邢乃林,張蕾琛,應(yīng)泉盛,黃蕓萍,王毓洪

(浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江 寧波 315040)

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嫁接對葫蘆砧木及西瓜接穗甲基化水平的影響

邢乃林,張蕾琛,應(yīng)泉盛,黃蕓萍,王毓洪*

(浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江 寧波 315040)

以葫蘆砧木甬砧1號及西瓜接穗早佳8424為材料,利用甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)技術(shù)對嫁接及非嫁接的苗期及開花期葉片的甲基化水平進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:西瓜和葫蘆幼苗期葉片的甲基化水平分別為12.7%和11.0%，它們在開花期的甲基化水平分別較幼苗期提高了1.5和0.5個百分點；嫁接總體上提高了幼苗期和開花期的全甲基化水平，但明顯降低了半甲基化水平；嫁接對西瓜接穗甲基化水平的影響大于對砧木的影響；嫁接對開花期DNA甲基化狀態(tài)改變的影響最大，嫁接導(dǎo)致的甲基化狀態(tài)改變方式主要為未甲基化與全甲基化狀態(tài)之間的改變。

嫁接;甲基化;砧木;接穗;西瓜; MSAP

0　引言

DNA甲基化在高等動植物中普遍存在,是表觀遺傳修飾的重要類型之一,且不同物種不同發(fā)育時期不同器官的甲基化水平不同[1]。甲基化與表觀遺傳中的轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移失活、miRNA表達(dá)、基因印記等存在密切關(guān)系,同時還與生物及非生物脅迫抗性等有關(guān)[2-3]。植物中的DNA甲基化主要為5′-CG-3′中的胞嘧啶在甲基轉(zhuǎn)移酶催化下發(fā)生甲基化。甲基化檢測方法有亞硫酸氫鹽法、甲基化檢測芯片技術(shù)、DNA甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)分析和甲基化測序等技術(shù),其中MSAP法因操作簡單、重復(fù)性好、費用低等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用,是植物DNA甲基化水平檢測的重要技術(shù)[4-5]。

葫蘆科瓜菜作物包括葫蘆、西瓜等蔬菜和瓜果,具有十分重要的經(jīng)濟價值。而嫁接是解除西瓜等作物連作障礙的一種有效手段。大量研究表明,葫蘆砧木不僅可以影響西瓜接穗的產(chǎn)量和品質(zhì)性狀,還可以顯著增強西瓜接穗的生物及非生物脅迫抗性[6-7]。近年來的多項研究表明,嫁接過程可以引起葫蘆科、茄科及模式植物擬南芥等物種中miRNA及24堿基sRNA等分子在接穗及砧木之間交流與傳遞[8-9]。這些物質(zhì)可導(dǎo)致生物體表觀遺傳模式及基因表達(dá)水平發(fā)生改變,進(jìn)而產(chǎn)生產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性的改變[10-11]。其中DNA胞嘧啶甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾模式,廣泛存在于動植物基因組中,在調(diào)節(jié)基因表達(dá)等方面具有重要作用。

目前國內(nèi)外尚無針對嫁接引起西瓜接穗及葫蘆砧木DNA甲基化水平變異的研究。因此筆者通過MSAP方法檢測了嫁接對葫蘆砧木及西瓜接穗DNA甲基化水平的影響,以期為從DNA水平上研究嫁接機理及嫁接對西瓜品質(zhì)等性狀的影響奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

以葫蘆類型砧木甬砧1號(由寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供)為砧木,以浙江廣泛種植的西瓜品種早佳8424(商品種)為接穗進(jìn)行嫁接。嫁接方法采用插接法,育苗及管理采用常規(guī)嫁接育苗及田間栽培方法,在寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院溫室進(jìn)行。取存活30 d的嫁接幼苗及其開花期的葉片進(jìn)行分析,同時以未嫁接的甬砧1號和早佳8424的葉片為對照。

1.2基因組DNA提取及MSAP分析

對幼苗期及開花期的嫁接及未嫁接材料DNA的提取選用CTAB法進(jìn)行；提取后利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳及Mini Drop超微量分光光度計(上海依科賽生物制品有限公司)進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測。MSAP分析方法參照Xiong等[12]的方法。將提取的DNA稀釋至50 ng/μL,分別用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ內(nèi)切酶(New England Biolabs)組合對每個DNA樣品進(jìn)行雙酶切。酶切體系為DNA 500 ng、10× Buffer 10 μL、EcoRⅠ 10 U、MspⅠ (HpaⅡ) 10(20)U,加雙蒸水補至50 μL；在37 ℃下溫育5 h,在 65 ℃下水浴1 h終止酶切。酶切結(jié)束后向酶切產(chǎn)物中加入EcoR接頭[接頭及擴增引物序列見表1,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]10 μmol、MspⅠ(HpaⅡ)接頭100 μmol、T4 DNA連接酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)5 U、10× T4 DNA Ligase Buffer 10 μL,加雙蒸水補至100 μL;在4 ℃下保持12 h。預(yù)擴增體系為:連接產(chǎn)物0.5 μL、10× Buffer 2.5 μL、MgCl250 μmol、dNTP 4 μmol、Taq DNA聚合酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)2 U、E-A 50 μmol、M-T 1 μmol,加雙蒸水補至25 μL。預(yù)擴增反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,19個循環(huán);72 ℃延伸10 min。將預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋20倍，用于選擇性擴增。擴增體系為：模板3 μL、10× Buffer 1.5 μL、MgCl230 μmol、dNTP 3 μmol、Taq DNA聚合酶2U、E-A+2 50 μmol、M-T+2 0.5 μmol,加雙蒸水補至15 μL。選擇性擴增反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性1 min;94 ℃變性30 s,65 ℃ 30 s,每個循環(huán)降低0.7 ℃,72 ℃延伸1 min,12個循環(huán);94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,25個循環(huán);72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)0.6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,用常規(guī)硝酸銀染色法進(jìn)行檢測。

表1　MSAP分析所用的接頭和引物序列

1.3數(shù)據(jù)分析

將每條擴增帶紋作為1個酶切識別位點,有擴增條帶記為1,無擴增條帶記為0。全甲基化及半甲基化類型統(tǒng)計方法參照徐志軍等[3]的方法。采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同發(fā)育時期甲基化水平

利用35對選擇性擴增引物組合,對幼苗期和開花期的嫁接和非嫁接材料葉片的甲基化水平進(jìn)行分析,共擴增出1218條清晰可讀的條帶(表2)。其中甬砧1號的多態(tài)性條帶有299條,占甬砧1號總條帶數(shù)的38.09%;早佳8424的多態(tài)性條帶有434條,占早佳8424總條帶數(shù)的52.54%。表明早佳8424的甲基化多態(tài)性高于甬砧1號。

在幼苗期,甬砧1號的全甲基化水平為8.6%(表3),高出開花期0.1個百分點；而半甲基化水平則以開花期為高,高出0.6個百分點。對于早佳8424,相對于幼苗期,開花期的全甲基化水平升高1.8個百分點,半甲基化水平則降低0.3個百分點。對于嫁接材料,相對于幼苗期,除早佳8424的半甲基化水平有所降低外,甬砧1號和早佳8424的全甲基化水平分別升高0.6和1.3個百分點,甬砧1號的半甲基化水平升高0.3個百分點。總體上,開花期的甲基化水平高于幼苗期。

表2　甬砧1號及早佳8424的

2.2嫁接對甲基化水平的影響

MSAP分析結(jié)果(表3)顯示：嫁接材料砧木甬砧1號及接穗早佳8424在幼苗期的全甲基化水平分別為8.2%和7.7%,半甲基化水平分別為1.9%和4.1%,相對于未嫁接材料，它們的全甲基化水平分別改變了-0.4、0.6個百分點，半甲基化水平分別下降了0.5、1.5個百分點；在開花期,嫁接材料砧木甬砧1號及接穗早佳8424的全甲基化水平分別為8.8%和9.0%,半甲基化水平為2.2%和3.0%,相對于未嫁接材料，分別改變了0.3、0.1和-0.8、-2.3個百分點。說明嫁接總體上提高了全甲基化水平，但明顯降低了半甲基化水平，其中對西瓜接穗的影響較大。

表3　嫁接對甲基化水平的影響

注:G表示嫁接苗。

2.3嫁接對甲基化狀態(tài)改變的影響

從表4可以看出：甬砧1號砧木幼苗期和開花期發(fā)生甲基化狀態(tài)改變的條帶數(shù)分別為42和83條,早佳8424接穗幼苗期和開花期發(fā)生改變的條帶數(shù)分別為128和140條。表明嫁接對開花期DNA甲基化狀態(tài)改變的影響最大。從甲基化狀態(tài)改變條帶占多態(tài)性條帶之比來看,甬砧1號砧木在幼苗期和開花期分別為0.14、0.28，早佳8424接穗在幼苗期和開花期分別為0.29和0.32,以開花期甲基化狀態(tài)改變程度最大,而且早佳8424接穗的改變程度大于甬砧1號砧木的。在各個甲基化狀態(tài)改變類型中,未甲基化與全甲基化之間改變的條帶最多,其中2個發(fā)育時期早佳8424接穗的改變條帶數(shù)高于甬砧1號砧木的。

表4　嫁接引起的DNA甲基化狀態(tài)改變的條帶數(shù)

注:“未”表示未甲基化;“半”表示半甲基化;“全”表示全甲基化。

3　討論

DNA甲基化是表觀遺傳調(diào)控的一種重要方式,在營養(yǎng)生長和生殖生長過程中均有重要的作用。主要通過基因的甲基化和去甲基化來調(diào)控基因的表達(dá)。在所有動物和植物中均廣泛存在,且在不同物種間DNA甲基化水平存在一定的差異,且同一物種同一器官在不同發(fā)育時期甲基化水平也不同[1,13]。甲基化類型有3種,分別為半甲基化、全甲基化及超甲基化。本研究所用的MSAP方法僅能檢測半甲基化和全甲基化2種。結(jié)果顯示：西瓜幼苗期葉片的甲基化水平為12.7%,葫蘆幼苗期葉片的甲基化水平為11.0%，且成熟期甲基化水平較幼苗期均有一定程度的升高,分別提高1.5和0.5個百分點；嫁接對葫蘆砧木及西瓜接穗的甲基化水平均有影響,且對西瓜接穗的影響更大。這與Xing等[1]的研究結(jié)果一致。

嫁接是果樹與瓜菜生產(chǎn)中廣泛采用的重要技術(shù),砧木品種的選擇對嫁接瓜菜等的生產(chǎn)至關(guān)重要。盡管嫁接已經(jīng)被廣泛使用,但是相關(guān)嫁接機理仍不清楚。Liu等[14]通過對嫁接西瓜的測序發(fā)現(xiàn),以葫蘆和南瓜為砧木均發(fā)現(xiàn)有miRNA在砧木和接穗間交換。2015年, Liu等[15]又發(fā)現(xiàn)嫁接導(dǎo)致激素信號、初級和次級代謝、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)座子及對刺激物反應(yīng)相關(guān)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的改變。Avramidou等[16]發(fā)現(xiàn)有mRNA從砧木到接穗的轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)嫁接可以同時改變砧木及接穗的甲基化水平。Avramidou等[5]也發(fā)現(xiàn)嫁接可以引起接穗甲基化水平的改變,使接穗甲基化水平上升。因此,嫁接的原理之一可能是由于砧木及接穗間miRNA的轉(zhuǎn)移,然后與甲基化相互調(diào)控,最終影響相關(guān)基因的表達(dá),導(dǎo)致嫁接對砧木及接穗的影響。但是嫁接材料砧木和接穗間甲基化和miRNA轉(zhuǎn)移的調(diào)控機制仍需要驗證。Lewsey等[17]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)有相關(guān)結(jié)果,但其與嫁接后接穗產(chǎn)量等性狀的變化的關(guān)系還不清楚。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Effect of Grafting on DNA Methylation Level of Calabash Rootstock and Watermelon Scion

XING Nai-lin, ZHANG Lei-chen, YING Quan-sheng, HUANG Yun-ping, WANG Yu-hong*

(Ningbo Municipal Academy of Agricultural Sciences in Zhejiang Province, Ningbo 315040, China)

Using calabash rootstock (Yongzhen No. 1) and watermelon scion (Zaojia 8424) as experimental materials, the author used Methyl Sensitive Amplification Polymorphism (MSAP) technique to evaluate the DNA methylation level of grafted and non-grafted calabash and watermelon leaves at seedling stage and flowering stage. The results showed that the DNA methylation levels of non-grafted watermelon and calabash leaves at seedling stage were 12.7% and 11.0%, respectively, which were separately 1.5 and 0.5 percent lower than those at flowering stage. Grafting generally increased the full-methylation levels of watermelon and calabash leaves at seedling stage and flowering stage, but obviously reduced their semi-methylation levels. Grafting had a greater influence on the methylation level of watermelon scion than calabash rootstock. Grafting had the greatest influence on the variation in DNA methylation status at flowering stage, and the variation mode of DNA methylation status caused by grafting was mainly the transformation from non-methylation status to fulll-methylation status.

Grafting; Methylation; Rootstock; Scion; Watermelon; MSAP

2016-03-28

瓜類砧木育種創(chuàng)新團隊(2014B81002);國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-26);寧波市瓜菜育種重點實驗室(2014A22007)。

邢乃林(1985─),男,河南封丘人,助理研究員,博士,主要從事瓜類砧木分子育種研究。*通訊作者:王毓洪。

S616

A

1001-8581(2016)09-0027-04