李登科，范國(guó)樑，葉鴻宇，姚鶴鳴，陸怡峰,張春濤，馬立超，邢立霞*

(1.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心天津工作站,天津 300163；2.天津大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300072；3.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,上海 200082)

硒是人體的必需微量元素之一，在體內(nèi)發(fā)揮著抗氧化、保護(hù)細(xì)胞膜的作用，還具有提高機(jī)體免疫力、消除重金屬積累等生理生化功能[1]。硒化合物的毒性及有益性取決于其濃度與存在的化學(xué)形態(tài)[2]。硒在自然界和生物體中有多種形態(tài)，其中毒性較大的有硒酸鹽Se(Ⅵ)、亞硒酸鹽Se(Ⅳ)，與人體代謝密切相關(guān)的有硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒脲(SeUr)等[3]。目前，硒形態(tài)測(cè)定方法有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[4]、原子熒光光譜法[5]、高效液相色譜-紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)[6]、電化學(xué)法[7]、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[8]。

高效液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)具備諸多優(yōu)點(diǎn)，如：檢測(cè)限低、線性范圍寬、分離步驟少、分離程序快、保持元素原有形態(tài)被直接檢測(cè)等，能夠極大提高分析效率，具有很強(qiáng)的實(shí)用性[9]。目前關(guān)于砷、硒、鉻、汞等元素形態(tài)分析的研究工作已見諸報(bào)道[10 - 13]。但在目前的相關(guān)報(bào)道中，煙草中硒的形態(tài)分析研究很少。本文采用HPLC-ICP-MS法建立了煙草中硒元素的形態(tài)分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

1260-7700x型高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)，Agilent公司)；Milli-Q超純水儀(美國(guó)，Millipore公司)；KQ600-DE超聲波清洗器(昆山超聲)；Z300高速離心機(jī)(德國(guó)，Hermle公司)；s220k pH計(jì)(瑞士，Mettler公司)；0.45 μm纖維素濾膜(上海安譜)。

HCl(分析純，天津科密歐)；檸檬酸(CNW公司)；氨水(分析純，天津科密歐)；硒代胱氨酸、亞硒酸根、甲基硒代半胱氨酸、硒酸根、硒脲、硒代蛋氨酸6種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品(上海安譜)。Milli-Q超純水。

煙草樣品由天津卷煙廠提供。

1.2 樣品前處理

將煙草樣品在溫度22±1 ℃，相對(duì)濕度60%±2%恒溫恒濕箱中平衡24 h，加工磨細(xì)至100目，取1.0000 g煙草樣品，加入10 mL 0.10 mol/L的HCl，超聲萃取30 min后移至離心管中，在3 500 r/min條件下離心20 min，取上層清液過0.45 μm纖維素濾膜，待HPLC-ICP-MS分析[11]。

1.3 儀器條件

HPLC條件：保護(hù)柱(填料為苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，Hamilton公司)；硒形態(tài)分析柱(Hamilton PRP X-100陰離子交換柱)；流動(dòng)相為20 mmol/L檸檬酸溶液，用氨水調(diào)節(jié)pH=7.0，流速1.2 mL/min，進(jìn)樣體積100 μL。

ICP-MS條件：RF入射功率1 550 W，RF匹配電壓1.8 V；同心圓霧化器，載氣為高純氬氣，等離子體氣體流速15.0 L/min，載氣流速1.02 L/min，He碰撞模式，碰撞氣流速0.90 L/min；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速0.36 r/s；采樣深度8 mm；檢測(cè)質(zhì)量數(shù)m/z=78(Se)，停留時(shí)間為0.5 s(m/z=78)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1流動(dòng)相及其濃度的選擇考慮到待測(cè)目標(biāo)硒化合物的理化性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)選擇檸檬酸溶液作為流動(dòng)相。分別選取10、15、20和25 mmol/L的檸檬酸溶液作為流動(dòng)相，考察流動(dòng)相濃度對(duì)6種硒元素形態(tài)分離的影響，如圖1。結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相濃度較低時(shí)，分離時(shí)間較長(zhǎng)，色譜峰形會(huì)有比較明顯的展寬，分離度較低；隨著流動(dòng)相濃度的不斷增大，分離時(shí)間逐漸減小，峰形趨于對(duì)稱，分離度均較好。綜合考慮分析時(shí)間、分離度因素，最終選擇20 mmol/L的檸檬酸溶液為流動(dòng)相。

2.1.2流動(dòng)相pH值對(duì)硒元素形態(tài)分離的影響分別考察了流動(dòng)相pH值對(duì)6種硒元素形態(tài)分離的影響，如圖2。結(jié)果表明，硒酸根的保留時(shí)間隨流動(dòng)相pH值的增大有明顯的減小趨勢(shì)，硒代胱氨酸和甲基硒代半胱氨酸的保留時(shí)間在pH值超過7.0時(shí)才會(huì)有所增加，其余形態(tài)的保留時(shí)間受pH值變化影響較小。綜合保留時(shí)間和分離度，在pH=7.0時(shí)具有最佳分離效果，且總的分離時(shí)間約5.5 min。在該條件下，出峰順序依次為：硒代胱氨酸、亞硒酸根、甲基硒代半胱氨酸、硒酸根、硒脲、硒代蛋氨酸。

2.1.3流動(dòng)相流速對(duì)硒元素形態(tài)分離的影響流動(dòng)相流速對(duì)于不同形態(tài)硒元素的保留時(shí)間同樣具有影響?？疾炝肆魉俜謩e為0.8、1.0、1.2和1.5 mL/min時(shí)對(duì)硒形態(tài)分析的影響，如圖3。當(dāng)流速較低時(shí)，分離時(shí)間過長(zhǎng)，且色譜峰形會(huì)有明顯的展寬，分離度較低；當(dāng)流速過高時(shí)，出峰最早的硒代胱氨酸與亞硒酸根又會(huì)出現(xiàn)峰形重疊的現(xiàn)象，分離度變?。煌瑫r(shí)在高流速下會(huì)加速色譜柱的流失，影響色譜柱的壽命和柱效。綜合考慮，選定流動(dòng)相流速為1.2 mL/min。

2.2 樣品前處理方法的研究

2.2.1萃取溶液的選擇稀HCl可以提取煙草樣品中大部分無機(jī)態(tài)硒，而蛋白酶則可以將樣品中的有機(jī)態(tài)硒水解，提高某些有機(jī)態(tài)硒的回收率[14,15]。因此實(shí)驗(yàn)分別采用稀HCl、蛋白酶(from 灰色鏈)溶液、蛋白酶K(from 林伯式白色念球菌)溶液作為煙草樣品萃取溶液，對(duì)煙草中硒元素進(jìn)行萃取/酶解。結(jié)果表明，以稀HCl為萃取溶液，能夠達(dá)到更好的萃取效果。加入蛋白酶/蛋白酶K并沒有實(shí)現(xiàn)有機(jī)態(tài)硒的水解，而蛋白酶/蛋白酶K的水溶液對(duì)無機(jī)態(tài)硒的萃取能力也弱于稀HCl。而采用0.10 mol/L HCl萃取時(shí)，除硒酸根與亞硒酸根外，還可以檢測(cè)出其他有機(jī)態(tài)硒，因此選用其作為萃取溶液。

2.2.2萃取液用量的選擇稱取1.0000 g煙草樣品，分別加入10、20、30、40和50 mL 0.10 mol/L HCl對(duì)煙草樣品進(jìn)行樣品前處理，上機(jī)測(cè)定后計(jì)算萃取效率。結(jié)果表明，萃取液體積大于20 mL時(shí)，可以對(duì)硒酸根和亞硒酸根進(jìn)行定量，且萃取效率基本保持不變。但如果萃取溶液體積過高，會(huì)使硒形態(tài)響應(yīng)降低而難以定量。當(dāng)萃取液為10 mL時(shí)，可以同時(shí)對(duì)硒代胱氨酸與甲基硒代半胱氨酸等有機(jī)態(tài)硒進(jìn)行定量，提高總體萃取效率。若萃取溶液體積進(jìn)一步降低，則很難將煙草樣品完全浸沒，從而影響萃取。實(shí)驗(yàn)選用10 mL稀HCl作為最佳萃取液體積。同時(shí)對(duì)萃取液濃度進(jìn)行考察，選用0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mol/L HCl作為萃取液，結(jié)果表明，采用0.10 mol/L HCl，對(duì)樣品中硒元素的萃取效率最高。

2.2.3萃取方式與萃取時(shí)間的優(yōu)化通過對(duì)比超聲、恒溫水浴振蕩、超聲加水浴振蕩等不同的樣品提取方法，發(fā)現(xiàn)超聲萃取效果高于單純的振蕩提取，與超聲加水浴振蕩相結(jié)合的方法結(jié)果也沒有明顯差別，因此選用超聲萃取作為樣品萃取方式。同時(shí)考察不同超聲時(shí)間對(duì)硒元素提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)30 min超聲能夠較好地保證樣品萃取效率。

通過上述各樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，形成的樣品前處理方法如文中“1.2”所述，在此條件下，樣品的萃取效率在72%左右，較仲娜等[11]中同樣使用稀HCl萃取富硒產(chǎn)品的萃取效率有所提高，但低于倪張林等[16]中使用蛋白酶提取富硒蔬菜的萃取效率。推測(cè)煙草中基質(zhì)比較復(fù)雜，單純的添加蛋白酶并不能使煙草中的有機(jī)態(tài)硒水解出來，或煙草中存在其他形式的難以解離出的硒形態(tài)，在既定檢測(cè)方法下無法測(cè)定，從而影響方法的萃取效率。

根據(jù)優(yōu)化的樣品分析方法，對(duì)煙草樣品進(jìn)行硒元素形態(tài)測(cè)定。6種硒形態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖4所示。煙草樣品色譜圖如圖5所示。

2.3 方法分析性能

該方法對(duì)不同硒元素形態(tài)的分析性能列于表1。由表1可見，各硒元素形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，檢出限為0.13～3.25 ng/mL。同時(shí)采用最低濃度的硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣10次，計(jì)算各硒元素形態(tài)濃度值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果均小于3%，表明方法的精密度良好。

表1 6種硒元素形態(tài)的線性回歸方程和方法檢出限

Comment:y-peak area of selenium species,x-concentration of selenium species.

2.4 加標(biāo)回收率的測(cè)定

向煙草樣品中分別添加不同濃度的硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液，并參考“1.2”中的樣品前處理步驟，測(cè)定加標(biāo)樣品結(jié)果，并與樣品本底值對(duì)照，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果如表2所示。由表2可知，各硒形態(tài)的加標(biāo)回收率介于86.1%～95.8%，該方法適用于煙草中硒元素形態(tài)分析。

表2 煙草樣品中硒元素形態(tài)加標(biāo)回收率結(jié)果(n=3)

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

隨機(jī)選取三種市售卷煙，取其煙絲部分，按“1.2”方法進(jìn)行樣品前處理，并按“1.3”方法進(jìn)行樣品分析。每一個(gè)樣品平行測(cè)定三次，取其平均值作為樣品中硒元素形態(tài)測(cè)定結(jié)果。結(jié)果如表3所示。

表3 實(shí)際樣品硒形態(tài)含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

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3 結(jié)論

依據(jù)建立的HPLC-ICP-MS方法考察了煙草中硒元素的形態(tài)分布特征，結(jié)果表明無機(jī)態(tài)的亞硒酸根與硒酸根含量較高，而有機(jī)態(tài)的硒中甲基硒代半胱氨酸含量相對(duì)較高。鑒于不同形態(tài)硒元素對(duì)生物體的作用差異較大，因此基于硒元素的形態(tài)分析結(jié)果的安全性評(píng)價(jià)比基于硒元素總量的安全性評(píng)價(jià)更加科學(xué)、合理。