陳木子，朱 興，唐明華，郭 軍，馮善娥

(蘇州大學(xué)分析測試中心，江蘇蘇州 215123)

螺旋碳納米材料因其有較高的比表面積、較好的機(jī)械和熱力學(xué)等性能在不對稱催化、手性傳感器和電磁波吸收等領(lǐng)域有重要的研究和實(shí)用價(jià)值[1 - 5]。螺旋結(jié)構(gòu)納米材料因旋轉(zhuǎn)方向不同帶來手性之分，對螺旋納米材料的手性確認(rèn)也引起了研究者的興趣。目前螺旋納米材料的形貌觀測主要借助于掃描電鏡和透射電鏡，但單純利用掃描電鏡和透射電鏡的二維圖像作為螺旋材料手性判斷的依據(jù)還不夠準(zhǔn)確完善。

近幾年，透射電鏡的三維重構(gòu)技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)及材料學(xué)中取得了快速發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及一些材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的分析[6 - 11]。透射電鏡三維重構(gòu)技術(shù)起源于20世紀(jì)60年代，1968年Rosier和Klug[12]在Nature上發(fā)表了一篇關(guān)于利用電子顯微鏡照片重構(gòu)T4噬菌體尾部三維結(jié)構(gòu)的著名論文，透射電鏡的三維重構(gòu)技術(shù)引起了廣泛關(guān)注。透射電鏡三維重構(gòu)技術(shù)的基本原理基于中央截面定理：任何實(shí)空間的三維物體，沿入射光線方向的二維投影的傅立葉變換，是該物體三維傅立葉變換后，在倒易空間中垂直于該入射光線方向的一個(gè)過中心點(diǎn)的二維截面。根據(jù)中心截面定理，收集物體在各個(gè)方向的二維投影照片后，經(jīng)過傅立葉變換及反傅立葉變換就可以恢復(fù)該物體的三維結(jié)構(gòu)[13,14]。

三維重構(gòu)技術(shù)作為螺旋納米材料手性確定的方法目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用我中心配有三維重構(gòu)附件的Tecnai G2F20透射電鏡(TEM)，收集傾轉(zhuǎn)不同角度后的納米螺旋材料透射電鏡圖像，對每張投影圖進(jìn)行傅立葉變換，按照投影方向填充到三維傅里葉空間對應(yīng)的切面，再進(jìn)行反傅立葉變換，就可得到螺旋納米材料實(shí)空間的三維結(jié)構(gòu)模型從而分析和確認(rèn)材料的手性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Tecnai-G2F20透射電子顯微鏡(美國，F(xiàn)EI公司)；S-4700掃描電子顯微鏡(日本，HITACHI公司)；E-1010真空鍍膜儀(日本，HITACHI公司)。

實(shí)驗(yàn)所用L-型和D-型模板劑制備的兩種單手螺旋的3-氨基苯酚-甲醛樹脂及一種酚醛樹脂進(jìn)一步碳化得到單手螺旋碳質(zhì)納米管樣品由蘇州大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)部提供。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 待測樣品準(zhǔn)備

取少量樣品放入小燒杯中，加入適量的無水乙醇，放入超聲震蕩儀中超聲8 min左右，用移液槍移取樣品分別滴于200目的碳支持膜銅網(wǎng)上和硅片上，用紅外燈烘干后，備用。

1.3 掃描電鏡形貌表征

將制備好的硅片上的樣品用導(dǎo)電雙面膠粘在樣品臺(tái)上，放入噴金電鍍儀里，設(shè)置工作電流為15 mA，噴金時(shí)間為60 s，進(jìn)行真空噴鍍。將噴鍍好的樣品放入掃描電鏡室觀察；掃描電鏡工作電壓為15 kV，工作電流為10 mA，選擇合適的放大倍數(shù)后聚焦拍照。

1.4 透射電鏡形貌表征

將制備好的載有樣品的碳支持膜銅網(wǎng)放入透射電鏡樣品桿上，將樣品桿插入鏡筒，電鏡合軸對中后使用。透射電鏡工作電壓為200 kV，工作電流為74 μA，點(diǎn)分辨率為0.24 nm。選擇合適的放大倍數(shù)后聚焦拍照。

1.5 透射電鏡三維重構(gòu)實(shí)驗(yàn)

本文主要報(bào)道利用Tecnai-G2F20透射電鏡結(jié)合三維重構(gòu)樣品桿，通過對超分子模板法制備的單手螺旋酚醛樹脂和進(jìn)一步碳化制備的單手螺旋碳樣品進(jìn)行系列角度傾轉(zhuǎn)，獲取透射電鏡二維圖片原始數(shù)據(jù)，再應(yīng)用Inspect 3D及Amira軟件進(jìn)行后期數(shù)據(jù)處理與分析(包括密度分割、建立模型等)，從而確定螺旋樹脂及螺旋碳納米管的手性。

1.5.1實(shí)驗(yàn)步驟(1)將制備好的樣品放入Tecnai-G2F20透射電鏡中，找到位于銅網(wǎng)網(wǎng)格中間并且螺旋長軸方向與樣品桿方向一致的樣品。(2)檢查調(diào)試透射電鏡使電鏡處于良好工作狀態(tài)。在Xplore軟件中設(shè)置合適參數(shù)，樣品的最大傾轉(zhuǎn)角范圍為-70°～+70°。根據(jù)樣品的情況確定樣品的實(shí)際傾轉(zhuǎn)角范圍，以間隔角為1°或2°對樣品進(jìn)行傾轉(zhuǎn)，用CCD相機(jī)(Gatan 832)記錄不同傾轉(zhuǎn)角度下得到樣品的多張二維原始圖片。(3)利用Inspect 3D軟件對收集的原始圖片篩選并進(jìn)行匹配，主要是基于樣品基本特征和交互相關(guān)性(Cross Correlation)對圖片進(jìn)行旋轉(zhuǎn)和偏移校正，然后利用加權(quán)背投影(WBP)、代數(shù)迭代(ART)或同步迭代(SIRT)等方法進(jìn)行三維重構(gòu)。(4)利用Amira軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析使三維重構(gòu)的結(jié)果合成為可視化的立體模型[15]。

1.5.2實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)要建立準(zhǔn)確的三維重構(gòu)模型，正確判斷螺旋材料的手性，在數(shù)據(jù)的采集和處理過程中必須注意以下幾個(gè)方面：(1)電鏡合軸和三維重構(gòu)參數(shù)校準(zhǔn)。主要包括:電鏡不同模式下精確合軸對中，CCD相機(jī)參數(shù)設(shè)置、放大倍率校準(zhǔn)、樣品漂移校準(zhǔn)、光束傾斜校準(zhǔn)、自動(dòng)聚焦校準(zhǔn)、自動(dòng)調(diào)節(jié)聚焦高度校準(zhǔn)及樣品桿校準(zhǔn)。(2)選擇合適的銅網(wǎng)目數(shù)和樣品的位置，增加樣品的傾轉(zhuǎn)角度范圍，減小缺失鍥的體積[6,15]，以減弱缺失鍥的存在造成的模型誤構(gòu)問題。(3)在數(shù)據(jù)的采集中設(shè)置合理的濾波波長范圍，利用Xplore系統(tǒng)有效濾波去除噪音、識(shí)別樣品的特征位置、計(jì)算樣品的漂移軌跡，從而達(dá)到有效進(jìn)行漂移校正的目的。(4)樣品桿傾轉(zhuǎn)過程中，精確調(diào)節(jié)三維重構(gòu)Xplore軟件中auto focus的參數(shù)，設(shè)置合適的欠焦量，以確保樣品整個(gè)傾轉(zhuǎn)過程中獲取清晰圖片，同時(shí)加入合適尺寸的物鏡光闌來提高圖像襯度。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-型模板制備的3-氨基苯酚-甲醛樹脂樣品的形貌和結(jié)構(gòu)分析

L-型模板制備的3-氨基苯酚-甲醛樹脂樣品的透射電鏡形貌和掃描電鏡形貌觀察結(jié)果如圖1所示。利用透射電鏡形貌圖片無法直觀判斷樣品的手性，在掃描電鏡圖片上根據(jù)樣品形貌襯度變化可初步推斷樣品為右手螺旋。但單一的掃描電鏡二維圖像也不能夠完全準(zhǔn)確的確認(rèn)樣品的手性。為了進(jìn)一步準(zhǔn)確判斷樣品的手性，對樣品進(jìn)行了三維重構(gòu)實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)中采用Tecnai-G2F20透射電鏡配置的三維重構(gòu)軟件Xplore采集透射電鏡的原始圖片數(shù)據(jù)，確認(rèn)樣品的可傾轉(zhuǎn)角度范圍為-55°到+60°，對樣品進(jìn)行每隔一度連續(xù)傾轉(zhuǎn)后采集116張圖片。圖2(a～c)顯示了用三維重構(gòu)軟件Xplore采集的樣品傾轉(zhuǎn)-55°、0°、+60°后的透射電鏡的原始二維圖片。應(yīng)用Inspect 3D軟件對116張圖片進(jìn)行二維圖像匹配及三維重構(gòu)，并用Amira軟件進(jìn)行后期模型建立，最終得到三維重構(gòu)后的模型(圖2d)。通過對三維重構(gòu)模型不同角度及不同方向傾轉(zhuǎn)后進(jìn)行觀察和分析，從而確認(rèn)L-型模板制備的3-氨基苯酚-甲醛樹脂樣品為右手螺旋結(jié)構(gòu)。

2.2 D-型模板制備的3-氨基苯酚-甲醛樹脂樣品的形貌和結(jié)構(gòu)分析

D-型模板制備的3-氨基苯酚-甲醛樹脂與L-型模板制備樹脂雖然是同類螺旋材料，由于使用的模板不同，所形成的手性應(yīng)有所不同。為了確定D-型模板制備的樹脂所形成的手性，同樣對樣品也進(jìn)行了三維重構(gòu)實(shí)驗(yàn)確定手性。

透射電鏡形貌和掃描電鏡的形貌圖如圖3所示，從掃描電鏡形貌圖片上初步判斷樣品為左手螺旋。對樣品的三維重構(gòu)數(shù)據(jù)采集步驟和L-型模板制備的樣品相似。選取從-58°到+60°每隔一度連續(xù)傾轉(zhuǎn)采集119張圖片。圖4(a～c)是樣品用三維重構(gòu)軟件Xplore采集透射電鏡的原始圖片中分別傾轉(zhuǎn)-58°、0°、+60°的圖片。圖4d為數(shù)據(jù)處理后的三維重構(gòu)立體模型。從模型中進(jìn)行不同角度的觀察分析判斷D-型模板制備的3-氨基苯酚-甲醛樹脂樣品為左手螺旋。這充分說明了利用透射電鏡三維重構(gòu)方法對螺旋納米材料手性進(jìn)行判斷的可行性和準(zhǔn)確性。

2.3 L-型單手螺旋碳質(zhì)納米管的結(jié)構(gòu)分析

L-型單手螺旋碳質(zhì)納米管樣品不僅管的外部存在螺旋結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部也存在螺旋結(jié)構(gòu)，內(nèi)部螺旋手性判斷的難度更大。根本無法從透射電鏡和掃描電鏡的形貌圖片(圖5)中判斷出內(nèi)部手性。

本文通過透射電鏡的三維重構(gòu)技術(shù)對L-型單手螺旋碳質(zhì)納米管內(nèi)部螺旋的手性進(jìn)行了判斷。相似的方法，樣品傾轉(zhuǎn)角范圍為-60°到+60°，采集121張圖片。圖6(a～c)是樣品用三維重構(gòu)軟件Xplore采集透射電鏡的原始圖片中樣品分別傾轉(zhuǎn)-60°、0°、+60°的圖片。應(yīng)用Inspect 3D軟件對121張圖片進(jìn)行二維圖像匹配及三維重構(gòu)，并用Amira軟件進(jìn)行后期數(shù)據(jù)處理分析，最終重構(gòu)出樣品的三維模型。

為了判斷樣品的外部和內(nèi)部螺旋的手性，通過對三維重構(gòu)模型(圖6d)進(jìn)行合適角度的旋轉(zhuǎn)顯示出外部螺旋結(jié)構(gòu)為左手手性。但是單從三維模型的分析無法對樣品的內(nèi)部螺旋手性進(jìn)行判斷。本文對三維重構(gòu)模型進(jìn)行切片取圖，共有443張切片圖，圖6e為第200張切片圖。根據(jù)多張切片圖空心處的黑白襯度及螺旋的走向判斷樣品內(nèi)部螺旋手性為左手。因此透射電鏡三維重構(gòu)方法不但可以準(zhǔn)確地判斷螺旋材料的外部手性，用于螺旋材料內(nèi)部手性的判斷也具有實(shí)際的應(yīng)用意義。

3 結(jié)論

通過掃描電鏡和透射電鏡對兩種單手螺旋3-氨基苯酚-甲醛樹脂及一種單手螺旋碳質(zhì)納米管樣品形貌觀察和分析不能直觀準(zhǔn)確的確認(rèn)材料的手性。本文利用透射電鏡三維重構(gòu)技術(shù)，選擇合適的采集和重構(gòu)參數(shù)，進(jìn)行三維模型的建立及分析，對兩種單手螺旋3-氨基苯酚-甲醛樹脂樣品結(jié)合掃描電鏡的形貌觀察后進(jìn)一步確認(rèn)了材料的手性。對單手螺旋碳質(zhì)納米管，在通過掃描和透射電鏡二維形貌觀察都無法判斷其內(nèi)部手性的情況下，本文通過透射電鏡三維重構(gòu)技術(shù)，重構(gòu)三維模型后進(jìn)行切片取圖，通過對切片圖的分析確認(rèn)其手性。透射電鏡三維重構(gòu)技術(shù)作為手性判斷的方法具有準(zhǔn)確可行性，這也為其它納米螺旋材料特別是內(nèi)部螺旋材料的手性判斷提供了判斷方法和依據(jù)，在推動(dòng)螺旋材料的手性研究中具有重要的實(shí)際意義。