張維誼，王曉旭，寧 昆，徐 鋒，沈莉萍

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

豬源豬鏈球菌耐藥情況分析

張維誼，王曉旭，寧 昆，徐 鋒，沈莉萍

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

近年來，為掌握上海地區(qū)豬源豬鏈球菌的耐藥情況及耐藥規(guī)律，文章對2013～2015年畜禽門診、養(yǎng)殖場、屠宰場分離到的59株豬鏈球菌進(jìn)行藥敏試驗。結(jié)合CLSI及獸醫(yī)臨床標(biāo)準(zhǔn)，選用8種抗生素，采用微量肉湯稀釋法（MIC）進(jìn)行藥物敏感試驗。結(jié)果表明，豬鏈球菌對8種抗生素均產(chǎn)生不同程度的耐藥性，且耐藥程度很高在44%～95%之間，四環(huán)素耐藥率最高為95%，敏感率40%以上的有4種抗生素。部分藥物在臨床上，已經(jīng)成為嚴(yán)重的耐藥，豬鏈球菌耐藥情況，呈逐年加重的趨勢。

豬鏈球菌 藥敏試驗 耐藥性 MIC

抗生素是一類對細(xì)菌、寄生蟲等具有抑制和殺滅作用的藥物，在畜牧飼料行業(yè)中已得到廣泛應(yīng)用，在動物疫病防治、提高飼料轉(zhuǎn)化效率、促進(jìn)畜禽生長方面發(fā)揮了重要作用。我國由于養(yǎng)殖密度大，畜禽疫病復(fù)雜多樣，且監(jiān)管不力等多種原因，抗生素濫用現(xiàn)象較為嚴(yán)重，伴隨而來的耐藥問題越來越嚴(yán)重，給養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展埋下了隱患。

豬鏈球菌病是養(yǎng)殖業(yè)中最為常見的一種細(xì)菌性疾病。在實際養(yǎng)殖過程中，由于畜主對藥物的濫用，使得許多常用抗菌藥物出現(xiàn)了效果下降，甚至無效，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失［1］。與此同時，動物養(yǎng)殖過程中，濫用抗生素所帶來的影響，最終還是會通過各種途徑“轉(zhuǎn)嫁”到人身上，加劇抗生素耐藥性問題，影響著人類的健康。因此，對豬源豬鏈球菌進(jìn)行耐藥性監(jiān)測，掌握豬鏈球菌耐藥規(guī)律及變化情況，對指導(dǎo)臨床合理用藥，減少養(yǎng)殖戶經(jīng)濟損失具有重要意義。

該研究對近年來上海地區(qū)的豬源豬鏈球菌進(jìn)行了細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定，并對分離株進(jìn)行了微量肉湯稀釋法藥物敏感試驗，研究了豬鏈球菌在上海地區(qū)的耐藥情況，為指導(dǎo)養(yǎng)殖戶臨床合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 樣本及標(biāo)準(zhǔn)株

2013～2015年，來自上海地區(qū)養(yǎng)殖場鼻棉拭子、屠宰場扁桃體樣本和上海市動物疫病預(yù)防控制中心畜禽門診接收的發(fā)病畜禽病料（心、肝、脾、肺和腎臟）。豬鏈球菌藥敏實驗質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)株ATCC43300購買自中國獸藥監(jiān)察所。

1.2 主要試劑與儀器

革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；Columbia血瓊脂基礎(chǔ)購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；無菌羊血購自上海閔行區(qū)諸翟無菌動物血試劑供應(yīng)站；革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡（GP）購自法國梅里埃公司；豬鏈球菌藥敏板（含8種抗菌藥物）由天津金章科技發(fā)展有限公司訂制；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；Premix購自TaKaRa公司，還有全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2-Compact）和普通PCR儀（BioRad PTC-200）。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

按要求將樣本涂抹接種于Columbia血平板（加入1μL/mL過濾除菌的NAD和5%～10%脫纖維綿羊血），在5%CO2培養(yǎng)箱中經(jīng)36℃培養(yǎng)24～48 h，對可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。挑取單個菌落，接種于Columbia血平板進(jìn)行純培養(yǎng)，觀察菌落特征及染色特點。

2.2 細(xì)菌鑒定

參照文獻(xiàn)［2］合成豬鏈球菌的引物，PCR反應(yīng)體系為25μl：premix 12.5μl、引物各0.5μl、ddH2O 8.5μl、模板2μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)熱5 min、94℃30 s、56℃30 s、72℃1 min，擴增30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

2.3 藥敏試驗

2.3.1 菌液制備

用滅菌棉簽取適量待測菌，懸浮于3 ml 0.45%NaC溶液中，用比濁儀調(diào)整細(xì)菌的濃度，使其麥?zhǔn)蠁挝贿_(dá)到0.48～0.52。同時，用ATCC43300作為試驗質(zhì)控菌株。

2.3.2 菌液接種

首先從12 ml肉湯管中，吸取100μl加到空白對照孔，然后吸取待測菌液100μl到剩余的12 mL肉湯管中，混勻，加100μl到其余各孔。質(zhì)控菌株操作同待測菌。

2.3.3 孵育

將藥敏板置于墊有濕紗布的瓷方盤內(nèi)，36℃溫箱孵育16～18 h。

2.3.4 結(jié)果判定

在襯有黑底板的光線下觀察，無細(xì)菌生長的孔內(nèi)所含最低抗菌藥物濃度，即為最低抑菌濃度（MIC）。結(jié)果判定及質(zhì)量控制參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 耐藥率

豬鏈球菌的耐藥性 59株豬鏈球菌，對8種抗生素的藥敏試驗結(jié)果見表1。

3.2 多重耐藥性和耐藥譜

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，對豬鏈球菌試驗菌株多重耐藥性進(jìn)行分析，獲得其耐藥譜（表2）和耐藥譜型（表3），共有耐藥譜型25種。

表1 59株豬鏈球菌MIC藥敏試驗結(jié)果

表2 59株豬鏈球菌耐藥譜

表3 豬鏈球菌耐藥譜型

3.3 豬鏈球菌耐藥趨勢

選擇8種抗生素，對豬鏈球菌的耐藥趨勢進(jìn)行分析（圖1）。

4 分析

由59株細(xì)菌的耐藥率分析，豬鏈球菌對8種抗生素均產(chǎn)生不同程度的耐藥性，耐藥率在44%～95%之間，耐藥率80%以上的藥物有2種，四環(huán)素耐藥率將近95%，其余6種均在50%左右，耐藥率達(dá)54.24%。敏感率40%以上的有4種抗生素，最高的僅為44.07%，頭孢噻呋作為第3代動物專用頭孢菌素，耐藥率已達(dá)到54%以上，說明豬源豬鏈球菌的耐藥情況嚴(yán)重。

耐藥譜分析顯示，1耐到8耐的菌株都有，最少的為3耐和4耐，其次為1耐和7耐，8耐的菌株數(shù)最多，達(dá)20%以上，僅1株菌株沒有產(chǎn)生耐藥性。該研究共出現(xiàn)耐藥譜型25種，譜型較多，說明豬鏈球菌的耐藥情況較為復(fù)雜，濫用抗生素較為嚴(yán)重，提示在臨床應(yīng)加強藥物的合理使用和指導(dǎo)。

四環(huán)素和紅霉素的耐藥率一直居高不下，其余6種抗生素的耐藥率從2013年至2015年均有增加，環(huán)丙沙星、氧氟沙星呈逐步升高趨勢。頭孢噻呋的耐藥率從2013年的25%到2014年以來的60%，增加幅度最大。2013年，耐藥率在25%有5種抗生素，到2015年，均在44%以上。

抗生素在防治畜禽疾病方面發(fā)揮了較大作用，但伴隨而來的耐藥問題及公共衛(wèi)生問題也日益嚴(yán)重。加強對細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測、管理和技術(shù)支持，對細(xì)菌耐藥性的控制，具有重要意義。

首先是監(jiān)測方面。應(yīng)建立健全監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，提高監(jiān)測水平和監(jiān)測質(zhì)量，保證及時、完整、準(zhǔn)確地獲得我國細(xì)菌耐藥性數(shù)據(jù)，用監(jiān)測結(jié)果指導(dǎo)養(yǎng)殖戶，更加科學(xué)合理的使用抗生素［3］。

圖1 59株2013～2015年豬鏈球菌不同藥物耐藥率

其次是管理方面。要控制和管理制藥企業(yè)在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的不合理銷售及競爭行為，并對基層獸醫(yī)從業(yè)人員進(jìn)行有效監(jiān)管，加強教育培訓(xùn)工作，提高理論知識，防止抗生素濫用、亂用現(xiàn)象的發(fā)生。

最后是技術(shù)層面。臨床上可以使用一些中草藥，用來減少抗生素的使用。例如，金銀花對耐青霉素的金黃色葡萄球菌有增敏作用，在低于抗菌濃度時，還能增強白細(xì)胞的吞噬能力，對青霉素抗菌有增效作用；葛根芪連湯與氨芐青霉素、頭孢哌酮、諾氟沙星配用均有協(xié)同作用。同時，也可以探索新的抗菌治療方法，如抗生素的輪流替用和聯(lián)合用藥，以應(yīng)對細(xì)菌耐藥性問題。

［1］ 江飆，董嘉文，張獻(xiàn)杰，等.廣東地區(qū)動物源性大腸桿菌的分離及藥敏分析.中國獸藥雜志，2009，43（1）：14～16

［2］ 李小軍.上海地區(qū)豬鏈球菌致病性血清型及其毒力因子的流行病學(xué)調(diào)查.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007

［3］ 劉海林，武新國.大腸桿菌的藥敏試驗報告.當(dāng)代畜牧，2014，（11）：70～71