水春雨

(中國(guó)鐵道科學(xué)研究院節(jié)能環(huán)保勞衛(wèi)研究所，北京　100081)

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曝氣生物流化床反應(yīng)器處理動(dòng)車集便器污水脫氮及微生物研究

水春雨

(中國(guó)鐵道科學(xué)研究院節(jié)能環(huán)保勞衛(wèi)研究所，北京100081)

應(yīng)用好氧曝氣生物流化床反應(yīng)器處理動(dòng)車集便器糞便污水，研究反應(yīng)器同步硝化反硝化脫氮效果；考察不同影響因素條件下反應(yīng)器脫氮效果。結(jié)果表明：反應(yīng)器能夠較好地同時(shí)實(shí)現(xiàn)硝化和反硝化兩個(gè)過(guò)程；DO為2.5 mg/L時(shí)，同步硝化反硝化脫氮效果最佳；最佳pH值范圍為7.0～8.0；反應(yīng)器在C/N比為1.6時(shí)脫氮效果較好；溫度在18～25 ℃變化，對(duì)反應(yīng)器脫氮效能影響不明顯；微生物DNA純度高，氨氧化細(xì)菌的生物多樣性高。

同步硝化反硝化；糞便污水處理；脫氮；微生物

隨著環(huán)境保護(hù)意識(shí)逐漸加強(qiáng)，我國(guó)列車糞便由沿線直排式轉(zhuǎn)變?yōu)榻y(tǒng)一收集處理[1]；相比其他糞便污水水質(zhì)，鐵路動(dòng)車集便器糞便污水水質(zhì)具有氨氮濃度高、C/N值低，處理難度大等特點(diǎn)[2]。如何處理鐵路動(dòng)車集便器糞便污水中的高氨氮，使其達(dá)標(biāo)排放，成為鐵路環(huán)保面臨的新課題。

目前關(guān)于有效處理糞便污水已做了大量研究，Junzo等[3]采用光化學(xué)菌結(jié)合好氧的方法處理糞便廢水，Hiroki等[4]研究了間歇曝氣對(duì)糞便污水生物脫氮的影響，結(jié)果表明，曝氣和缺氧運(yùn)行的時(shí)間比影響N2O產(chǎn)量，外加碳源可減少N2O產(chǎn)量。傳統(tǒng)的生物脫氮工藝在污水脫氮方面起到了一定的作用，但系統(tǒng)存在難以維持較高的硝化菌濃度，且須同時(shí)進(jìn)行污泥回流和硝化液回流等問(wèn)題[5]。Klangduen等[6]研究發(fā)現(xiàn)在同一反應(yīng)器中同步發(fā)生，能同步實(shí)現(xiàn)硝化反硝化脫氮反應(yīng)并去除有機(jī)物，并且能有效維持反應(yīng)器中pH值穩(wěn)定且無(wú)需回流，在深度脫氮技術(shù)中逐漸得到重視。

研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)控制各種影響因素條件，可以在污泥絮體中或生物膜內(nèi)同時(shí)形成好氧和缺氧微環(huán)境，有利于反應(yīng)進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)考察了DO、C/N比、溫度和pH值等因素對(duì)曝氣生物流化床反應(yīng)器同步硝化反硝化脫氮的影響，并研究了氨氧化菌生物多樣性。

1　實(shí)驗(yàn)儀器與材料及方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器、材料

分光光度計(jì)(ND-1000)，水溫計(jì)，pH計(jì)，變阻電爐、酸式滴定管，JHE-2型微生物載體。四級(jí)串聯(lián)曝氣生物流化床反應(yīng)器如圖1所示。

圖1　曝氣生物流化床反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)裝置示意

實(shí)驗(yàn)用水取自動(dòng)車段密閉式廁所糞便污水，水質(zhì)情況如表1所示。

表1　實(shí)驗(yàn)水質(zhì)情況

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取實(shí)驗(yàn)

稱取一定質(zhì)量的流化床反應(yīng)器中的生物載體放入100 mL超純水中，超聲波振蕩30 min后，取出載體，將懸浮溶液于8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，棄去上清液，用PBS緩沖液洗滌離心后的沉淀物，再離心、棄去上清液，取0.5 g沉淀物，用Fast Soil DNA提取試劑盒提取樣品中的總DNA。采用Nano-drop分光光度計(jì)測(cè)定提取的總DNA。

1.2.2氨氧化細(xì)菌amoA特異性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)

采用氨氧化細(xì)菌氨單加氧酶的特異性引物amoA-1F/ amoA-2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為491bp。

amoA-1F∶5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′；

amoA-2R∶5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′。

擴(kuò)增體系為(50 μL)：10×buffer5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，正反向引物(濃度為10 mmol/L)各1 μL，BSA0.5 μL，Taq酶(2.5U)0.25 μL，稀釋DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃，5 min；變性：94 ℃，1 min；退火：60 ℃，1 min；延伸：72 ℃，1 min；循環(huán)30個(gè)周期：72 ℃，5 min；4 ℃恒溫。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1DO的影響

實(shí)驗(yàn)進(jìn)水水質(zhì)為：COD濃度8 000 mg/L左右，氨氮濃度3 400 mg/L左右，總氮濃度5 100 mg/L左右，pH值8.5～9.0，HRT 18 h，溫度22 ℃，調(diào)整溶解氧濃度(DO)，考察不同DO對(duì)反應(yīng)器同步硝化反硝化脫氮效果的影響，如圖2所示。

圖2　DO對(duì)同步硝化反硝化脫氮效果的影響

由圖2可以看出，一級(jí)曝氣生物流化床反應(yīng)器對(duì)氨氮去除率達(dá)77.5%、TN去除率達(dá)63.1%左右，曝氣生物流化床反應(yīng)器中存在顯著的同步硝化反硝化現(xiàn)象。當(dāng)DO從1.5 mg/L升高至2.5 mg/L時(shí)，氨氮去除率隨著DO的升高而增加；繼續(xù)增加DO量，氨氮和總氮去除率有所降低；當(dāng)DO為2.5 mg/L時(shí)，總氮的去除率達(dá)到最高，反應(yīng)器中取得了最好的脫氮效果，氨氮去除率為77.5%，總氮去除率為63.1%。

由圖2可以看出，在較高DO濃度為3 mg/L時(shí)，反應(yīng)器脫氮效果下降，繼續(xù)增加溶解氧濃度到4.0 mg/L時(shí)，氨氮去除率74.8%，總氮的去除率仍能達(dá)到57.9%，反應(yīng)器也能達(dá)到較好的同步硝化反硝化脫氮效果；原因可能是一方面實(shí)驗(yàn)選用的生物載體填料表面呈波紋狀、凹凸不平，在表面凹陷處易形成較厚生物膜，溶解氧不易穿透至生物膜最深處，從而在生物膜最內(nèi)側(cè)形成厭氧微環(huán)境[7，8]；另一方面DO值高，大的曝氣量增加了對(duì)混合液的吹脫，而一級(jí)反應(yīng)器內(nèi)混合液pH值在8.5以上，呈堿性，存在游離氨，易被吹脫出去，增大脫氮效果。本實(shí)驗(yàn)將DO控制在2.5 mg/L左右，硝化速率和反硝化速率更加接近，總氮的去除效果較好。

2.2C/N比的影響

有機(jī)碳是微生物能量代謝的主要來(lái)源，在異養(yǎng)反硝化過(guò)程中，有機(jī)碳起著相當(dāng)重要的作用[9]。氨氮除了為細(xì)胞提供同化合成氮源外，還是硝化菌生長(zhǎng)的能源，脫氮效率與進(jìn)水C/N比有關(guān)，C/N比影響生物硝化速率[10]。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)水水質(zhì)為：原水COD濃度8 000 mg/L左右，氨氮濃度3 400 mg/L左右，總氮濃度5 100 mg/L左右，pH值8.5～9.0，HRT18h，實(shí)驗(yàn)中DO為2.5 mg/L，通過(guò)向原水中投加葡萄糖，配制不同C/N比值的污水，考察不同的C/N(COD/TN)比對(duì)反應(yīng)器同步硝化反硝化脫氮的影響，見(jiàn)表2。

表2　C/N比對(duì)同步硝化反硝化脫氮效果的影響

由表2可以看出，在實(shí)驗(yàn)條件下，C/N比對(duì)氨氮去除率影響不大；原因是流化床反應(yīng)器污泥齡(SRT)時(shí)間長(zhǎng)，載體生物膜中能夠存活世代時(shí)間較長(zhǎng)的微生物，有利于硝化反應(yīng)進(jìn)行，提高C/N比沒(méi)有對(duì)硝化反應(yīng)產(chǎn)生較大的影響[11]。隨著C/N比的提高，總氮去除效率升高；原因是隨著C/N比的提高，反硝化過(guò)程所需要提供的有機(jī)碳源更加充足，利于反硝化反應(yīng)[12]。在進(jìn)水氨氮濃度3 478.8 mg/L、C/N比值1.6的條件下，一級(jí)反應(yīng)器取得了74.4%的氨氮去除率，61.2%的總氮去除率，反應(yīng)器在低C/N比條件下表現(xiàn)出良好的同步硝化反硝化脫氮性能；后期實(shí)驗(yàn)選擇C/N比值為1.6。

2.3pH值的影響

pH值是影響硝化反應(yīng)的重要因素，硝化細(xì)菌對(duì)pH值十分敏感[13]。在不補(bǔ)充堿度的情況下，隨著硝化反應(yīng)的進(jìn)行，pH值會(huì)迅速降低。保持其他反應(yīng)條件不變，向第四級(jí)反應(yīng)器投加氫氧化鈉溶液，調(diào)整反應(yīng)器內(nèi)混合液pH值，考察不同pH值對(duì)反應(yīng)器同步硝化反硝化的影響。第四級(jí)反應(yīng)器進(jìn)水水質(zhì)情況為：COD 900 mg/L左右，TN 1 200 mg/L左右，氨氮90 mg/L左右，考察不同pH值條件下對(duì)反應(yīng)脫氮的效果影響，見(jiàn)表3。

表3　pH對(duì)反應(yīng)器同步硝化反硝化脫氮效果的影響

由表3可以看出，pH值從7.0下降到6.0時(shí)，氨氮和總氮去除率均下降，降低pH值影響到硝化菌和反硝化菌的增殖和活性，硝化反應(yīng)和反硝化反應(yīng)受到抑制；當(dāng)pH值從6.0回升到7.0時(shí)，氨氮和總氮的去除率均回升至原處理水平，表明較低的pH值會(huì)抑制硝化細(xì)菌和反硝化菌的活性，短期內(nèi)沒(méi)有對(duì)硝化細(xì)菌和反硝化菌發(fā)生毒害作用。pH值從7.0上升到8.0時(shí)，氨氮和總氮去除率基本保持穩(wěn)定，Antoniou等[14]研究表明硝化過(guò)程中pH值在7.0～8.0范圍內(nèi)對(duì)硝化速率影響較少。

反應(yīng)器中對(duì)TN去除效率均較低，這主要是因?yàn)槠銫/N比較低，只有0.75左右，不能滿足反硝化反應(yīng)對(duì)碳源的需求。硝化反應(yīng)中，每氧化1 g氨氮需要消耗堿度7.14 g(以CaCO3計(jì))，而反硝化反應(yīng)中，每還原1 g NO3—N將產(chǎn)生3.57 g堿度。在同一反應(yīng)器中發(fā)生同步硝化反硝化反應(yīng)時(shí)，反硝化反應(yīng)產(chǎn)生的堿度可以部分補(bǔ)充硝化反應(yīng)消耗的堿度。由于糞便污水pH值較高，原水存在一定的堿度，需要額外補(bǔ)充的堿度少[15]。實(shí)驗(yàn)研究表明，在曝氣生物流化床反應(yīng)器中，實(shí)現(xiàn)同步硝化反硝化的最佳pH值范圍應(yīng)控制在7.0～8.0。本實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行4個(gè)月，前兩級(jí)反應(yīng)器在未曾補(bǔ)充堿度的情況下，一級(jí)反應(yīng)器pH值穩(wěn)定在8.4左右，二級(jí)反應(yīng)器pH值穩(wěn)定在7.5左右，pH值能夠穩(wěn)定維持在偏堿性。原因是：一方面，前兩級(jí)反應(yīng)器對(duì)氨氮去除率90%左右，總氮去除率65%左右，這一去除量已經(jīng)大大超出了細(xì)菌對(duì)TN的同化作用去除量，推斷出曝氣生物流化床反應(yīng)器中發(fā)生了比較充分的同步硝化反硝化反應(yīng)，反硝化反應(yīng)產(chǎn)生的堿度部分補(bǔ)充了硝化反應(yīng)消耗的堿度[16]；另一方面，動(dòng)車集便器糞便污水pH值高，在9.0以上，可為硝化反應(yīng)補(bǔ)充提供部分堿度。

2.4溫度的影響

在影響微生物生理活動(dòng)的各項(xiàng)因素中，溫度的作用非常重要。研究表明，硝化反應(yīng)的最適溫度20～30 ℃，反硝化反應(yīng)最適溫度20～40 ℃，溫度低于15 ℃，反硝化菌和硝化菌增殖和代謝速率均降低，溫度高于30 ℃，硝化菌活性受到抑制[17]。實(shí)驗(yàn)期間除進(jìn)水濃度有所波動(dòng)外，原水COD濃度8 000 mg/L左右，氨氮濃度3 400 mg/L左右，總氮濃度5 100 mg/L左右，pH值8.5～9.0，HRT 18 h，實(shí)驗(yàn)中DO為2.5 mg/L，考察在不同水溫條件下氨氮和總氮的去除效果影響，見(jiàn)圖3。

圖3　溫度對(duì)反應(yīng)器同步硝化反硝化脫氮效果的影響

由圖3可以看出，四級(jí)反應(yīng)器對(duì)氨氮總?cè)コ?9.6%～99.9%，TN的總?cè)コ?2.2%～87.1%，溫度在18～25 ℃波動(dòng)，對(duì)反應(yīng)器中硝化反應(yīng)及反硝化反應(yīng)影響不明顯，反應(yīng)器對(duì)氨氮、TN去除率均比較穩(wěn)定；原因是：一方面，溫度在18～25 ℃，基本在硝化菌和反硝化適應(yīng)溫度范圍；另一方面，四級(jí)反應(yīng)器總水力停留時(shí)間較長(zhǎng)(HRT 72 h)，使得同步硝化反硝化反應(yīng)充分進(jìn)行[18]。

2.5DNA提取結(jié)果

采用FAST試劑盒提取DNA，操作簡(jiǎn)便，DNA的純度高，腐殖質(zhì)和其他雜質(zhì)含量較少，對(duì)后期PCR擴(kuò)增抑制作用小，提取的總DNA用Nano-drop分光光度計(jì)測(cè)得其濃度為259.72 ng/μL。由圖4可以看出：DNA在250～260 nm下游最大吸收值，且峰值單一，OD260/OD280=1.91，一般情況下，若該數(shù)值在1.6～2.0之間說(shuō)明DNA純度較高。

圖4　DNA的提取結(jié)果

2.6氨氧化細(xì)菌的PCR結(jié)果

采用特異性引物amoA-1F/amoA-2R對(duì)生物膜DNA樣品的氨氧化細(xì)菌進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增后，瓊膠電泳獲得的電泳見(jiàn)圖5。

圖5　AOB的aomAPCR電泳圖

由圖5可知，圖中前兩個(gè)孔為陰性對(duì)照，以檢驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中DNA樣品是否被污染，而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；第3個(gè)孔為Marker，在DNA分子凝膠電泳時(shí)，用來(lái)檢測(cè)瓊脂糖凝膠是否有問(wèn)題，同時(shí)比對(duì)樣品DNA的片段長(zhǎng)度(本實(shí)驗(yàn)選擇AOB片段為436 bp)，后3個(gè)亮條帶(2組平行)為生物膜樣品氨氧化細(xì)菌PCR特異性條帶，由圖5顯示，采用PCR法已成功擴(kuò)增出氨氧化細(xì)菌AOB的特異性片段。

2.7氨氧化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將測(cè)得的序列結(jié)果與網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST進(jìn)行對(duì)比，從序列庫(kù)中挑選出與實(shí)驗(yàn)樣品序列同源性和相似性最近的的DNA序列，通過(guò)專門(mén)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)繪制軟件，建立氨氧化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[19]。

曝氣生物流化床反應(yīng)器中的氨氧化細(xì)菌(AOB)的amoA功能基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以劃分為6個(gè)分支，均屬于β-Proteobacteria。其中，3個(gè)分支包含已知菌種的amoA功能基因序列，分別定義為Nitrosomonas分支、Nitrosospira分支和Nitrosovibrio分支，3個(gè)分支未找到相似的已知菌種amoA功能基因序列，均定義為未知Nitrosomonadaceae分支，已知菌屬占《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中氨氧化細(xì)菌5個(gè)屬中的3種，由此可以看出曝氣生物流化床反應(yīng)器中的氨氧化細(xì)菌的生物種群數(shù)量分列廣泛，通過(guò)OTU計(jì)算曝氣生物流化床反應(yīng)中氨氧化細(xì)菌序列共整理出6個(gè)氨氧化菌的操作分類單元(OTU)，OTU直接反應(yīng)的是微生物的生物多樣性，由此可以明顯表明，曝氣生物流化床小試反應(yīng)器處理列車集便器糞便污水，高效的脫氮效率與反應(yīng)器中氨氧化細(xì)菌種屬多、生物多樣性高有關(guān)，氨氧化細(xì)菌的豐富多樣性可能是曝氣生物流化床反應(yīng)器高效脫氮的一項(xiàng)重要原因。

3　結(jié)論

(1)DO在2.5 mg/L時(shí)，反應(yīng)器達(dá)到最佳同步硝化反硝化效果；增大DO值，反應(yīng)效率反而變小。C/N比變化對(duì)反應(yīng)器氨氮去除率影響不大，總氮去除率與C/N比值成正相關(guān)。在C/N比值1.6的條件下，反應(yīng)器表現(xiàn)出良好的同步硝化反硝化脫氮性能。

(2)好氧曝氣生物流化床反應(yīng)器，能夠較好實(shí)現(xiàn)硝化和反硝化2個(gè)過(guò)程，最佳pH值范圍為7.0～8.0，pH值低于7.0，反應(yīng)器同步硝化反硝化效能下降。溫度在18～25 ℃變化對(duì)氨氮和總氮去除率變化較小。

(3)DNA提取結(jié)果表明OD260/OD280=1.91，純度較高，濃度為259.72 ng/μL；氨氧化細(xì)菌AOB通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以劃分為6個(gè)分支，列屬于硝化細(xì)菌5個(gè)屬中的3個(gè)屬，20個(gè)序列含有6個(gè)OTU，氨氧化細(xì)菌的生物多樣性高。

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Denitrification and Simultaneous Nitrification Microbial for Treatment of Enclosed Passenger Train Toilet Fecal Wastewater by Aerobic Biological Fluidized Bed Reactor

SHUI Chun-yu

(Energy Saving & Environmental Protection & Occupational Safety and Health Research Institute， China Academy of Railway Sciences，Beijing 100081，China)

The enclosed passenger train toilet fecal wastewater is treated with the aerobic biological fluidized bed reactor.The efficiencies of simultaneous nitrification and denitrification in reaction are studied and the effects of denitrification with reactor are assessed under different conditions.The results show that the reactor can well fulfill nitrification and denitrification processes simultaneously with the best denitrification performance at DO of 2.5 mg/L.The optimal pH range is 7.0～8.0 and at C/N=1.6 the reactor has better efficiency of denitrification.In addition，it is observed that the performance is not significantly influenced by the temperature changes between 18～25 ℃，ant the purity DNA of microorganism and the biodiversity of ammonia oxidizing bacteria are high.

Simultaneous nitrification and denitrification; Fecal wastewater treatment; Denitrification; Microorganism

2016-03-15；

2016-03-31

鐵道部科技研究開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(J2009Z002)

水春雨(1978—)，男，副研究員，工學(xué)博士，主要從事鐵路節(jié)能環(huán)保技術(shù)工作，E-mail：shuicy@rails.cn。

1004-2954(2016)10-0145-04

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10.13238/j.issn.1004-2954.2016.10.032