郝建宏，胡憶玲，林愛清

慢性乙型肝炎患者HBV基因耐藥突變分析

郝建宏，胡憶玲，林愛清

目的探討慢性乙型肝炎患者HBV基因耐藥突變情況。方法收集2010年12月至2014年12月我院感染病科診治的慢性乙型肝炎患者60例，均為使用拉米夫定或阿德福韋酯后出現(xiàn)病毒學(xué)突變的患者，采用熒光定量PCR法檢測HBV DNA，采用ELISA法檢測HBeAg和HBeAb定量，對血清HBV DNA直接進(jìn)行基因測序。結(jié)果在60例患者，發(fā)現(xiàn)rtl 180M陽性17%，rtm 204V陽性20%，rtn 236T陽性12%，rtA 181V/T陽性10%；rtl 180M陽性和rtm 204V陽性患者HBV DNA拷貝數(shù)較高，rtn 236T陽性患者較rtn 236T陰性患者ALT和HBV DNA拷貝數(shù)較低；rtA 181V/T陽性患者較rtA 181V/T陰性患者ALT水平高。結(jié)論rtl 180M、rtm 204V、rtn 236T和rtA 181V/T變異多見于年齡大、病程長的患者，HBV DNA拷貝數(shù)升高先于ALT升高者，預(yù)后較差，其中rtl 180M和rtm 204V變異患者病情容易復(fù)發(fā)。

慢性乙型肝炎；HBV DNA；基因變異

Hepatitis B；HBV DNA；Gene mutation

我國乙型肝炎流行率約為7.18%。據(jù)統(tǒng)計，全球慢性HBV感染者約2.4億，我國約占40%［1，2］。乙型肝炎的特點(diǎn)為起病隱

匿，以亞臨床及慢性感染較常見，是導(dǎo)致肝硬化和肝癌的最主要因素。核苷（酸）類似物可有效抑制乙型肝炎病毒復(fù)制，降低肝硬化和肝癌的發(fā)生率。長期服藥可導(dǎo)致乙型肝炎病毒出現(xiàn)YMDD區(qū)段變異，進(jìn)而使HBV對拉米夫定產(chǎn)生耐藥，使患者體內(nèi)病毒復(fù)制反彈。對HBV復(fù)制的判斷最可靠和精確的方法是從患者體內(nèi)檢出HBV DNA，再對DNA測序來確定病毒變異。本文探討了HBV DNA基因位點(diǎn)變異特點(diǎn)及其影響因素，以期為臨床診斷、治療和判斷預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。

1　資料與方法

1.1研究對象回顧性分析我科2010年12月至2014年

12月住院的慢性乙型肝炎患者60例，均為使用拉米夫定或阿德福韋酯后出現(xiàn)病情反復(fù)的患者，臨床診斷符合2010年發(fā)布的《慢性乙型肝炎防治指南》的標(biāo)準(zhǔn)［3］。排除藥物性肝損傷、酒精性肝炎、中毒性肝炎及其他疾病所致的肝功能異常。

1.2實驗室指標(biāo)使用OLYMPUS AU5400全自動生化分析儀檢測血生化指標(biāo)（試劑由上海德賽有限公司提供）；采用熒光定量PCR法檢測HBV DNA（DA7600，試劑由中山達(dá)安有限公司提供）；采用ELISA法檢測HBeAg和HBeAb定量（SYM-BIO熒光免疫分析儀，試劑由蘇州新波生物技術(shù)有限公司提供）。

1.3血清HBV DNA基因測序患者血清保存于-80℃冰箱，定期加干冰送往北京地壇醫(yī)院肝病研究所。使用德國Roche MagNA Pure LC全自動核酸提取、加樣系統(tǒng)，獲得HBV DNA模板后，使用美國PE9600擴(kuò)增儀擴(kuò)增，用Promega公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，純化產(chǎn)物經(jīng)Beckman測序試劑盒進(jìn)行測序。使用美國Beckman Coulter CEQ8000 Genetic Analysis System檢測，獲得HBV DNA序列和圖譜。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理所有統(tǒng)計分析均應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包處理，計量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般資料在慢性乙型肝炎患者60例中，男41例，女19例，年齡25～75歲，平均年齡（53.13±10.71）歲，平均病程（57.37±74.32）個月。發(fā)現(xiàn)rtl 180M陽性17%，rtm 204V陽性20%，rtn 236T陽性12%，rtA 181V/T陽性10%。60例患者均服用阿德福韋酯【葛蘭素史克（天津）有限公司】10 mg，1次/d或拉米夫定片【葛蘭素史克制藥（蘇州）有限公司】100mg，1次/d，時間為6～12個月。

2.2不同HBV基因變異患者肝功能和病毒載量的比較rtl 180M陽性和rtm 204V陽性患者血清HBV DNA拷貝數(shù)較高，rtn 236T陽性患者較rtn 236T陰性患者ALT水平和HBV DNA拷貝數(shù)較低，rtA 181V/T陽性患者較rtA 181V/T陰性患者ALT水平高（表1）。

2.3HBbeAg陽性與陰性患者HBV基因變異情況比較rtl 180M陽性和rtm 204V陽性患者HbeAg陰轉(zhuǎn)率低（表2）。

表1　不同HBV基因變異患者肝功能和病毒載量（±s）的比較

表1　不同HBV基因變異患者肝功能和病毒載量（±s）的比較

與其陰性組比，①P＜0.05

基因位點(diǎn)例數(shù)AST（U/L）GGT（U/L）ALT（U/L）HBV DNA（lg cp/ml）rtl 180M陽性1043.32±11.8738.83±10.1960.54±13.655.43±2.53①rtl 180M陰性5040.34±9.4735.29±9.1834.53±6.434.65±2.69 rtm 204V陽性1241.34±9.2242.18±9.1055.34±13.586.48±1.48 rtm 204V陰性4845.28±8.5840.92±11.4776.38±9.275.38±2.03 rtn 236T陽性732.82±8.2118.92±4.1822.38±8.38①4.32±1.98①rtn 236T陰性5330.19±7.0632.19±5.2848.38±14.385.32±2.10 rtA 181V/T陽性631.06±5.2923.91±5.8324.28±6.38①3.19±0.34 rtA 181V/T陰性4424.27±6.4912.38±4.6316.38±7.393.21±0.39

表2　HBeAg陽性與陰性患者HBV基因變異（%）情況比較

3　討論

HBV DNA感染人體后在肝細(xì)胞核內(nèi)形成共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），并以其為模板不斷進(jìn)行復(fù)制。正常情況下，藥物通過特異性地與HBV聚合酶中的某一部位結(jié)合，引起病毒DNA雙鏈斷裂，進(jìn)而通過影響病毒復(fù)制而發(fā)揮抗病毒的作用。然而，長期使用拉米夫定等核苷類似物可誘發(fā)HBV多聚酶編碼基因區(qū)的點(diǎn)突變［4］，導(dǎo)致藥物有效性下降。同時，由于HBVcccDNA半衰期長，很難從體內(nèi)徹底清除，需要長時間抗病毒治療，耐藥發(fā)生率亦逐年增加。

乙型肝炎病毒耐藥包括基因型耐藥和表型耐藥。HBV基因型耐藥是通過分析藥物作用靶位，即HBV RT基因序列的改變，推導(dǎo)相應(yīng)氨基酸的改變，以確定病毒是否產(chǎn)生了基因型耐藥，其前提是所檢測的突變已被證實可以引起耐藥。HBV基因型耐藥分析至少需要包括rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt236和rt250等7個位點(diǎn)相關(guān)［5～7］。表型耐藥是確定基因型耐藥檢測結(jié)果的最終方法，也是發(fā)現(xiàn)新的耐藥突變位點(diǎn)以及潛在的交叉耐藥位點(diǎn)的手段。目前，表型耐藥檢測僅用于基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，尚未應(yīng)用于臨床，嚴(yán)重影響了病毒學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)以及抗病毒治療等方面的研究。因此，建立一種可行的、相對簡單快速的分析方法可促進(jìn)表型耐藥分析在臨床中的應(yīng)用，從而輔助臨床醫(yī)生更加準(zhǔn)確地判斷病情、制定個體化的抗病毒方案，達(dá)到持續(xù)抑制HBV復(fù)制和緩解肝臟疾病的目的。

乙型肝炎病毒基因變異的檢測方法學(xué)研究較多?；蛲蛔兾稽c(diǎn)的檢測可以用酶切法、變性梯度凝膠電泳法、變性高壓液相電泳法等多種方法，但最終仍需要通過DNA測序來確定突變位置和類型［7］。本研究直接采用DNA測序檢測基因變異。研究發(fā)現(xiàn)rtl 180M陽性和rtm 204V陽性患者HBeAg陰轉(zhuǎn)率低，rtn 236T陽性和rtA 181V/T陽性患者血清HBeAg無明顯變化，與國內(nèi)研究結(jié)果相似［8、9］。發(fā)現(xiàn)rtl 180M 和rtm 204V變異患者年齡較大、病程較長、HBV DNA拷貝數(shù)較高，rtn 236T變異患者較rtn 236T正?；颊吣挲g和病程長，但ALT和HBV DNA拷貝數(shù)較低；rtA 181V/T變異患者較rtA 181V/T正?；颊卟〕涕L和ALT高。有研究認(rèn)為，N236T突變與rt181T突變互為補(bǔ)償突變，一種突變可以增強(qiáng)另一種突變的病毒復(fù)制力和適應(yīng)能力，而且N236T突變與rt181T聯(lián)合突變可引起肝臟炎癥的波動，導(dǎo)致患者血清ALT升高，該結(jié)果與我們觀察到的結(jié)果一致［10］。楊松等認(rèn)為以rtA 181T變異為主，本研究病例數(shù)較少，因而未得出相似的結(jié)論［11］。有研究通過體外試驗證實rta181T/HBeAg截短變異有潛在致癌作用［12、13］。本研究在探討HBV DNA基因位點(diǎn)變異與乙型肝炎患者預(yù)后的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)rtl 180M、rtm 204V、rtn 236T和rtA 181V/T變異患者預(yù)后較差，其中rtl 180M和rtm 204V變異患者病情容易復(fù)發(fā)。

乙型肝炎病毒耐藥可增加肝硬化及肝癌發(fā)生率，并可能逆轉(zhuǎn)已改善的肝臟組織學(xué)損害，使后續(xù)治療變得更加復(fù)雜，增加長期治療成本［14］。臨床醫(yī)師應(yīng)密切關(guān)注乙型肝炎長期治療過程中基因變異的發(fā)生及由此所引發(fā)的病毒學(xué)反彈、肝功能惡化等，并權(quán)衡抗病毒效果與耐藥后可能帶來的病情加重之間的利弊，尤其是終末期肝病患者。如出現(xiàn)病毒變異耐藥，應(yīng)根據(jù)患者的個體情況調(diào)整抗病毒藥物治療，避免造成因突然停藥導(dǎo)致的病毒大量復(fù)制，進(jìn)而進(jìn)一步加重病情。

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（收稿：2016-02-17）

（本文編輯：陳宗炳）

·短篇論著·

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.04.022

內(nèi)蒙古自治區(qū)科研基金資助項目（編號：NJZZ11173）

014010內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染性疾病科

郝建宏，女，35歲，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師。主要從事感染性疾病診斷與治療學(xué)研究。E-mail：haohongnm0@163.com

林愛清，E-mail：184650553@qq.com

Hepatitis Bviral genemutationinpatients withhepatitis BHao Jianhong，Hu Yiling，Lin Aiqing.Department of Infectious Diseases，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Batou Medical College，Baotou 014010，Inner Mongolia Municipality