李 松，張國文

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌 330047)

塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl Phthalate,DBP)是廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)，并存在于人們生活環(huán)境中的一種工業(yè)添加劑，為潛在有毒有害物質(zhì)。研究表明，DBP作為一種雌激素類似物，主要對人體具有生殖和發(fā)育毒性[1]，另外還有一定的基因毒性和致癌性[2]。近年，塑化劑威脅人類健康的事件屢見不鮮，人們也越來越關注其安全性問題。DNA是重要的遺傳物質(zhì)，在生命過程中發(fā)揮著重要作用，并掌控著遺傳信息的復制、轉錄和表達[3]，此外，DNA還是許多小分子在體內(nèi)的作用靶點。小分子與DNA相互作用的研究能夠在分子水平提供其結合機制，以及小分子對DNA構象的影響等信息，有助于深入了解有害小分子對人體的毒理效應。

DBP在動物體內(nèi)的毒性實驗已有一些研究[1,2]，但在體外與DNA相互作用還未見報道。本文以小牛胸腺DNA(ctDNA)為作用靶點，采用體外實驗，在模擬人體生理酸度(pH=7.4)條件下，應用多種光譜學方法、化學計量學，以及分子模擬技術研究DBP與ctDNA相互作用，以期為認識DBP與ctDNA的作用機制及DBP的毒性行為提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器及試劑

F-7000型熒光光度計(日本，日立公司)；UV-2450型紫外-可見分光光度計(日本，島津公司)；MOS 450型圓二色光譜儀(法國，Bio-Logie公司)；Nicolet-5700型紅外光譜儀，配置ATR附件(美國，Nicolet公司)；烏氏粘度計(上海前鋒橡塑玻璃制品廠)；pHS -3C型酸度計(上海雷磁儀器廠)。

DBP標準品(純度≥99.5%，阿拉丁試劑公司)用95%乙醇配制成2.0×10-3mol·L-1的儲備溶液； ctDNA(Sigma公司)用0.1 mol·L-1NaCl溶液溶解，其濃度利用ε260=6 600 L·mol-1·cm-1[4]確定為2.45×10-3mol·L-1，測得A260/A280>1.80，表明ctDNA已充分脫去蛋白質(zhì)；超螺旋pUC18質(zhì)粒DNA(索萊寶試劑公司)；0.05 mol·L-1pH=7.4的Tris-HC1緩沖溶液。上述溶液均保存于4 ℃冰箱中備用，其他試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1構建紫外吸收光譜數(shù)據(jù)矩陣實驗1：固定ctDNA溶液濃度為6.24×10-5mol·L-1，然后以每次2.0×10-6mol·L-1的濃度間隔加入31次DBP；實驗2：保持DBP溶液濃度為8.0×10-5mol·L-1不變，依次滴加濃度間隔為2.08×10-6mol·L-1的ctDNA 31次，至最終濃度為6.45×10-5mol·L-1。每次加樣后均混勻靜置4 min，待充分反應后進行紫外光譜測定，記錄波長215～350 nm數(shù)據(jù)，共136個數(shù)據(jù)點，得到了DctDNA(32×136) 和DDBP(32×136)兩個數(shù)據(jù)矩陣，組成[DctDNA,DDBP]矩陣。

1.2.2多元曲線分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS) MCR-ALS是一種能夠分析數(shù)據(jù)矩陣、特征重疊光譜，并從復雜反應系統(tǒng)中記錄每一個參與組分的響應信號和濃度變化的有效方法[5]。該方法可以幫助我們從復雜反應系統(tǒng)中得到更多本質(zhì)直觀的信息,如濃度變化、純光譜等。解析步驟如下：(1)構建擴展數(shù)據(jù)矩陣,通過奇異值分解(SVD)方法分析獲取體系中主要組分數(shù)目；(2)用漸進因子分析法(EFA)初步估計初始濃度，得到ALS迭代的初始濃度矩陣；(3)運用ALS進行迭代優(yōu)化。

對于二維光譜數(shù)據(jù)矩陣，根據(jù)以下代數(shù)模型進行雙線性分解[6]:

D=C×ST+E

(1)

其中，D分別為光譜矩陣；C為濃度矩陣；ST為純光譜矩陣；E為誤差矩陣。

將1.2.1得到的光譜數(shù)據(jù)矩陣分解為：

(2)

1.2.3熒光光譜的測定分別在298、304和310 K三個溫度下向濃度為6.67×10-5mol·L-1的DBP溶液中連續(xù)滴加濃度間隔為6.24×10-6mol·L-1的ctDNA，在激發(fā)波長為254 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為2.5 nm下，掃描溶液在280～400 nm的熒光發(fā)射光譜。為消除紫外重吸收和內(nèi)濾效應，所有熒光數(shù)據(jù)均采用文獻方法[7]對熒光數(shù)據(jù)進行校正。

1.2.4瓊脂糖凝膠電泳實驗將超螺旋pUC18質(zhì)粒(DNA 3 μL，400 μg/mL) 用不同濃度的DBP處理并用Tris-HCl緩沖液稀釋至10 μL。在37 ℃水浴中孵化24 h后加入上樣緩沖溶液(包含0.03%溴酚藍、0.03%二甲苯藍和30%甘油)。準備1.0% 瓊脂糖凝膠，用GoldView 溶液染色，放入含有1×Tris-乙酸-EDTA緩沖液中，將樣品加入加樣孔中，在80 V電壓條件下電泳30 min，之后取出凝膠進行紫外成像。

1.2.5分子模擬從 Protein Data Bank 庫獲取B型DNA的結構(PDB ID:453D)，對接運行前對DNA進行去水、加氫和Gasteiger 電荷修飾。配體DBP模型通過SYBYL×1.1軟件構建，并在MMFF94力場使用MMFF94電荷將其能量最小化優(yōu)化[8]。采用Autodock 4.2軟件進行分子對接(總共100次對接實驗)，并用Lamarckian Genetic Algorithm(LGA)算法完成對接計算，以2.0 ?的均方根偏差容量對100次對接結果進行能量分析，獲得一系列的能量簇，取能量最低且次數(shù)最多的構象進行分析。

2 結果與討論

2.1 DBP與ctDNA相互作用的紫外吸收光譜

實驗1為固定ctDNA濃度連續(xù)加入DBP，發(fā)現(xiàn)ctDNA位于259 nm處的特征吸收峰強度隨著DBP的加入緩慢增大并有一定的藍移，而位于230 nm附近的吸收強度有較大的增強(圖1A)。由實驗2結果可見，DBP在230 nm和285 nm處有兩個特征吸收峰，隨著ctDNA濃度的增加，DBP在230 nm處吸光度先減小后略微增大(圖1B)，并且在259 nm處出現(xiàn)一個新峰。DBP與ctDNA光譜高度重疊，很難獲得兩者相互作用有價值的信息。

2.2 MCR-ALS解析紫外光譜數(shù)據(jù)矩陣

利用MCR-ALS法對光譜數(shù)據(jù)擴展矩陣進行分析，通過奇異值分解(SVD)確定反應體系中的組分數(shù)。所提取到的前4個特征值分別為112.53、61.41、59.24和7.58，可以預測到體系中存在3種主要組分，即DBP、ctDNA和DBP-ctDNA復合物。MCR-ALS算法解析[DctDNA,DDBP]數(shù)據(jù)矩陣得到了3種組分濃度變化趨勢圖，隨著DBP加入量的增加，DBP-ctDNA復合物的濃度逐漸增大，伴隨著ctDNA濃度逐漸減少(圖2A)。相反，當向DBP溶液中加入ctDNA，DBP濃度逐漸降低而DBP-ctDNA復合物的濃度逐漸增加(圖2B)，并且解析出的各組分純光譜曲線(實線)與實際測得光譜曲線(虛線)較好地吻合(圖2C)，表明預測反應體系中存在3種主要組分且其濃度變化趨勢是可靠的，組分間濃度變化直觀地顯示DBP與ctDNA發(fā)生相互作用形成了復合物。

2.3 ctDNA對DBP熒光光譜影響

當熒光激發(fā)波長為254 nm 時，DBP在316 nm處有一個較強的熒光發(fā)射峰(圖3A)。隨著ctDNA的加入，DBP在316 nm的熒光強度顯著降低，表明ctDNA猝滅DBP的熒光，兩者發(fā)生了相互作用。

為了明確其猝滅機制，采用Stern-Volmer方程對熒光數(shù)據(jù)進行分析[9]：

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(3)

式中，F(xiàn)0和F分別為加入ctDNA前后DBP溶液的熒光強度;KSV為猝滅常數(shù);Kq為雙分子猝滅過程的速率常數(shù);[Q]為猝滅劑的濃度;τ0為沒有猝滅劑存在下的熒光分子平均壽命，約為10-8s[10]。

以F0/F對[Q]作圖(圖3B)，得到3個不同溫度下的猝滅常數(shù)值，見表1。隨著溫度的升高KSV的值逐漸減小，且猝滅速率常數(shù)Kq達到1012數(shù)量級，遠大于最大擴散碰撞猝滅速率常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)，表明ctDNA對DBP的熒光猝滅為單一靜態(tài)猝滅過程。

此外，由修正的Stern-Volmer方程分析熒光數(shù)據(jù)[11]：

(4)

以F0/(F0-F)對1/[Q]作圖，獲得結合常數(shù)值Ka(表1)，Ka隨著溫度升高而降低，表明溫度升高復合物穩(wěn)定性下降，這與靜態(tài)猝滅機制相符。

2.4 熱力學參數(shù)及作用力類型的確定

為進一步了解DBP與ctDNA反應熱力學過程，其熱力學參數(shù)可由Van’t Hoff 方程[12]求得，焓變ΔHΘ和熵變ΔSΘ分別為-14.03 kJ·mol-1和28.62 J·mol-1·K-1，表明該反應為放熱，疏水作用和氫鍵是結合作用的主要驅(qū)動力，且是一個自發(fā)過程[3,13]。

表1 三個溫度下的猝滅常數(shù)、結合常數(shù)及熱力學參數(shù)

Rais the correlation coefficient for theKSVvalues.Rbis the correlation coefficient for theKavalues.

2.5 ctDNA解鏈溫度及粘度測定

DNA的熔點(Tm)，即為DNA加熱發(fā)生解鏈失去一半螺旋結構時的溫度，也稱解鏈溫度。當小分子嵌插于DNA堿基對當中，DNA結構變得更加穩(wěn)定，Tm則會明顯升高，而通過溝槽與靜電作用方式與DNA結合，Tm則不會有明顯變化[14]。圖4A顯示ctDNA與DBP-ctDNA復合物的Tm值沒有明顯的差異，表明DBP通過溝槽模式與ctDNA結合。

經(jīng)典嵌插劑嵌入DNA堿基對會引起堿基對間距增大，導致雙螺旋松弛，長度變大，使得粘度明顯增大，而溝槽結合劑對DNA粘度無明顯影響[15]。圖4B顯示了DBP與小溝結合劑Hoechst33258一樣對于ctDNA粘度均無明顯影響，這是DBP與ctDNA通過溝槽模式結合的有力證據(jù)。

2.6 單、雙鏈ctDNA對DBP熒光猝滅

為探究DBP與ctDNA結合模式，采用雙鏈ctDNA(dsctDNA)與單鏈ctDNA(ssctDNA)分別對DBP進行熒光猝滅實驗。若小分子與ctDNA通過嵌插模式結合，dsctDNA更利于DBP的結合，其對DBP熒光猝滅的程度要強于要ssctDNA，而溝槽結合則相反[16]。圖5顯示，ssctDNA對DBP熒光的猝滅效應明顯強于dsctDNA，進一步表明DBP與ctDNA的溝槽結合方式。

2.7 結合位點

為測定DBP在ctDNA上的結合位點，實驗對加入DBP前后的ctDNA分別進行了紅外光譜掃描。B型DNA在紅外光譜中1 717 cm-1、1 660 cm-1、1 610 cm-1和1 490 cm-1處的特征峰，分別對應鳥于嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)的伸縮振動。而1 222 cm-1和1 088 cm-1的特征峰則為磷酸骨架的非對稱伸縮振動和對稱伸縮振動引起的[17]。隨著DBP比例的增大，T堿基和A堿基的峰位有明顯的移動，分別從1 667 cm-1移動到了1 659 cm-1，1 610 cm-1移動到1 600 cm-1，而其他各個特征峰均沒有出現(xiàn)移動(圖6)，表明DBP可能主要結合于ctDNA的A-T堿基富集區(qū)[18]。

2.8 ctDNA構象變化

B型構象的ctDNA 有兩個分別由右手螺旋結構和堿基堆積引起的特征峰，即245 nm處的負峰和280 nm處的正峰。隨著DBP濃度的增大，ctDNA負峰增強、正峰減弱(圖7)，表明B型ctDNA結構變得更為松散[19]。

2.9 DNA損傷檢測

采用瓊脂糖凝膠電泳實驗通過檢測DBP對pUC18質(zhì)粒DNA可能的損傷。當環(huán)狀超螺旋DNA進行電泳時，可能出現(xiàn)3種形式，即Form Ⅰ(環(huán)狀)、Form Ⅱ(開環(huán)狀)和Form Ⅲ(線狀)，它們在凝膠中的遷移速率為Form Ⅰ>Form Ⅲ>Form Ⅱ[20]。電泳圖中并沒有出現(xiàn)除Form I外的其他條帶(圖8)，表明該濃度范圍內(nèi)DBP沒有造成DNA明顯損傷。

2.10 DBP與ctDNA的分子對接

通過Autodock軟件對整個DNA模型范圍完成100次模擬對接后，形成了由15個構象能量簇構成的能量圖(圖9(A))。從能量角度考慮，選取能量圖中能量最低，次數(shù)最多的DBP與ctDNA結合狀態(tài)進行分析。圖9(B)顯示DBP與DNA的小溝富集區(qū)A-T堿基結合，且與DA5和DA6堿基形成了兩個氫鍵，分子模擬結果與紅外光譜實驗相一致，進一步確證了DBP與ctDNA溝槽結合模式。

3 結論

在模擬生理酸度(pH=7.4)條件下，聯(lián)合應用MCR-ALS法結合多種光譜學以及分子模擬技術，研究了DBP與ctDNA的相互作用。結果表明，DBP能與ctDNA發(fā)生相互作用形成DBP-ctDNA復合物。ctDNA通過單一的靜態(tài)方式猝滅DBP的內(nèi)源熒光，疏水作用和氫鍵是兩者作用的主要驅(qū)動力。DBP與ctDNA通過溝槽方式結合，且DBP主要作用于A-T堿基富集區(qū)，這種作用誘導B型ctDNA結構變得更為松散，但未對質(zhì)粒DNA產(chǎn)生明顯損傷。研究結果為理解DBP與DNA的相互作用機制和DBP毒理效應提供了有益的信息。