馬 維，黃泓軻，王玉婷，閔 清，祝曉慶，王 詩*

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧 437100；2.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，四川樂山 614000；3.武漢市普愛醫(yī)院，湖北武漢 430072)

雌二醇(E2)是育齡婦女體內(nèi)卵巢或黃體分泌的受體水平活性最高的雌激素，其濃度的過高或過低都會(huì)導(dǎo)致生殖及內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，因此準(zhǔn)確地測(cè)定E2濃度對(duì)于相關(guān)疾病的診斷和治療具有極其重要的意義[1,2]。目前用于E2測(cè)定的方法以免疫分析法[3]和高效液相色譜[4]最為常用，但免疫法由于靈敏度、選擇性以及試劑污染、假陽性等因素制約了其應(yīng)用；而色譜法則對(duì)技術(shù)要求高，預(yù)處理繁瑣。近年來研究者利用傳感器對(duì)E2進(jìn)行測(cè)定，如蛋白A與聯(lián)硫基二(琥珀酰亞胺丙酸鹽)修飾電化學(xué)免疫傳感器[5]、蛋白A-納米金-絲網(wǎng)印刷免疫傳感器[5]、納米金/巰基蛋白G修飾金電極免疫傳感器[7]，以及在絲印碳電極上固定抗體(兔抗小鼠IgG和單克隆小鼠抗-E2)[8]檢測(cè)E2。然而免疫傳感器制備工藝比較復(fù)雜，影響穩(wěn)定性和一致性的因素較多，會(huì)影響檢測(cè)導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確，臨床使用面臨重現(xiàn)性差的問題。

本研究采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)制備絲印傳感器，修飾多壁碳納米管(MWCNTs)-十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，用于大鼠血樣中E2的直接測(cè)定。該電極能夠滿足生物樣本中E2的測(cè)定，減少了前處理過程，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量、連續(xù)、便捷的診斷目的，在臨床診斷方面具有應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器、試劑及受試動(dòng)物

CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；實(shí)驗(yàn)室用多功能絲網(wǎng)印刷設(shè)備(珠海凱為電子元器件有限公司)；pHS-3E酸度計(jì)(上海雷磁)；KQ-100E超聲波清洗器(昆山舒美)；SPM-9500J3掃描探針顯微鏡(Japan,Shimadzu);Quanta200 掃描電鏡(Holland,FEI);JFC1600精鍍儀(Japan,JEOL)。

雌二醇(E2，阿拉丁)；多壁碳納米管(MWCNTs,中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所)；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB,Amresco)；血清雌二醇(E2)-放免試劑(RIA)(南京建成)；絲印碳油墨(Acheson)；銀油墨(Acheson)；Ag/AgCl油墨(徐州英劍納米科技有限公司)；絕緣油墨(JUJO)；PVC片材(上海新立醫(yī)療器械有限公司)，其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

SPF級(jí)雌性KM小鼠，體重17～20 g；雌性SD大鼠，體重180～240 g，購自湖北省疾控中心。

1.2 MWCNTs-CTAB/SPE的制備

利用絲網(wǎng)印刷技術(shù)于PVC基材表面逐層套印導(dǎo)電銀軌、工作電極、輔助電極、Ag/AgCl參比電極后，置溫度70 ℃烘箱中烘干，最后印刷絕緣層，紫外烘干，得到絲印電極(SPE)[9]。

CTAB溶于蒸餾水中配制成CTAB溶液，再加入MWCNTs，多次超聲分散后使MWCNTs/CTAB修飾液分散均勻。移液器吸取MWCNTs-CTAB修飾液滴涂于工作電極表面，于室溫自然干燥得到MWCNTs-CTAB/SPE，儲(chǔ)存于干燥器中，備用。

1.3 MWCNTs-CTAB/SPE在生物樣本中的應(yīng)用

1.3.1MWCNTs-CTAB/SPE特異性實(shí)驗(yàn)SD大鼠隨機(jī)分為空白組(生理鹽水)，E2低劑量(0.18 mg/kg)、中劑量(0.9 mg/kg)及高劑量(4.5 mg/kg)組，每組6只，腹腔給藥后，分別于6、12、18、21、22 、23、26、32及48 h采用眼底靜脈采血，EP管采用EDTA-Na2抗凝處理。將100 μL血樣加入到100 μL的0.1 mol/L的Na2CO3-硼砂緩沖液(pH=12)中，采用MWCNTs-CTAB/SPE測(cè)定血樣中E2含量。48 h后處死大鼠，取出卵巢和子宮，稱重臟器與體重并記錄臟器指數(shù)。

1.3.2不同方法測(cè)定血樣中E2KM小鼠摘眼球取血，SD大鼠眼底靜脈采血，EP管采用EDTA-Na2抗凝處理。100 μL血樣加入到100 μL的0.1 mol/L的Na2CO3-硼砂緩沖液(pH=12)中，采用MWCNTs-CTAB/SPE測(cè)定血樣中E2含量。血樣中分別加入1.0×10-10、3.0×10-10和5.0×10-10mol/L的E2，計(jì)算加標(biāo)回收率。將E2標(biāo)準(zhǔn)品、血清樣品、標(biāo)記物和抗體按放免試劑盒規(guī)定依次加入試管中，混勻，37 ℃水浴1 h，待反應(yīng)平衡后，加入分離劑，充分混勻，室溫10 min，將各管插入γ放射免疫計(jì)數(shù)器上放置10 min，棄掉上清液，測(cè)各管沉淀的放射性計(jì)數(shù)(CPM)。

1.4 E2的電化學(xué)測(cè)定方法

采用電化學(xué)工作站，以MWCNTs-CTAB/SPE測(cè)定E2，電解液為含不同濃度E2的0.1 mol/L的Na2CO3-硼砂緩沖液(pH=12)。在-1.0～1.0 V(vs.Ag/AgCl)范圍進(jìn)行循環(huán)伏安法(CV)掃描，在-0.8～0.8 V(vs.Ag/AgCl)范圍進(jìn)行方波伏安法(SWV)掃描，測(cè)定不同濃度的E2，確定峰電流與其濃度的關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPE表征

通過掃描電鏡(SEM)分別對(duì)未修飾電極和修飾電極(MWCNTs-CTAB/SPE)進(jìn)行表征。未經(jīng)過修飾的工作電極表面的碳墨顆粒相互間關(guān)聯(lián)較少，整體結(jié)構(gòu)疏松，凹凸不平(圖2A)；經(jīng)過修飾后，工作電極表面布滿MWCNTs，由于工作電極表面電化學(xué)特性得到改變，反應(yīng)比表面積也增大，進(jìn)而有利于電子在工作電極表面?zhèn)鬟f，有利于E2在電極表面富集(圖2B)。MWCNTs-CTAB/SPE在原子力掃描電鏡(AFM)下進(jìn)行觀察。由圖2C可以看出，未修飾的工作電極表面起伏大，分布不均勻；經(jīng)過修飾的工作電極表面變得平滑，MWCNTs-CTAB在其表面分散良好。

2.2 E2在MWCNTs-CTAB/SPE上的電化學(xué)特性

采用循環(huán)伏安法(CV)考察E2在裸SPE(bare SPE)、MWCNTs修飾SPE(MWCNTs/SPE)、CTAB修飾SPE(CTAB/SPE)和MWCNTs-CTAB修飾SPE(MWCNTs-CTAB/SPE)表面的電化學(xué)響應(yīng)。如圖3所示，未修飾的電極對(duì)E2電化學(xué)響應(yīng)較小，在0.166 V附近出現(xiàn)氧化峰，未出現(xiàn)還原峰；相同條件下，MWCNTs修飾的電極，由于MWCNTs由于自身良好的導(dǎo)電性能，大的比表面積，顯著提高了E2的峰電流，加速其電子轉(zhuǎn)移，氧化峰電位移動(dòng)至0.111 V，在-0.562 V出現(xiàn)還原峰；CTAB修飾的電極，由于CTAB與E2的疏水相互作用，雖然氧化峰電位移動(dòng)至0.235 V，但E2在電極表面的氧化峰電流也明顯增大；在CTAB的作用下MWCNTs分散均勻，并對(duì)MWCNTs起固定作用[10]。MWCNTs起到加快異相界面電子傳遞速率的作用[11]，對(duì)E2的催化活性也逐漸增加，導(dǎo)致MWCNTs-CTAB修飾電極上E2的氧化峰電流得到了顯著的提高。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的影響

2.3.1緩沖溶液的影響采用循環(huán)伏安法考察E2分別在NaH2PO4-檸檬酸、Na2CO3-NaHCO3、Na2HPO4-NaH2PO4、HAc-NaAc、NaOH-硼砂等不同種類緩沖液中在MWCNTs-CTAB/SPE表面的電化學(xué)響應(yīng)。在0.1 mol/L 的Na2CO3-硼砂緩沖液中氧化峰峰形較好、峰電流較大?？疾觳煌琾H值0.1 mol/L Na2CO3-硼砂緩沖液中E2的電化學(xué)響應(yīng)。結(jié)果表明，在堿性條件下，E2氧化峰峰形較好，且無雜峰干擾，當(dāng)緩沖液pH值為7～12時(shí)，E2的峰電流隨著緩沖液pH值的增大而增大，電位隨pH升高而向負(fù)電位方向移動(dòng)。當(dāng)緩沖液pH值為12時(shí)，峰電流最大，靈敏度最高。故選擇pH值為12的0.1 mol/L Na2CO3-硼砂緩沖液為測(cè)定介質(zhì)。

2.3.2掃描速率對(duì)E2電化學(xué)響應(yīng)的影響在不同掃描速率下用循環(huán)伏安法測(cè)定E2在MWCNTs-CTAB/SPE表面的電化學(xué)響應(yīng)。由圖4可以看出，隨著掃描速度的增加，峰電流增加。在20～300 mV/s 范圍內(nèi)，峰電流與掃描速率成正比；隨掃描速率的增加，峰電位正移，氧化峰電流ip與掃描速度平方根v1/2存在良好的線性關(guān)系，說明E2在電極上的氧化過程受擴(kuò)散控制。

2.3.3修飾劑用量的影響實(shí)驗(yàn)表明隨MWCNTs-CTAB的濃度逐漸增加，E2的峰電流逐漸增加，但濃度超過0.5 mg/mL時(shí)，峰電流反而變小，故本實(shí)驗(yàn)選擇MWCNTs-CTAB的濃度為0.5 mg/mL。同時(shí)，0.5 mg/mL MWCNTs-CTAB修飾劑用量從1.0 μL增加到3.0 μL時(shí)，E2的峰電流隨著修飾量增加而顯著增大，這是基于電極表面催化活性位點(diǎn)增多。當(dāng)修飾劑量再增加至5.0 μL時(shí)，峰電流反而降低。此時(shí)，電極表面的膜達(dá)到一定的厚度，已超過最佳負(fù)載量從而阻礙了E2在電極表面的氧化反應(yīng)。故本實(shí)驗(yàn)的修飾劑選擇為0.5 mg/mL MWCNTs-CTAB，用量2.0 μL。

2.3.4SWV測(cè)定條件優(yōu)化采用SWV法進(jìn)一步探討E2在MWCNTs-CTAB/SPE表面的方波伏安特性?？疾炝瞬煌瑨呙桀l率(10、15、20、25、30 Hz)下E2的SWV曲線。隨著掃描頻率的增加，E2的峰電流逐漸增大，超過20 Hz，峰電流減小(圖5A)；在不同電位增幅(8，10，12，14，16 mV)下，SWV測(cè)定E2，隨著電位增幅的增加，E2峰電流逐漸增大，超過12 mV，峰電流減小(圖5B)。因此SWV法的測(cè)定條件經(jīng)過優(yōu)化為起始電位:-0.8 V,終止電位:0.8 V,電位增量：12 mV,振幅:25 mV,頻率：10 Hz。

2.4 工作曲線和檢測(cè)限

在0.1 mol/L的Na2CO3-硼砂緩沖溶液(pH=12)中，采用SWV法制作E2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其曲線方程為：ip(μA)=2.147c(10-8mol/L)+0.0430，R=0.9968。E2的氧化峰電流與其濃度在5.0×10-10～1.0×10-8mol/L時(shí)呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為5.0×10-11mol/L。

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

E2在0.31 V附近產(chǎn)生一個(gè)氧化峰，通過在測(cè)定體系中逐步加入雌酮(E1)及雌三醇(E3)，發(fā)現(xiàn)E1和E3均會(huì)在附近產(chǎn)生一個(gè)疊加的氧化峰，從而對(duì)E2的測(cè)定產(chǎn)生干擾。由于E1、E2和E3在結(jié)構(gòu)上存在很大的相似性，因此E1和E3對(duì)生物樣品中E2的測(cè)定產(chǎn)生一定的干擾。但是由于生物血樣中雌激素主要以E2為主，E1和E3的含量相對(duì)較低，而且E1主要存在于絕經(jīng)婦女體內(nèi)，E3主要存在于妊娠期婦女體內(nèi)，因而E1和E3對(duì)于常規(guī)的血樣中E2的測(cè)定不會(huì)造成干擾。其他100倍的金屬離子如Zn2+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+無氧化還原峰，基本上不干擾E2的測(cè)定(誤差<5%)。

2.6 精密度和穩(wěn)定性

隨機(jī)抽取同一批次與不同批次制備的MWCNTs-CTAB/SPE，分別測(cè)定1.0×10-10mol/L、5.0×10-10mol/L、10×10-10mol/L E2。同一批次相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=5)分別為4.74%、4.43%、5.26%；不同批次的RSD分別為7.09%、6.35%、6.10%。將制備好的MWCNTs-CTAB/SPE置于干凈無塵的塑料袋中，4 ℃干燥保存，3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，E2的測(cè)定基本不受影響。

2.7 MWCNTs-CTAB/SPE在生物樣本中的應(yīng)用

2.7.1MWCNTs-CTAB/SPE特異性實(shí)驗(yàn)給予大鼠注射外源性E2后，大鼠體內(nèi)的E2含量呈現(xiàn)規(guī)律性變化，在22 h附近達(dá)到最大吸收峰。分別給予大鼠注射低、中、高劑量的E2后，大鼠體內(nèi)的E2濃度表現(xiàn)出較好的量效關(guān)系，說明MWCNTs-CTAB/SPE能特異性地測(cè)定血樣中的E2(圖6A)。通過計(jì)算大鼠卵巢和子宮臟器指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同空白對(duì)照組大鼠卵巢和子宮臟器(圖6B)相比，給予低劑量E2(0.18 mg/kg)的大鼠卵巢和子宮臟器指數(shù)出現(xiàn)明顯增加，子宮壁明顯增厚，這可能是E2促進(jìn)了子宮細(xì)胞增生；給予中劑量E2(0.9 mg/kg)的大鼠卵巢和子宮臟器指數(shù)略微增長(zhǎng)，和對(duì)照組無明顯差異；給予高劑量E2(4.5 mg/kg)的大鼠卵巢和子宮臟器指數(shù)反而下降，子宮出現(xiàn)一定程度的萎縮，這可能是高濃度的E2抑制了子宮的機(jī)能(圖6C)。

2.7.2MWCNTs/CTAB/SPE測(cè)定不同血樣中E2的含量分別利用MWCNTs/CTAB/SPE測(cè)定大鼠及小鼠血樣中E2含量，在上述基礎(chǔ)上，繼續(xù)增加E2濃度。隨著E2濃度的升高，峰電流值與濃度呈線性關(guān)系，加樣標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.9941與0.9933。計(jì)算得到大鼠血中的E2含量為7.91×10-10mol/L，小鼠血中的雌二醇含量為2.24×10-9mol/L。

2.7.3不同方法測(cè)定小鼠血樣中E2的含量采用MWCNTs/CTAB/SPE和RIA法分別測(cè)定小鼠血清中E2，再加入不同濃度 E2溶液測(cè)定加樣回收率?；厥章蕼y(cè)定結(jié)果見表1。

表1 小鼠血樣中E2回收率測(cè)定(n=5)

3 結(jié)論

MWCNTs-CTAB/SPE制備簡(jiǎn)單，制備工藝容易標(biāo)準(zhǔn)化，便于進(jìn)行質(zhì)量控制以及長(zhǎng)期保存。通過給予大鼠注射外源性E2后，在22 h附近達(dá)到最大吸收峰，并且濃度變化曲線與給藥量表現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。另外通過計(jì)算大鼠子宮和卵巢臟器指數(shù)，發(fā)現(xiàn)低劑量E2能促進(jìn)子宮壁加厚，高劑量的E2反而導(dǎo)致子宮萎縮。以上結(jié)果表明MWCNTs-CTAB/SPE對(duì)生物樣本中的E2具有足夠的靈敏度，能夠直接用于生物樣本的測(cè)定，可以成為進(jìn)行E2相關(guān)性研究和藥物篩選及臨床診斷輔助的有效工具。