馬治國，劉 靜，汪寶堆*

(1.蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州 730000;2.張家川回族自治縣第二中學(xué)，甘肅天水 741506)

當(dāng)前重金屬污染對環(huán)境和人類健康造成了嚴(yán)重威脅，因此設(shè)計合成一系列多功能的納米探針,借此高靈敏、高選擇性識別環(huán)境和生物體內(nèi)的金屬離子顯得非常重要，適量的Cu可以維持人體中一些酶的生物過程以及調(diào)節(jié)人體的一些重要生理活動，但是過量的Cu會對人體產(chǎn)生非常嚴(yán)重的影響，比如會造成神經(jīng)性疾病如老年癡呆癥和帕金森癥等，還會引起肌肉萎縮性疾病，并對腸胃和腎臟構(gòu)成損害。Cu對環(huán)境水體的污染會影響江河水通過化學(xué)或生物降解的方式進(jìn)行自凈化的能力[1]。因此，監(jiān)測水中Cu2+對于預(yù)防環(huán)境污染和保持人體健康都是十分重要的。目前，Cu2+的檢測方法有原子吸收/發(fā)射光譜、電感耦合等離子質(zhì)譜和一些電化學(xué)的方法[2,3]。但是這些方法由于需要昂貴的儀器和復(fù)雜的樣品前處理步驟，因此其應(yīng)用受到了限制。而最近幾年發(fā)展起來的熒光檢測方法，因為其靈敏度高、響應(yīng)速度快、操作簡便等優(yōu)點受到了人們的青睞[4]。

近年來,用來檢測Cu2+的熒光探針大部分是一些小分子有機(jī)熒光染料,由于這些熒光染料水溶性較差，容易發(fā)生光漂白現(xiàn)象[5]，其應(yīng)用時靈敏度和選擇性受到限制。與傳統(tǒng)的有機(jī)染料相比，鑭系配合物具有許多優(yōu)良的性質(zhì)，如窄帶發(fā)射、大的Stokes位移、長的熒光壽命和高的量子產(chǎn)率[6]。稀土配合物作為熒光探針可以檢測陽離子、陰離子和生物分子[7,8]。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，將具有特異性識別功能的熒光分子和納米粒子復(fù)合而成的新的探針，由于納米粒子對熒光分子的聚集作用使熒光信號進(jìn)一步放大，可以超靈敏檢測金屬離子。同時，熒光分子和順磁性納米粒子復(fù)合成的熒光探針對金屬離子還具有富集和分離功能[9 - 11]。

本研究將Tb3+的發(fā)光配合物,通過聚乙二醇衍生物修飾在磁性Fe3O4納米粒子表面，該納米探針在水溶液中能夠發(fā)出很強(qiáng)的Tb3+特征熒光。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Cu2+加入該探針?biāo)纬傻娜芤汉?，由于其與探針中的有機(jī)分子具有強(qiáng)的結(jié)合能力，導(dǎo)致Tb3+被Cu2+取代，納米探針的熒光被淬滅，從而實現(xiàn)了對Cu2+的超靈敏、高選擇性檢測。此工作的開展對今后在環(huán)境和生物體中金屬離子的檢測提供了一種新的思路和方法。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

Philips EM 420場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM)(美國，飛利浦公司)；RF-5301熒光分光光度計光譜儀(日本，島津公司)。

7-氨基-4-甲基喹啉酮(cs124)、 聚乙二醇(PEG,MW=4 000)、3,4-二羥基苯甲醛,均購自Sigma-Aldrich公司。參照文獻(xiàn)方法合成Fe3O4納米粒子[12]，二乙三胺五乙酸酐(DTPAA)[13]，1,ω-PEG二胺(NH2-PEG -NH2)[14]，3,4-二羥基苯甲醛-PEG -胺(DBI-PEG -NH2)[15]，F(xiàn)e3O4-DBI-PEG -NH-DTPA-cs124∶Tb3+[16]。TbCl3·6H2O是將Tb4O7溶于HCl并不斷蒸發(fā)掉過量的酸，然后緩慢滴加30%H2O2，蒸發(fā)烘干析出固體。

1.2 cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb復(fù)合熒光探針的合成

1.2.1DTPA-cs124的合成35.7 mg(0.1 mmol)DTPAA 加入5 mL DMF中，室溫攪拌直至澄清，然后加入100 μL 干燥的三乙胺。17.4 mg cs124(0.1 mmol)溶于2 mL干燥DMF中，然后將cs124的溶液緩慢滴加到DTPAA溶液中，混合后常溫攪拌10 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入乙醚沉淀析出產(chǎn)物DTPA-cs124，將得到的產(chǎn)物真空干燥，低溫避光保存。

1.2.2cs124-DTPA-NH-PEG-DBI的合成將10 mL溶有DTPA-PEG -DBI(400 mg，0.1 mmol)干燥CH2Cl2溶液緩慢滴加入上述DTPA-cs124的DMF溶液中，待溶液滴加完畢后，常溫下攪拌24 h。往反應(yīng)完畢后的溶液中加入乙醚沉淀出產(chǎn)物后4 000 r/min離心，固體用少量CH2Cl2/DMF/乙醚(1/1/5，V/V/V)洗滌3次，產(chǎn)物真空干燥，低溫避光保存。

1.2.3cs124-DTPA-NH-PEG-DBI∶Tb的合成37.4 mg(0.1 mmol)TbCl3·6H2O用乙醇溶解后，緩慢滴加到等摩爾量的cs124-DTPA-NH-PEG -DBI的溶液中，待液體滴加完畢后，常溫下攪拌12 h。反應(yīng)完畢后加入乙醚沉淀出產(chǎn)物，4 000 r/min離心，固體用少量CH2Cl2/DMF/乙醚(1/1/5，V/V/V)洗滌3次，產(chǎn)物真空干燥，低溫避光保存。

1.2.4cs124-DTPA-NH-PEG-DBI-Fe3O4∶Tb的合成在Fe3O4納米粒子的正己烷存儲液中加乙醇離心得到固態(tài)Fe3O4納米粒子，真空干燥后稱取20 mg，用5 mL CHCl3分散，cs124-DTPA-NH-PEG -DBI∶Tb(100 mg)溶于10 mL CHCl3，將Fe3O4的氯仿溶液緩慢滴加到cs124-DTPA-NH-PEG -DBI∶Tb，室溫下攪拌24 h。待反應(yīng)結(jié)束后加石油醚沉淀出產(chǎn)物，4 000 r/min離心，固體用少量乙醇/DMF/石油醚(1/1/5,V/V/V)洗滌3次，產(chǎn)物再分散在水中，透析24 h除去游離的有機(jī)物，透析后低溫避光保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 Tb3+配合物修飾磁性納米熒光探針對Cu2+的檢測原理

設(shè)計合成的Tb3+配合物修飾磁性Fe3O4納米復(fù)合熒光探針cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb，其中配合物的發(fā)光是基于“天線效應(yīng)”，即7-氨基-4-甲基喹諾酮(cs124)作為吸收光源的天線分子，氨基多羧酸螯合劑(DTPA)與Tb3+配位后，通過分子內(nèi)的能量轉(zhuǎn)移，cs124將吸收的能量傳遞給中心的Tb3+，敏化增強(qiáng)了Tb3+的發(fā)光，從而使cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb復(fù)合熒光探針表現(xiàn)Tb3+的特征光譜。Fe3O4磁性納米粒子表面修飾有PEG聚合物，使得整個復(fù)合熒光探針的水溶性良好，能夠?qū)崿F(xiàn)在水溶液中對金屬離子的熒光檢測。

氨基多羧酸螯合劑有良好的水溶性，而且與Cu2+有很高的結(jié)合常數(shù)[16]。實驗中發(fā)現(xiàn)，在Cu2+存在下cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb的熒光猝滅，并且該納米探針可用于Cu2+的超靈敏和專一性檢測，檢測限可低到1 nmol/L。因此我們推測，Tb3+與Cu2+和配體DTPA的結(jié)合常數(shù)不同，可發(fā)生離子交換后生成非熒光的納米復(fù)合物。即cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb復(fù)合熒光探針中的Tb3+被Cu2+置換，形成非熒光物質(zhì)cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Cu，導(dǎo)致Tb3+的特征熒光猝滅，并且熒光強(qiáng)度的變化與Cu2+的濃度變化有關(guān)。復(fù)合熒光探針檢測Cu2+的原理見圖1。

透射電鏡(TEM)(圖2)顯示，磁性Fe3O4修飾前后粒徑形貌幾乎沒有變化，表明此方法修飾合成的納米熒光復(fù)合物具有良好的穩(wěn)定性。

2.2 pH對cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb檢測Cu2+的影響

為拓展這種探針對Cu2+檢測的適用范圍，分別測試了無Cu2+、含11 μmol/L Tb3+的cs124-DTPA-NH-PEG -DBI∶Tb、含11 μmol/L Tb3+的cs124-DTPA-NH-PEG -DBI∶Tb和10 μmol/L Cu2+，于不同pH值下，在發(fā)射波長為545 nm下的熒光強(qiáng)度。pH值(3.0～11.0)用HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)。從圖3可以看出，cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb的熒光強(qiáng)度(圖3a)在pH=5.0～10.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定。而cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb 與Cu2+作用后的熒光強(qiáng)度(圖3b)在pH=4.0～10.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定。因此，探針以及探針檢測金屬離子的過程在較寬pH范圍(5.0～10.0)內(nèi)是穩(wěn)定的。說明該探針可以實現(xiàn)對實際樣品中Cu2+的檢測。

2.3 反應(yīng)時間對cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb檢測Cu2+的影響

作為一個能實際使用的熒光探針，除了高的靈敏度和選擇性外，其對分析物的響應(yīng)時間也是衡量其性能優(yōu)越的一個重要指標(biāo)。在Tris-HCl緩沖溶液中，測試10 μmol/L Cu2+溶液和含11 μmol/L Tb3+的cs124-DTPA-NH-PEG -DBI∶Tb混合后，于不同反應(yīng)時間下cs124-DTPA-NH-PEG -DBI∶Tb的熒光強(qiáng)度。由圖4可以看出，cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb對Cu2+響應(yīng)時間迅速，在大約1.5 min的時間內(nèi)，探針與Cu2+的響應(yīng)就能夠達(dá)到平衡。

2.4 cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb的熒光滴定及對Cu2+的檢測限

為了驗證所合成的納米探針在水溶液中對Cu2+的檢測能力，把不同量的Cu2+加入到cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb(11 μmol/L Tb3+)的水溶液中。從圖5可以看出，在水溶液體系中，隨著Cu2+的濃度(1 μmol/L至100 μmol/L)不斷增大，cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb的熒光猝滅，發(fā)射峰強(qiáng)度不斷降低。且 Cu2+的濃度在1～15 nmol/L范圍時(圖5)，cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb在發(fā)射波長為545 nm下的熒光強(qiáng)度對Cu2+的濃度線性關(guān)系良好，線性方程為:y=518.34-1.68x,相關(guān)系數(shù)R2=0.9698，因此，cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb對Cu2+的檢測限可達(dá)到1 nmol/L。此檢測限明顯低于美國環(huán)保局規(guī)定的Cu2+的最低濃度。

2.5 cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb的離子選擇競爭

為了證明此探針在其他離子存在下對Cu2+仍然有很高的選擇性，在含Tb3+為11 μmol/L 的cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb的溶液中，加入100 μmol/L Cu2+和100 μmol/L其他陽離子，檢測cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb在每種離子存在時在發(fā)射波長為545 nm下的熒光強(qiáng)度變化。圖6中黑色棒狀數(shù)據(jù)顯示的是cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb對各種離子的選擇性。從圖中可以看出，每一種金屬離子單獨加入到該納米探針溶液后，只有Cu2+能夠較多的猝滅該探針，而其他離子的對探針猝滅較小。當(dāng)將Cu2+加入到其他金屬離子和探針的混合溶液后，得到的數(shù)據(jù)用灰色棒狀表示，發(fā)現(xiàn)探針的熒光強(qiáng)度降低，因此，相對其他陽離子來說，cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb對Cu2+選擇性好。說明此探針在有其它離子存在時，對Cu2+的檢測具有很強(qiáng)的抗干擾能力。

3 結(jié)論

本文合成了一種稀土Tb3+配合物修飾的磁性Fe3O4納米復(fù)合熒光探針(cs124-DTPA-NH-PEG -DBI-Fe3O4∶Tb)。該探針可以選擇性地檢測水中Cu2+。且這一納米探針可在較寬的pH范圍(5～10)內(nèi)穩(wěn)定檢測Cu2+，靈敏度高，檢測限達(dá)到1 nmol/L?；谝陨咸攸c，該探針對環(huán)境中污染物的檢測和除去，以及生物體系中的分析和檢測中有十分廣泛的應(yīng)用前景。