周 玫， 梁志遠(yuǎn),*， 甘秀海,， 冉曉燕， 何 軍

(1.貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550018；2.貴州師范學(xué)院藥用植物研究所,貴州貴陽 550018)

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D101大孔樹脂富集白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III工藝研究

周 玫1， 梁志遠(yuǎn)1,2*， 甘秀海1,2， 冉曉燕2， 何 軍2

(1.貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550018；2.貴州師范學(xué)院藥用植物研究所,貴州貴陽 550018)

[目的] 以白術(shù)為材料，研究白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III富集工藝條件。[方法]通過靜態(tài)吸附和解吸比較6種大孔樹脂對(duì)2種白術(shù)內(nèi)酯的富集效果，對(duì)效果好的大孔樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)試驗(yàn)研究。[結(jié)果]用D101大孔樹脂富集白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的最佳工藝：上樣液白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III質(zhì)量濃度分別為25.6和59.7 μg/mL，上樣量4 BV，流速2 BV/h，依次用16 BV水、6 BV 30%乙醇除雜，12 BV 75%乙醇以2 BV/h流速洗脫，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的回收率分別為100.00%和98.24%。[結(jié)論] D101大孔樹脂富集白術(shù)粗提物中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的方法簡(jiǎn)單可行。

白術(shù)；白術(shù)內(nèi)酯；富集；大孔樹脂；工藝條件

AbstractAtracttylodesmacrocephalaKoidz; Atractylenolide; Enrichment; Macroporous resin; Technology condition

白術(shù)為菊科(Compositae)植物白術(shù)(AtracttylodesmacrocephalaKoidz)的干燥根莖，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥之一，具有健脾、益氣、安胎、止汗等功效，常用于脾虛食少、腹脹泄瀉、胎動(dòng)不安、自汗等癥[1]。隨著對(duì)白術(shù)研究的深入，證實(shí)其還具有降血糖、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛、抑制代謝活化酶、抗腫瘤等活性[2-4]。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III是白術(shù)的有效成分，也是白術(shù)質(zhì)量控制的主要指標(biāo)[5-7]。但白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的含量較少，直接從白術(shù)提取的粗提物中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III含量低[8-9]，不能滿足醫(yī)藥行業(yè)的要求。因此，從白術(shù)粗提物中高效、快速地富集得到一定含量的白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III產(chǎn)品,具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與現(xiàn)實(shí)意義。

大孔樹脂具有吸附容量大、選擇性高、可再生循環(huán)使用、工藝簡(jiǎn)單、不存在金屬和有機(jī)溶劑毒性殘留[10]等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于中藥有效成分如黃酮、生物堿、多糖、皂苷等的富集純化中[11-14]。從白術(shù)中提取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III工藝研究已有不少報(bào)道[15-18]，但用大孔樹脂富集純化白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的相關(guān)研究報(bào)道很少，僅李鴻翔等[19]嘗試用AB-8 型大孔樹脂分離純化白術(shù)水提液中白術(shù)內(nèi)酯III，且取得良好的效果。該研究以白術(shù)為材料，通過靜態(tài)吸附和解吸比較6種大孔樹脂對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的富集效果，對(duì)效果好的大孔樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)試驗(yàn)，研究2種白術(shù)內(nèi)酯的富集工藝條件。

1　材料與方法

1.1儀器Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)惠普公司)；BSA124S型電子天平(北京慧龍環(huán)科環(huán)境儀器有限公司)；KQ3200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；QHZ-98B全溫光照振蕩培養(yǎng)箱(江蘇省太倉市美華生化儀器廠)。1.2試材白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III對(duì)照品(購(gòu)自貴州省迪大科技有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為GZ73069-12-3和GZ73030-71-4，純度均大于99%)；白術(shù)購(gòu)于貴陽藥材市場(chǎng)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院席先蓉教授鑒定為白術(shù)(AtracttylodesmacrocephalaKoidz)的干燥根莖。D101、NKA、X-5、H107、DM130、AB-8大孔樹脂(湖南長(zhǎng)沙大禹化工有限公司)。甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，乙醇為食用級(jí)，其余試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1白術(shù)內(nèi)酯含量測(cè)定

1.3.1.1對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備。分別精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III對(duì)照品2.0和4.0 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，制成白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III濃度分別為0.08和0.16 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.3.1.2白術(shù)內(nèi)酯粗提液的制備。稱取適量白術(shù)藥材粉末(過20目篩)，加12倍體積分?jǐn)?shù)85%乙醇，50 ℃超聲提取2次，每次30 min，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無乙醇味，用體積分?jǐn)?shù)為5%乙醇配成所需濃度，減壓過濾，得黃色稍渾濾液，即白術(shù)粗提液。1.3.1.3色譜條件。ZORBAXSB.C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相為甲醇∶水=65∶35；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。在此條件下，色譜圖見圖1。

注：1為白術(shù)內(nèi)酯III；2為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ。Note：Peak 1 was atractylcnolide III; and peak 2 was atractylcnolideⅠ.圖1　白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III對(duì)照品(a)和供試品(b) HPLC色譜圖Fig.1　HPLC chromatograms of reference substance (A) and tested substance (B) of atractylcnolideⅠand III

1.3.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 mL置10 mL容量瓶中,加甲醇至刻度，搖勻，得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ濃度分別為0.8、2.0、4.0、8.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL和白術(shù)內(nèi)酯III濃度分別為1.6、4.0、8.0、16.0、40.0、80.0、160.0 μg/mL的對(duì)照品溶液。在“1.3.1.3”色譜條件下進(jìn)行分析。以白術(shù)內(nèi)酯質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，求得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的回歸方程分別為Y=38.822X+16.016(R2=0.999 9)、Y=27.333X+31.197(R2=0.999 9)，表明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III分別在0.8～80.0、1.6～160.0 μg/mL范圍內(nèi)峰面積積分值與濃度呈良好的線性關(guān)系。1.3.1.5方法學(xué)考察。

(1)精密度試驗(yàn)。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的RSD分別為0.77%和0.55%，表明儀器精密度良好。

(2)穩(wěn)定性試驗(yàn)。取白術(shù)內(nèi)酯粗提液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h內(nèi)測(cè)定，在8 h內(nèi)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的RSD分別為1.63%和1.68%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

(3)重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取同一批次白術(shù)藥材粉末5份，按“1.3.1.2”制備白術(shù)內(nèi)酯粗提液，按“1.3.1.3”色譜條件測(cè)定其含量，測(cè)得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的RSD分別為1.36%和1.40%，表明該方法重復(fù)性良好。

(4)加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取已測(cè)知白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III含量的白術(shù)藥材粉末0.5 g，共6份，分別精密加入一定量的白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III對(duì)照品，按“1.3.1.2”制備白術(shù)內(nèi)酯粗提液，按“1.3.1.3”色譜條件測(cè)定其含量，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的平均回收率為99%，RSD為1.63%，白術(shù)內(nèi)酯III的平均回收率為98%，RSD為2.13%，表明該方法的回收率較好。

1.3.2富集工藝優(yōu)選。

1.3.2.1大孔樹脂的預(yù)處理。新大孔樹脂用95%的乙醇浸泡24 h，過濾，再用95%的乙醇沖洗至洗脫液與蒸餾水以1∶1混合清亮為止，然后用水洗至洗脫液無乙醇味，蒸干后無殘余物，用水浸泡備用。

1.3.2.2靜態(tài)法篩選大孔樹脂。準(zhǔn)確稱取6種已處理好的大孔樹脂各2.0 g (用注射器抽干水分后稱重)，置250 mL具塞錐形瓶中，各加入一定濃度的白術(shù)提取液100 mL，將具塞錐形瓶置于搖床，25 ℃恒溫振蕩24 h (80 r/min )，充分吸附后，過濾，測(cè)定濾液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的含量。同時(shí)稱取相同質(zhì)量的各樹脂，在105 ℃下干燥至恒重，測(cè)定各樹脂的含水率，并計(jì)算其吸附量。按下列公式計(jì)算各種樹脂靜態(tài)吸附率：

Q=(C0-C1)V/M

E=(C0-C1)/C0×100%

式中,Q為吸附量(μg/g)；E為吸附率；C0為上樣液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ或III的質(zhì)量濃度(μg/mL)；C1為吸附平衡后濾液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ或III的質(zhì)量濃度(μg/mL)；V為上樣液體積(mL)，M為樹脂質(zhì)量(g)。

將上述吸附飽和的6種大孔樹脂用適量水洗滌，除去白術(shù)內(nèi)酯提取液，然后加入50 mL水，于25 ℃恒溫振蕩120 min，過濾，并用注射器抽干水分。準(zhǔn)確加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液50 mL，25 ℃恒溫振蕩( 80 r/min )解吸24 h，過濾。精密移取濾液各10 mL，減壓除盡溶劑，殘余物用5%乙醇定容至10 mL，測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的含量，按下列公式計(jì)算各種樹脂靜態(tài)解吸率：

B=C2V1/[(C0-C1)V]×100%

式中，B為解吸率；C2為解吸液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ或III的質(zhì)量濃度(μg/mL);V1為解吸劑體積(mL)。

1.3.2.3靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)測(cè)定。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，篩選吸附和解吸效果好的2種大孔樹脂進(jìn)行動(dòng)力學(xué)考察。精密稱取大孔樹脂2.0 g，放入250 mL具塞三角瓶中，加入白術(shù)內(nèi)酯提取液100 mL(白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的含量分別為9.1和32.2 μg/mL),25 ℃恒溫振蕩(80 r/min )，在7 h內(nèi)，每0.5 h取0.5 mL，取8份，然后每1 h取0.5 mL，測(cè)其白術(shù)內(nèi)酯含量，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線，確定靜態(tài)吸附平衡時(shí)間。

1.3.2.4柱條件的優(yōu)選。

(1)上樣液濃度考察。稱取D101大孔樹脂4 份，濕法裝成徑高比為1∶6的樹脂柱，取4種不同濃度白術(shù)內(nèi)酯提取液各4 BV(白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III質(zhì)量濃度分別為5.1和11.2、11.6和27.6、15.3和43.9、24.5和58.7 μg/mL，試驗(yàn)編號(hào)依次為1、2、3、4)，以2 BV/h的流速分別通過4根樹脂柱，測(cè)定流出液白術(shù)內(nèi)酯含量，計(jì)算白術(shù)內(nèi)酯的吸附率，優(yōu)選出最佳上樣液濃度。

(2)上樣流速考察。取4根徑高比為1∶6的 D101大孔樹脂柱，分別以1、2、3、4 BV/h的流速連續(xù)加入4 BV白術(shù)內(nèi)酯提取液(白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的含量分別為16.3和43.1 μg/mL)，待提取液全部通過樹脂柱后，測(cè)定流出液白術(shù)內(nèi)酯含量，計(jì)算白術(shù)內(nèi)酯的吸附率，優(yōu)選出最佳上樣流速。

(3)最大上樣量考察。取1根徑高比為1∶6的 D101大孔樹脂柱，以1 BV/h的流速連續(xù)加入白術(shù)提取液(白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的含量分別為11.4和29.9 μg/mL)，每份收集1 BV，測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯含量，以收集份數(shù)為橫坐標(biāo)、流出液中白術(shù)內(nèi)酯質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)作圖，根據(jù)泄漏情況得出最大上樣量。

1.3.2.5洗脫條件的優(yōu)選。

(1)洗脫流速考察。取已知吸附量的4根樹脂柱，先用適量去離子水(約16 BV)洗滌樹脂至流出液為無色透明，再用4 BV體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇為洗脫劑，分別以1、2、3、4 BV/h流速洗脫，待洗脫劑全部通過樹脂后，測(cè)定流出液白術(shù)內(nèi)酯含量，計(jì)算白術(shù)內(nèi)酯的洗脫率，優(yōu)選出最佳洗脫流速。

(2)洗脫劑濃度考察。取已知吸附量的1根樹脂柱，先用適量去離子水洗滌樹脂至流出液為無色透明，再依次用2 BV體積分?jǐn)?shù)30%、50%和75%乙醇，以2 BV/h流速洗脫，每份收集1 BV，測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯含量，計(jì)算白術(shù)內(nèi)酯的洗脫率，優(yōu)選出最佳洗脫劑濃度。

(3)洗脫劑用量考察。取已知吸附量、并用去離子水洗去提取液的樹脂柱1根，用75%乙醇以2 BV/ h流速進(jìn)行洗脫，每份收集1 BV，測(cè)定流出液白術(shù)內(nèi)酯含量，以收集份數(shù)為橫坐標(biāo)、流出液中白術(shù)內(nèi)酯質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)作圖，得出洗脫劑用量。

1.3.2.6大孔樹脂重復(fù)使用次數(shù)的考察。①按優(yōu)選出工藝參數(shù)進(jìn)行上樣和洗脫，考察大孔樹脂重復(fù)使用次數(shù)。為了提高工作效率，洗脫流程稍作簡(jiǎn)化，即先用大量水沖洗掉大孔樹脂柱中白術(shù)提取液，然后只用3 BV的30%乙醇除雜、8 BV的75%乙醇洗脫。②大孔樹脂再生，用10 BV 95%乙醇樹脂浸泡3次，每次1 h，再用10 BV 95%乙醇浸泡24 h，最后用水洗至無醇味。按①和②重復(fù)操作。

果桑是以產(chǎn)果為主、果葉兼用型桑樹的統(tǒng)稱，其果實(shí)桑椹具有豐富的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，花青素含量極高，抗氧化功效明顯，具有促進(jìn)造血細(xì)胞生長(zhǎng)、降血糖、降血脂等藥理作用，被衛(wèi)生部列為“既是食品又是藥品”名單［1，2］。桑椹除直接食用外，目前已開發(fā)出果汁飲品、桑果酒、桑果醬、桑椹膏及花青素等產(chǎn)品，表現(xiàn)出巨大的產(chǎn)業(yè)發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場(chǎng)前景［3，4］。 然而在果桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中，桑椹菌核病來勢(shì)猛、發(fā)病快，發(fā)病率高達(dá)30%～90%，有些果桑園甚至絕產(chǎn)［5］，桑椹菌核病已成為限制果桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。

2　結(jié)果與分析

2.1大孔樹脂的篩選

2.1.1大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸比較。影響大孔樹脂吸附性能的因素有很多，通常大孔樹脂的結(jié)構(gòu)、極性、粒徑、比表面積、孔徑以及被吸附分子大小、結(jié)構(gòu)、極性等是影響吸附性能的重要因素，不同型號(hào)的樹脂，由于結(jié)構(gòu)、極性等存在差異，導(dǎo)致對(duì)被吸附分子吸附、解吸的難易程度也不同。為尋找適合富集白術(shù)內(nèi)酯的樹脂，該試驗(yàn)選取D101、NKA、H107、X-5、DM130、AB-8大孔樹脂對(duì)白術(shù)粗提液進(jìn)行處理，運(yùn)用靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)進(jìn)行篩選。由表1可知，6種大孔樹脂對(duì)白術(shù)內(nèi)酯吸附率和解吸率存在差異，說明大孔樹脂對(duì)白術(shù)內(nèi)酯的吸附、解吸有一定的選擇性。綜合考慮吸附和解吸情況，6種大孔樹脂中D101、NKA和AB-8對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III情況相當(dāng)且效果最佳。李鴻翔等[19]已用AB-8對(duì)白術(shù)內(nèi)酯III的分離純化進(jìn)行了研究，該試驗(yàn)選定D101和NKA大孔樹脂進(jìn)行進(jìn)一步考察。

2.1.2靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)考察。單用大孔樹脂的靜態(tài)吸附率和解吸率來評(píng)價(jià)其性能不是很全面，還應(yīng)該考慮其吸附速度，所以需研究其靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特征。由圖2可知，在0～0.5 h內(nèi)，D101大孔樹脂對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的吸附較快，隨后吸附速度減緩，白術(shù)內(nèi)酯III在4 h時(shí)吸附基本達(dá)到平衡，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ在4.5 h時(shí)吸附基本達(dá)到平衡。NKA大孔樹脂對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的吸附情況與D101相似，但在5 h 時(shí)吸附才基本達(dá)到平衡，因此，確定用D101大孔樹脂富集白術(shù)粗提物中的白術(shù)內(nèi)酯。

表1　6種大孔樹脂性能、靜態(tài)吸附和解吸結(jié)果解吸結(jié)果

2.2D101樹脂動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

2.2.1上樣液濃度對(duì)吸附效果的影響。大孔樹脂吸附目標(biāo)分子時(shí)存在一個(gè)吸附平衡，該平衡與上樣液質(zhì)量濃度有很大關(guān)系。試驗(yàn)中所選的4種質(zhì)量濃度白術(shù)提取液，D101大孔樹脂對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的吸附率均達(dá)100.00%，表明樹脂吸附量尚未達(dá)到飽和狀態(tài)；對(duì)白術(shù)內(nèi)酯III的吸附率分別為100.00%、100.00%、92.48%和87.91%，表明在白術(shù)內(nèi)酯III濃度較低的情況下，增加濃度(由11.2 μg/mL升至27.6 μg/mL)，吸附率仍能達(dá)100.00%。這是因?yàn)闈舛容^低時(shí)，提高上柱液濃度可增加白術(shù)內(nèi)酯分子與樹脂的接觸，加速白術(shù)內(nèi)酯分子進(jìn)入樹脂內(nèi)部并迅速擴(kuò)散，隨著濃度的提高樹脂的吸附量也隨之增加，吸附率保持不變。但若濃度再提高，如由27.6 μg/mL增加至43.9 μg/mL甚至58.7 μg/mL，吸附率隨之而減少。因?yàn)殡S著濃度的再增大，被吸附的雜質(zhì)量也隨之加大，同時(shí)樹脂接觸表面白術(shù)內(nèi)酯分子過多，阻礙其他白術(shù)內(nèi)酯分子進(jìn)入樹脂內(nèi)部，影響白術(shù)內(nèi)酯分子在樹脂內(nèi)部的擴(kuò)散，導(dǎo)致樹脂吸附率有所下降。但即使在第4種濃度下，白術(shù)內(nèi)酯III吸附率仍能達(dá)87.91%，說明用4種濃度上樣均可?？傮w來看，上樣液濃度越大，樹脂的吸附量越大、利用率也亦高。但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，上樣液濃度越大渾濁度愈越大，不僅給后面的試驗(yàn)帶來麻煩，且造成原料浪費(fèi)。綜合考慮，確定以白術(shù)內(nèi)酯III質(zhì)量濃度為主要參考，不宜超過60 μg/mL。

圖2　D101(a)和NKA(b)大孔樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2　Static adsorption kinetics curve of D101(A) and NKA(B) macroporous resins

2.2.2上樣流速對(duì)吸附效果的影響 。試驗(yàn)中所選的4種流速，D101大孔樹脂對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的吸附率均達(dá)100.00%，表明樹脂吸附量尚未達(dá)到飽和狀態(tài)；對(duì)白術(shù)內(nèi)酯III的吸附率分別為94.43%、92.58%、87.70%和85.15%，表明隨上樣流速的增加吸附率下降。可能是因?yàn)榱魉佥^快時(shí)，白術(shù)內(nèi)酯III與樹脂的接觸時(shí)間較短，來不及擴(kuò)散到樹脂內(nèi)部并被吸附便流出，僅僅靠樹脂表面的吸附使得吸附率降低。上樣流速慢，白術(shù)內(nèi)酯III分子有充足的時(shí)間與樹脂的內(nèi)表面接觸，增加對(duì)白術(shù)內(nèi)酯III的吸附，從而提高吸附率。但流速過慢時(shí)，耗時(shí)多，導(dǎo)致循環(huán)周期延長(zhǎng)。上樣流速由2 BV/h 增加至3 BV/h時(shí)，吸附率由92.58%下降至87.70%。綜合考慮，確定上樣流速為2 BV/h。

2.2.3最大上樣量考察。由圖3可知，用白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III質(zhì)量濃度分別為11.4和29.9 μg/mL上樣液、以1 BV/h上樣，在26 BV時(shí)流出液中白術(shù)內(nèi)酯III開始泄露(泄漏點(diǎn)是流出液中白術(shù)內(nèi)酯濃度為上樣濃度的1/10)，此時(shí)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ尚處于未飽和狀態(tài)。最終確定該條件下D101的最大上樣量(以白術(shù)內(nèi)酯III為準(zhǔn))為26 BV。

圖3　 泄漏曲線Fig.3　Leakage curve

2.3.1洗脫流速對(duì)洗脫效果的影響。用4 BV體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇為洗脫劑，以1、2、3、4 BV/h流速進(jìn)行洗脫，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的洗脫率分別為70.95%、70.27%、68.92%和53.38%，白術(shù)內(nèi)酯III的分別為93.69%、87.54%、76.62%和68.86%，表明隨洗脫流速的增大洗脫效果下降，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的下降較緩，白術(shù)內(nèi)酯III的下降較明顯，總體來看，速度越慢洗脫效果越好。這可能是因?yàn)榱魉偬?，洗脫劑未能與被吸附的白術(shù)內(nèi)酯進(jìn)行充分作用而將其從大孔樹脂的吸附位點(diǎn)上置換出。但流速過低，洗脫時(shí)間較長(zhǎng)?？紤]工作效率和綜合試驗(yàn)結(jié)果，該研究確定洗脫流速為2 BV/h。

2.3.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫效果的影響。大孔樹脂吸附法是根據(jù)被分離物質(zhì)與樹脂之間吸附力強(qiáng)弱來選擇不同的洗脫劑和相應(yīng)的洗脫劑濃度。對(duì)于極性都小的大孔樹脂和被分離的物質(zhì)分子來說，洗脫劑極性越小，洗脫效果越好?？紤]到白術(shù)內(nèi)酯通常應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)中，因此該試驗(yàn)選用無毒性的乙醇作為洗脫劑。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III均為弱極性分子，D101為非極性大孔樹脂，因此，乙醇的體積分?jǐn)?shù)越大洗脫效果越好。

由圖4可知，體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇不能將白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III從樹脂上洗脫下來，50%和75%乙醇均能將白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III從樹脂上洗脫下來，后者的洗脫效果明顯好于前者。90%乙醇對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的洗脫效果更高些，但相應(yīng)洗脫下的脂溶性雜質(zhì)增多，產(chǎn)品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III含量降低且?guī)?。因此，確定洗脫劑用75%乙醇。

圖4　 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫效果的影響Fig.4　 Effects of volume fraction of ethanol on eluting effect

2.3.3洗脫劑用量。由圖5 可知，對(duì)于白術(shù)內(nèi)酯III動(dòng)態(tài)洗脫曲線，峰單一、尖銳、對(duì)稱，且沒有明顯的拖尾現(xiàn)象，洗脫高峰相對(duì)集中在7～12 BV；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ動(dòng)態(tài)洗脫曲線較平緩，有拖尾現(xiàn)象。用6 BV 75%乙醇基本能將白術(shù)內(nèi)酯III從D101大孔樹脂上洗脫下來，回收率98.24%，此時(shí)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的回收率為96.67%，若再增加5 BV洗脫劑，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的回收率>100.00%。

圖5　動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.5　Dynamic elution curve

2.4大孔樹脂重復(fù)使用次數(shù)的考察一般情況下，大孔樹脂在重復(fù)使用多次后，因吸附物質(zhì)會(huì)引起樹脂中毒。從表2可看出，樹脂隨著重復(fù)使用次數(shù)的增加，白術(shù)內(nèi)酯回收率雖然有所下降，但重復(fù)使用了8次，白術(shù)內(nèi)酯III的回收率僅減少不到4%，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ稍多些，也減少不到8%。說明此工藝樹脂中毒現(xiàn)象較輕，適合白術(shù)內(nèi)酯的重復(fù)分離。

表2　D101大孔樹脂重復(fù)使用結(jié)果

3　結(jié)論與討論

通過比較白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III靜態(tài)吸附和解吸效果，從6種大孔吸附樹脂中篩選出D101樹脂適用于這2種白術(shù)內(nèi)酯的富集。最佳工藝參數(shù)：濕法裝成徑高比1∶6的樹脂柱，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III質(zhì)量濃度分別為25.6和59.7 μg/mL的上樣液4 BV，以2 BV/h流速上樣，依次用大量(15 BV以上)水和6 BV 30%乙醇洗滌樹脂，除去上樣液和雜質(zhì)，再用12 VB 75%乙醇以2 BV/h洗脫，此條件下白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III的回收率分別達(dá)100.00%和98.24%。

該試驗(yàn)與文獻(xiàn)[19]的差異是：首先增加了一個(gè)考察指標(biāo)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，因?yàn)榘仔g(shù)內(nèi)酯Ⅰ也是白術(shù)的主要活性；其次證明了D101樹脂也適合于白術(shù)內(nèi)酯的分離純化；第三，白術(shù)粗提液的制法不同，該研究用乙醇為溶媒、超聲輔助提取法，因?yàn)榘仔g(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III均為弱極性分子，在乙醇中的溶解度大于在水中的；超聲輔助提取法具有快速、省時(shí)、節(jié)能、高效等優(yōu)點(diǎn)。該試驗(yàn)證明，欲制備質(zhì)量濃度相同的白術(shù)內(nèi)酯III粗提液，時(shí)間和白術(shù)藥材均比文獻(xiàn)[19]的方法極大地節(jié)省，操作程序簡(jiǎn)化。

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Technology of Atractylenolide Enrichment I and III by D101 Macroporous Resin

ZHOU Mei1,LIANG Zhi-yuan1,2*,GAN Xiu-hai1,2et al

(1.School of Chemistry and Life Science,Guizhou Normal College,Guiyang,Guizhou 550018; 2.Research Institute of Medicinal Plant,Guizhou Normal College,Guiyang,Guizhou 550018)

[Objective] To research the enrichment process of atractylconolide Ⅰ and III withAtracttylodesmacrocephalaKoidz as the research materials.[Method] The enrichment effects of 6 different macroporous resins were compared by static adsorption and desorption experiments.Dynamic test was carried out on the best macroporous resin.[Result] The optimal technology of atractylconolide Ⅰ and III enrichment by D101 macroporous resin was as follows：mass concentrations of atractylcnolideⅠand III were 25.6.2 and 59.7 μg/mL,respectively; 4 BV sample volume,2 BV/h flow rate,eluting with 16 BV water,6 BV 30% ethanol and 12 BV 75% ethanol in turn.Under this condition,the the recovery rate of atractylcnolideⅠand III were up to 100.00% and 98.24%,respectively.[Conclusion] It is a simple and effective enrichment process of atractylcnolide from crude extracts ofAtracttylodesmacrocephalaKoidz by D101 macroporous.

貴陽市烏當(dāng)區(qū)科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目([2012]烏科技合同字第53號(hào))。

周玫(1984- )，女，山東榮城人，講師，碩士，從事天然產(chǎn)物化學(xué)成分研究。*通訊作者，教授，從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。

2016-06-20

R 284.1;R 282.71

A

0517-6611(2016)24-131-05