翟嵩，孫明珠，王文俊，李亞萍，張欣，李梅，黨雙鎖

抗增殖蛋白過表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

翟嵩，孫明珠，王文俊，李亞萍，張欣，李梅，黨雙鎖

目的探討抗增殖蛋白（PHB）過表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法在已構(gòu)建的PHB真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-PHB瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，采用四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖；使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞周期和凋亡。結(jié)果轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-PHB細(xì)胞增殖明顯低于pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染細(xì)胞（P＜0.05）；在轉(zhuǎn)染后48 h，轉(zhuǎn)染組G2/M期細(xì)胞比例為（27.84±0.47）%，顯著高于空載轉(zhuǎn)染組的（17.21±0.64）%或未轉(zhuǎn)染組的（22.67±0.33）%（P＜0.001）；轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為（31.72±0.35）%，顯著高于空載轉(zhuǎn)染組的（18.66±0.56）%或未轉(zhuǎn)染組的（13.47±0.94）%（P＜0.001）。結(jié)論P(yáng)HB過表達(dá)可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入G2/M期后被阻滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

HepG2細(xì)胞；抗增殖蛋白；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖

抗增殖蛋白（Prohibitin）作為重要的細(xì)胞膜蛋白超家族成員之一，主要存在于線粒體內(nèi)膜上，發(fā)揮著分子伴侶的作用［1］。近年來，越來越多的研究揭示抗增殖蛋白在新陳代謝、細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)及其相關(guān)疾病中起作用［2~6］。在丙型肝炎病毒體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)（Hepatitis C virus in vitro cell culture system，HCV cc）抗增殖蛋白表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)Huh-7-HCV和Huh-7.5-HCV細(xì)胞抗增殖蛋白表達(dá)上調(diào)，提示其在HCV致病機(jī)制中起某些作用［7-12］。prohibitin高表達(dá)在肝臟疾病尤其是丙型肝炎的發(fā)病機(jī)制方面所發(fā)揮的作用尚不清楚。為了進(jìn)一步闡明prohibitin的功能，詮釋prohibitin表達(dá)上調(diào)在肝細(xì)胞損傷中所發(fā)揮的作用，本研究應(yīng)用已構(gòu)建的pEGFP-prohibitin真核表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，以探討抗增殖蛋白表達(dá)上調(diào)對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討抗增殖蛋白的作用機(jī)制，以期揭示抗增殖蛋白在HCV感染中的作用，進(jìn)而為闡釋HCV的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞由我校醫(yī)學(xué)院生化教研室保存。TurboFect Transfection Reagent和預(yù)染蛋白質(zhì)（Prestained Protein）Marker購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；兔抗人prohibitin多克隆抗體和兔抗人GAPDH多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司；MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)GenScript公司。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染取HepG2細(xì)胞，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于六孔板，培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞融合達(dá)90%～95%。實(shí)驗(yàn)分為3組，即pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組、pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組。參照TurboFectTransfectionRe agent說明書轉(zhuǎn)染pEGFP-prohibitin，或轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-N1。

1.3細(xì)胞增殖檢測(cè)分別取轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h的細(xì)胞，用0.25%（w/v）胰蛋白酶消化、離心；將細(xì)胞重懸，以2×103個(gè)細(xì)胞/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入RPMI 1640培養(yǎng)液至200 μl/孔，于37℃、5%（v/v）CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。在避光條件下，向每孔加入MTT溶液10 μl，放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。每孔加入Formazan溶解液100 μl，放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，直到在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到Formazan全部溶解。使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。

1.4HepG2細(xì)胞周期檢測(cè)分別收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，用冷PBS（含有137 mM NaCl，2.7mMKCl，4.3mMNa2HPO4，1.4mM KH2PO4，pH 7.4）洗兩遍，棄去上清液，緩慢加入70%（v/v）冰乙醇，4℃固定過夜，用PBS清洗細(xì)胞，去除乙醇，向每個(gè)樣品管中加入PI染色液0.5 ml【每個(gè)樣品染色緩沖液0.5 ml+PI染色液（20×）25 μl+RNase A（50×）10 μl】，充分并緩慢地重懸細(xì)胞，37℃下避光溫浴30 min。使用Millipore guava easyCyte HT流式細(xì)胞儀（美國(guó)Millipore公司）在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處檢測(cè)紅色熒光，并檢測(cè)光散射情況。應(yīng)用ModFit LT2.0軟件（Verity Software House，USA）對(duì)光散射和細(xì)胞DNA水平進(jìn)行分析。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5細(xì)胞凋亡檢測(cè)［13］進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)步驟：（1）細(xì)胞的收集：PBS洗滌細(xì)胞1次，胰酶消化細(xì)胞。1500 r/ m離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞；（2）細(xì)胞與AnnexinⅤ-FITC結(jié)合：用PBS重懸細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。1500 r/m離心5 min，棄上清，加入1×Binding Buffer 500 μl，加入AnnexinⅤ-FITC 5 μl，再加入Propidium lodide 10 μl，輕輕混勻。在室溫下，避光反應(yīng)15 min；（3）流式細(xì)胞儀檢測(cè)：設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm。FL1為Annexin Ⅴ-FITC的綠色熒光FITC通道；FL2為PI紅色熒光通過的PI通道。使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)的正常細(xì)胞作為對(duì)照，進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 15.0軟件（IBM，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以（±s）表示，采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)確認(rèn)數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布。對(duì)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布者，進(jìn)行平方根反正旋變換，組間差異比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Dunnett-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異。

2　結(jié)果

2.1抗增殖蛋白基因表達(dá)上調(diào)延緩了細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，抑制了細(xì)胞增殖本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)抗增殖蛋白在pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2中高表達(dá)（待發(fā)表）。為探討其高表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖等的影響，我們進(jìn)一步應(yīng)用MTT法分別測(cè)定pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組、pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。如圖1所示，pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)速度和增殖活性明顯低于pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組或未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組細(xì)胞（P＜0.05），而pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組細(xì)胞增殖速度差異不明顯（P＞0.05）。

圖1　轉(zhuǎn)染后三組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.2抗增殖蛋白表達(dá)上調(diào)對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響轉(zhuǎn)染后48 h檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)（圖2），在G0/G1期，pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞比例（55.83±0.14%）明顯低于pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組（67.15±0.59%）或未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組細(xì)胞【（60.61±0.66%），P＜0.0001】；在G2/M期，pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞比例（27.84± 0.47%）明顯高于pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組（17.21± 0.64%）或未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組細(xì)胞【（22.67±0.33%），P＜0.0001】，提示pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的G2/M期阻滯；在S期，pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞比例（14.67±0.49%）與pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組（13.77±0.34%）或未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組（14.97± 0.32%）相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。由此證明了prohibitin表達(dá)上調(diào)使細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。

圖2　轉(zhuǎn)染48 h，prohibitin表達(dá)上調(diào)對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響

2.3抗增殖蛋白表達(dá)上調(diào)很可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生在轉(zhuǎn)染48 h，使用Millipore guava easyCyte HT流式細(xì)胞儀檢測(cè)pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組、pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡情況。如圖3所示，pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)少量的細(xì)胞凋亡，而pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)較高的凋亡峰（圖3-c箭頭所示），差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；如圖4a～c所示，在散點(diǎn)圖中，對(duì)于檢測(cè)細(xì)胞凋亡有顯著意義的是右下象限的細(xì)胞百分比，能反映凋亡細(xì)胞的數(shù)量多少；pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組凋亡率（31.72±0.35%）顯著高于未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組（13.47±0.94%）或pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組（18.66±0.56%，圖4-d），差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。prohibitin基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡明顯增多，提示prohibitin表達(dá)上調(diào)很可能誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

圖3　轉(zhuǎn)染48 h，3組細(xì)胞凋亡率直方圖

圖4　轉(zhuǎn)染48 h，3組細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖及凋亡率比較

3　討論

抗增殖蛋白屬于細(xì)胞膜蛋白超家族，是一種正常人體細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的多功能蛋白［14］。它是一種廣泛表達(dá)的、進(jìn)化上高度保守的基因，可能是一種抑癌基因［14］。在前期研究中，我們建立了穩(wěn)定的HCV體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)抗增殖蛋白在HCV感染細(xì)胞中較對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)量明顯增多［12］。但是，抗增殖蛋白高表達(dá)在肝臟疾病尤其是丙型肝炎的發(fā)病機(jī)制方面所發(fā)揮的作用尚不清楚。

在前期應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究丙型肝炎病毒體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)發(fā)現(xiàn)抗增殖蛋白表達(dá)上調(diào)。抗增殖蛋白表達(dá)上調(diào)的報(bào)道還可見于其他學(xué)者的研究中。Xu［15］發(fā)現(xiàn)prohibitin在高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株MHCC97-L細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并且導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制，抑制率達(dá)35%，癌細(xì)胞遷移率增加兩倍。Jia［16］通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究促黃體激素（Luteinizing hormone，LH）相關(guān)性人卵巢上皮性腫瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)抗增殖蛋白表達(dá)增高了2.5倍，prohibitin是一種LH相關(guān)性蛋白和LH的最新靶蛋白，抗增殖蛋白可能在人卵巢上皮癌變發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著保護(hù)性作用。進(jìn)而學(xué)者們開始研究抗增殖蛋白的生物學(xué)功能。Sripathi et al［17］發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激環(huán)境中，抗增殖蛋白在視網(wǎng)膜細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞核之間穿梭，發(fā)揮著抗凋亡和轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。He［18］發(fā)現(xiàn)prohibitin基因是一種雌激素調(diào)節(jié)基因，抗增殖蛋白在小鼠子宮內(nèi)膜發(fā)育和性功能發(fā)育中發(fā)揮著非常重要的作用，而且在雌激素調(diào)節(jié)基因的表達(dá)中不可或缺。以上研究均提示，prohibitin可能具有重要的調(diào)控作用。Kathiria［19］通過RNA干擾技術(shù)降低抗增殖蛋白基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)人結(jié)腸上皮細(xì)胞中抗增殖蛋白表達(dá)減少后引起細(xì)胞自噬，最終導(dǎo)致線粒體損傷和細(xì)胞毒性反應(yīng)。此外，抗增殖蛋白［20，21］還可能參與抑制細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗衰老等細(xì)胞生命活動(dòng)。但其確切功能尚存爭(zhēng)議，具體作用機(jī)制亦不明確。本研究通過研究過表達(dá)抗增殖蛋白對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2增殖和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)速度、增殖活性明顯落后于pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組細(xì)胞；pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率明顯高于pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞，pEGFP-prohibitin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞發(fā)生了G2/M期阻滯和S期細(xì)胞減少，提示prohibitin表達(dá)上調(diào)抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們?cè)谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)抗增殖蛋白在HCV體外細(xì)胞培養(yǎng)模型中明顯高表達(dá)［12］，提示其與肝臟疾病尤其是丙型肝炎的發(fā)生發(fā)展中有著某種作用，結(jié)合本研究結(jié)果可以推測(cè)HCV可能通過上調(diào)抗增殖蛋白參與抑制肝細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但目前在HCV體外細(xì)胞培養(yǎng)模型中HCV是如何引起抗增殖蛋白表達(dá)上調(diào)及其具體機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。另外，高表達(dá)的抗增殖蛋白抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的詳細(xì)分子機(jī)制和途徑不明，這些方面的問題仍需要在未來的研究中進(jìn)行探討。

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（收稿：2016-01-04）

（本文編輯：陳從新）

Objective To investigate the effect of prohibitin（PHB）over-expression on proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 cells.Methods The eukaryotic expression plasmid （pEGFP-N1-PHB）had been constructed and the HepG2 cells were transiently transfected with recombinant plasmid.Measurement of cell proliferation was performed by using MTT assay.Flow cytometry was carried out to detect cell cycle alterations and apoptosis.Results The cell growth curves showed that the proliferation of HepG2 cells were significantly decreased after transfection with pEGFP-N1-PHB as compared with pEGFP-N1 or controls（P＜0.05）；At 48 hours after transfection，the proportion of G2/M phase of HepG2 cells in pEGFP-N1-PHB-transfected group was（27.84±0.47）%，significantly higher than in pEGFP-N1-transfected group［（17.21± 0.64）%］or in the non-transfected group［（22.67±0.33）%，P＜0.001］；The percentage of apoptotic cells in pEGFPN1-PHB-transfected group was（31.72±0.35）%，much higher than（18.66±0.56）%in pEGFP-N1-transfected or non-transfected cells［（13.47±0.94）%，P＜0.001］.Conclusion PHB overexpression might inhibit the proliferation，induce G2/M phase arrest and apoptosis of HepG2 cells.

Hep G2 Cells；Prohibitin；Apoptosis；Cell cycle

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.04.007

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81170393）

710004西安市西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院感染病科

翟嵩，女，38歲，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師。主要從事感染性疾病發(fā)病機(jī)制研究。E-mail：zhaisongsong@189.cn

黨雙鎖，E-mail：dang212@126.com

Effect of prohibitin over-expression on proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 cells Zhai Song，Sun Mingzhu，Wang Wenjun，et al.Department of Infectious Diseases，Second Affiliated Hospital，Medical School，Jiaotong University，Xi'an 710004，Shaanxi Province，China