小于0.5 EU/mg.

3　討論

大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主，遺傳背景清楚，培養(yǎng)條件簡單，發(fā)酵周期短，目前大腸桿菌是應(yīng)用最廣泛、最成功的表達(dá)體系之一，常作高效表達(dá)的首選體系［12］.

本實(shí)驗(yàn)室首次將采用大腸桿菌作為EH的表達(dá)載體，發(fā)酵工藝從低密度發(fā)酵優(yōu)化到高密度發(fā)酵，提高了發(fā)酵菌體的密度和EH的產(chǎn)量.低密度發(fā)酵證明了EH在大腸桿菌重組工程菌中實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)，避免了大腸桿菌表達(dá)常見的包涵體問題，從而在獲取蛋白方面免去了變性復(fù)性等復(fù)雜的工藝.高密度發(fā)酵實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵條件的優(yōu)化，即從LB培養(yǎng)基到TB培養(yǎng)基的優(yōu)化，在用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)工程菌時(shí)，生長速率緩慢且出現(xiàn)了溶菌現(xiàn)象，分析原因可能是因?yàn)長B培養(yǎng)基以葡萄糖為碳源，產(chǎn)生的乙酸會(huì)抑制工程菌的生長，不利于高密度發(fā)酵.而TB培養(yǎng)基以甘油為碳源，有文獻(xiàn)報(bào)道［13］，以甘油為碳源可以降低乙酸的產(chǎn)生，而在發(fā)酵過程中，使用TB培養(yǎng)基確實(shí)降低了溶菌的現(xiàn)象.生長效率方面，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)間一般約20 h，菌體OD600在20左右，而TB培養(yǎng)基培養(yǎng)工程菌時(shí)間約11 h，菌體OD600在40左右，生產(chǎn)效率提高了近一倍，更適于高密度發(fā)酵.在TB培養(yǎng)基高密度發(fā)酵的基礎(chǔ)上對其誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，并確定誘導(dǎo)時(shí)間為4 h，從而節(jié)約了大量的人力物力.

分離純化方面，由于EH在大腸桿菌中呈現(xiàn)可溶性表達(dá)，相比較超聲破碎法，反復(fù)凍融法可以避免許多雜蛋白的干擾，因此在生產(chǎn)過程中，選擇反復(fù)凍融法來獲取目的蛋白；當(dāng)EH在畢赤酵母中表達(dá)時(shí)，因畢赤酵母是分泌型表達(dá)，目的蛋白是分布在上清中，上清要經(jīng)過2步超濾濃縮，才能上層析柱，而反復(fù)凍融出來的樣品，僅需要2步離心，從而節(jié)約了儀器設(shè)備，簡化了實(shí)驗(yàn)過程.分離過程中，陽離子交換層析線性洗脫方式，洗脫速度快，分離效果較好，再經(jīng)過緩沖液稀釋上Source15Q陰離子交換層析，得到的目的蛋白經(jīng)測定，純度達(dá)到97%以上，收率為72.53%.

純化獲得的樣品采用凝塊法檢測其抗凝活性，以確定所得EH在正常情況下不具備抗凝活性，只有在被FXa裂解后才會(huì)發(fā)揮其抗凝作用；同時(shí)用鱟試劑檢測其細(xì)菌內(nèi)毒素，檢測結(jié)果小于0.5 EU/mg；在此基礎(chǔ)上對EH純品進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，包括高分辨質(zhì)譜、C-末端、N-末端測序以及二硫鍵的分析，結(jié)果顯示EH的分子量及結(jié)構(gòu)與理論序列一致.

4　結(jié)論

綜上所述，本研究建立的生產(chǎn)工藝可以獲得結(jié)構(gòu)、純度和活性合格的EH產(chǎn)品，且能節(jié)省儀器設(shè)備、原材料等成本，減少了中間環(huán)節(jié)，重復(fù)性良好，易于放大，適合于大規(guī)模生產(chǎn)EH.

［1］ORTEL T L.Heparin-induced thrombocytopenia:when a low platelet count is a mandate for anticoagulation［J］. Hematology，2009:225-232.

［2］HOOK K M，ABRAMS C S.Treatment options in heparininducedthrombocytopenia［J］.CurrentOpinionin Hematology，2010，17:424-431.

［3］鄭巧燕.水蛭素及重組水蛭素的研究概況［J］.海峽藥學(xué)，2013，25（8）:108-110. ZHENG QY.Theresearchstatusofhirudinand recombine-hirudin［J］.Strait Pharmaceutical Journal，2013，25（8）:108-110.（in Chinese）

［4］GREUBACGERA，WARKENTINTE.Thedirect thrombin inhibitor hirudin［J］.Thromb Haemost，2008，99（5）:819-829.

［5］SAPORITO-IRWINSM，VANNOSTRANDWE. Coagulation factor XIa cleaves the RHDS sequence and abolishes the cell adhesive properties of the amyloid-protein ［J］.J Bio Chem，1995，270（44）:26265-26269.

［6］秦曉永，于愛平，王文文，等.抗凝蛋白EH體外活性檢測條件的建立［J］.中國生物工程雜志，2011，31 （5）:108-112. QIN X Y，YU A P，WANG W W，et al.The antithrombin activity detection of EH in vitro［J］.China Biotechnology，2011，31（5）:108-112.（in Chinese）

［7］王文文，徐向偉，趙專友，等.谷氨酸-脯氨酸-精氨酸-水蛭素抑制血栓形成的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2013，48（2）:31-35. WANG W W，XU X W，ZHAO Z Y，et al.Anti-thrombus activity of a novel anti-thrombus protein EPR-Hirudin［J］. China Academic Journal，2013，48（2）:31-35.（in Chinese）

［8］秦曉永.低出血抗凝新藥EH的發(fā)酵、純化及質(zhì)量檢測［D］.保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011. QIN X Y.Fermentation，purification and quality control study ofanti-thrombinproteinEH［D］.Baoding: Agricultural University of Hebei，2011.（in Chinese）

［9］郝木強(qiáng)，李彥英，劉春杰，等.重組低出血抗凝蛋白在畢赤酵母中的中試發(fā)酵工藝研究及其純化與鑒定［J］.生物技術(shù)通訊，2013，24（3）:314-319. HAO M Q，LI Y Y，LIU C J，et al.Pilot-scale fermentation study of a low bleeding anticoagulant protein in pichia pastoris［J］.Letters In Biotechnology，2013，24 （3）:314-319.（in Chinese）

［10］張超，鞏蔚，郭瑩瑩，等.重組抗凝蛋白-新蛭素的原核表達(dá)研究［J］.中國生物工程雜志，2014，34（12）: 69-77. ZHANG C，GONG W，GUO Y Y，et al.The prokaryotic expression of an anti-coagulant protein of EH［J］.China Biotechnology，2014，34（12）:69-77.（in Chinese）

［11］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（三部）［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010. Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of The People's Republic of China（3 volumes）［S］. Beijing:ChinaMedicalSciencePress，2010.（in Chinese）

［12］YIN G，SUSAN S W，BANDARU V.A novel bicistronic vectorforoverexpressingMycobacteriumtuberculosis proteins in Escherichia coli［J］.Protein Expression and Puriflcation，2009，65（2）:230-237.

［13］劉兆巍，薛亞平，鄭裕國.重組大腸桿菌發(fā)酵過程中乙酸的控制［J］.發(fā)酵科技通訊，2014，43（2）:21-26. LIU Z W，XUE Y P，ZHENG Y G.Controling acetic acid in recombinant Escherichia coli fermentations［J］. Bulletin of Fermentation Science and Technology，2014，43（2）:21-26.（in Chinese）

（責(zé)任編輯 張 蕾）

Production Technology of Recombinant Neorudin Expressed in E.coli

WU Zuze1，2，GUO Yingying1，2，LIU Yubin2，GUO Yanmei2，DONG Qiaoyan2，JIN Jide2，YAO Min2，YU Aiping2
（1.College of Life Science and Bioengineering，Beijing University of Technology，Beijing 100024，China；
2.Department of Experimental Hematology，Beijing Institute of Radiation Medicine，Beijing 100850，China）

To establish an industrial method of recombinant neorudin（EH）expressed in Escherichia coli，low density fermentation and high density fermentation were performed in this study，and in the high density fermentation，the fermentation culture medium and the induction time were investigated. Sonication and repeated freezing and thawing method were carried out to evaluate the release of EH from E.coli.SP Sepharose Fast Flow cation exchange chromatography and Source 15Q antion exchange chromatography were chosen to purify EH.The purified protein was identified by Western blot，its purity was analyzed by HPLC，and the special anticoagulant activity was detected by a clot method.Finally the purified protein was confirmed with the high resolution mass spectrum，C-terminal amino acid sequence analysis，N-terminal amino acid sequence analysis and disulfide bond analysis.The result shows that the high density fermentation based on TB culture medium is established.OD600was about 40 after fermentation，the wet weight of cell was about 70 g/L，and the expression level of EH was about 400 mg/ L.Compared with sonication，repeated freezing and thawing method ensured EH release with lessirrelevant proteins.After a two-step ion-exchange chromatography，the purity of EH analyzed by HPLC was 97.84%.The special anticoagulant activity of EH protein was about 1 024 ATU/mg after incubation with bovine coagulation factor Xa.Furthermore，the molecular weight of EH was determined to be 7 415.188 0 ku by high resolution mass spectrum.The results of C-terminal amino acid sequence analysis，N-terminal amino acid sequence analysis and disulfide bond analysis show that the EH protein produced with the production methods is right.A fermentation and purification method of EH expressed in E.Coli is developed.

neorudin；Escherichia coli；high density fermentation；ion-exchange chromatography；anticoagulant activity

Q 819

A

0254-0037（2016）02-0302-07

10.11936/bjutxb2015040011

2015-04-06

國家科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2012ZX09102301-008）

吳祖澤（1935—），男，研究員，主要從事實(shí)驗(yàn)血液學(xué)方面的研究，E-mai:wuct@nic.bmi.am.cn

于愛平（1972—），女，副研究員，主要從事實(shí)驗(yàn)血液學(xué)方面的研究，E-mai:yuap117@163.com