孫薛蛟, 駱紅梅

(1.貴陽中醫(yī)學院，貴州貴陽 550002；2.貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，貴州貴陽 550001)

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一種野山參微量DNA的提取方法

孫薛蛟1, 駱紅梅2*

(1.貴陽中醫(yī)學院，貴州貴陽 550002；2.貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，貴州貴陽 550001)

[目的]通過優(yōu)化CTAB提取法從少量的野山參須根提取DNA，使其保持野山參形態(tài)的完整。[方法]綜合比較CTAB 提取法及其他3種DNA提取法，篩選出較為適合少量藥材DNA的提取方法。[結(jié)果]從5 mg人參根須提取DNA，栽培參DNA濃度為200～1 000 ng/μL，野山參為50～100 ng/μL，電泳可檢測到清晰的條帶，滿足濃度和純度的要求。[結(jié)論]該研究采用改進的高鹽SDS法能從5 mg微量人參須根材料中提取高質(zhì)量DNA，滿足濃度和純度的要求，可作為其他藥材微量組織提取DNA 的參考方法。

栽培參；野山參；DNA提取

自20世紀50年代提出DNA雙螺旋模型以來，分子生物學的研究進入了新的高度。而DNA提取是分子生物學研究的關(guān)鍵步驟，同時DNA 質(zhì)量的好壞關(guān)系到后續(xù)工作的成功與否。目前，DNA 提取方法較多[1]，針對試驗目的而有所差異，就植物本身而言，目前較為通用的方法是CTAB(cetyl triethyl ammonium bromide) 法[2-3]。該方法提取的DNA 純度較高；但植物成分復雜多樣，不適用于微量DNA的提取。而針對珍稀藥材野山參的遺傳多樣性和DNA 進行指紋鑒定，有必要研究微量材料的DNA 提取方法，以便從少量須根提取DNA 而不破壞野山參的整體形態(tài)。筆者改進了DNA提取方法，設計了一種簡便的DNA提取方案，通過收率和DNA質(zhì)量與經(jīng)典CTAB法進行比較以期為其他藥材微量組織DNA的提取方法提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料栽培人參(PanaxginsengC. A. Mey.)，5個野山參標本參齡為40～50年，均來自吉林省撫松縣，由王志民教授鑒定。用栽培參的材料比較DNA提取方法和RAPD擴增的效果，然后用效果最好的方法提取5個野山參樣品加以驗證。

1.2DNA 提取方法

1.2.1經(jīng)典的CTAB方法。稱取0.005 g干燥須根液氮研磨，預加熱至 65 ℃，2×CTAB(2%CTAB，100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mmol/L NaCl)緩沖液600 μL，65 ℃水浴1 h，不斷振蕩混勻，用等體積氯仿∶異戊醇(V/V=24∶1)抽提，11 000 r/min離心30 s，上清加入1/10體積10%CTAB/NaCl混勻，加等體積氯仿∶異戊醇(V/V=24∶1)混勻，11 000 r/min離心30 s，取上清加等體積1×CTAB沉淀緩沖液混勻，60 ℃ 保溫30 min，11 000 r/min離心10 min，沉淀溶于2 μL高鹽TE溶液，加等體積預冷無水乙醇，-20 ℃保存30 min以上，10 000 r/min離心10 min，70%乙醇洗2遍，沉淀在室溫下干燥，溶于50 μL 0.1×TE，加入1 μL RNase(10 μg/μL)，于65 ℃保溫30 min。

1.2.2改良的CTAB方法。稱取0.005 g干燥人參須根液氮研磨，吸入600 μL于65 ℃預熱的CTAB抽提液，65 ℃水浴1 h，不斷振蕩混勻， 用等體積氯仿∶異戊醇(V/V=24∶1)抽提，10 000 r/min離心10 min。此步驟可以用酚∶氯仿∶異戊醇溶液(V/V/V=25∶24∶1)或氯仿∶異戊醇(V/V=24∶1)重復抽提一次。取上清液加入1/10(V/V)的NaAc(3 mol/L)，加入2倍體積的無水乙醇。混勻后于-20 ℃保存30 min或更長時間，10 000 r/min離心15 min，沉淀物用500 μL 70%乙醇洗滌，沉淀55 ℃烘干，溶于50 μL滅菌水中，加入1 μL RNase(10 μg/μL)，于65 ℃保溫30 min。所得基因組DNA于-20 ℃保存。

1.2.3SDS裂解的高鹽低pH方法。稱取0.005 g干燥人參須根液氮研磨，吸入600 μL于65 ℃預熱的SDS抽提液，然后在65 ℃水浴中保溫45 min，期間每5 min顛倒混勻一次。加入相當于其2/3體積的KAc溶液(2.5 mol/L，pH 4.8)，顛倒3次混勻?；旌衔镌诒响o置30 min，8 000 r/min離心6 min，取上清液加入1/10(V/V)的NaAc(3 mol/L)，再加入0.6倍體積的異丙醇，混勻后于-20 ℃保存30 min或更長時間。10 000 r/min離心15 min，沉淀物用500 μL 70%乙醇洗滌，沉淀55 ℃烘干，溶于50 μL滅菌水中，加入1 μL RNase(10 μg/μL)，于65 ℃保溫30 min。所得基因組DNA于-20 ℃保存。1.2.4改進的高鹽SDS方法。稱取0.005 g干燥人參須根液氮研磨，吸入600 μL于65 ℃預熱的SDS抽提液(100 mmol/L NaAc，50 mmol/L NaCl，2% PVP，1.4% SDS，pH調(diào)至5.5，使用前加入2%的β-巰基乙醇)，然后在65 ℃水浴中保溫45 min，期間每5 min顛倒混勻一次。自水浴中取出后，靜置至室溫。6 000 r/min離心5 min，取上清液，加入相當于其2/3體積的KAc溶液(2.5 mol/L，pH為4.8)，顛倒3次混勻。混合物在冰上靜置30 min，然后8 000 r/min離心6 min，取上清液，加入等體積的氯仿∶異戊醇(V/V=24∶1)充分混勻，8 000 r/min離心6 min，取上清液，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻后于-20 ℃保存1 h或更長時間。10 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀物在55 ℃烘箱中烘干，溶于50 μl滅菌水，加入1 μL RNase(10 μg/μL)，于65 ℃保溫30 min。補充450 μL滅菌水，加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇溶液(V/V/V25∶24∶1)，充分混勻，10 000 r/min離心10 min，取上清液加入1/10(V/V)的NaAc(3 mol/L)，加入2倍體積的無水乙醇?；靹蚝笥?20 ℃保存30 min或更長時間，10 000 r/min離心15 min，沉淀物用500 μL 70%乙醇洗滌，沉淀55 ℃烘干，溶于50 μL滅菌水中。所得基因組DNA于-20 ℃保存。

2　結(jié)果與分析

2.1采用經(jīng)典的CTAB方法抽提的人參DNA采用該方法得到的DNA含量甚低，電泳檢測不到，分光光度計也未檢測到。

2.2采用改良的CTAB方法抽提的人參DNA采用該方法得到的DNA沉淀物呈透明膠狀物質(zhì)，可能為多糖類物質(zhì)。分光光度計檢測栽培參DNA濃度達50～200 ng/μL。采用逐級稀釋DNA的方法進行PCR， 得到的條帶均較弱，重復試驗發(fā)現(xiàn)條帶不穩(wěn)定，說明DNA得率不高且含有雜質(zhì)干擾擴增。如果采用4×CTAB或6×CTAB做抽提液，因黏稠不易與材料充分混勻，需要提高水浴時間，但會增加DNA的降解，電泳檢測發(fā)現(xiàn)拖尾現(xiàn)象嚴重(圖1)。

圖1　高濃度CTAB抽提的栽培參總DNA電泳圖譜Fig.1　Extraction of total DNA of cultivated ginseng by high concentration CTAB method

2.3采用SDS裂解的高鹽低pH方法抽提的人參DNA采用該方法得到的DNA沉淀物較多，但不透明，為淺黃色甚至黃褐色，可能是色素未除凈或抽提過程中酚類物質(zhì)氧化。電泳檢測發(fā)現(xiàn)栽培參有清晰的主帶，但點樣孔中有多糖或者蛋白質(zhì)殘留。分光光度計檢測栽培參DNA濃度在200 ng/μL以上，但純度較差。采用逐級稀釋DNA方法進行PCR，發(fā)現(xiàn)稀釋10～100倍后才能擴增出較亮條帶，且不穩(wěn)定，說明該方法雖然DNA得率高但含有較多雜質(zhì)干擾擴增(圖2)。

圖2　SDS裂解的高鹽低pH法抽提的栽培參總DNA電泳圖譜Fig.2　Extraction of total DNA of cultivated ginseng by improved high salt SDS and low pH method

圖3　改進的高鹽SDS法抽提的栽培參的基因組DNA電泳圖譜Fig.3　Extraction of the genomic DNA of wild ginseng by improved high salt SDS method

圖4　改進高鹽SDS法抽提的野山參基因組DNA電泳圖譜Fig.4　Extraction of the genomic DNA of wild ginseng by improved high salt SDS method

2.4采用改進的高鹽SDS方法抽提的人參DNA采用該方法得到的DNA沉淀物為無色透明，電泳可檢測到清晰的條帶。分光光度計檢測，栽培參DNA濃度為200～1 000 ng/μL，野山參濃度為50～100 ng/μL。PCR可得到明亮、穩(wěn)定的條帶，滿足濃度和純度的要求。野山參與栽培參比較，DNA得率低，電泳檢測主帶不清晰，有大量彌散的小片段(圖3、4)。

3　結(jié)論與討論

該試驗利用SDS抽提方法高收率的優(yōu)點，并增加了適當?shù)牟襟E去除雜質(zhì)，以避免SDS抽提方法純度不高的缺點。去除雜質(zhì)的步驟只是適當增加，否則不僅會使得率大大降低，也會使基因組的完整性遭到破壞。

SDS抽提液中加入5%聚乙烯吡咯呤酮(PVP)，其CO-N-基有很強的多酚化合物結(jié)合能力，且隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強，在苯酚和氯仿抽提時除去，可防止酚類化合物被釋放且氧化后與總DNA結(jié)合產(chǎn)生褐化效應，導致總DNA的活性喪失以及在用苯酚氯仿抽提時的丟失。加入KAc溶液前離心去除殘渣，可使KAc溶液充分作用使得蛋白質(zhì)變性。先后使用氯仿∶異戊醇(V/V=24∶1)和酚∶氯仿∶異戊醇溶液(V/V/V=25∶24∶1)抽提，使蛋白質(zhì)去除更徹底，在高鹽低pH條件下，也可除去一些多糖。采用二次沉淀辦法，去除雜質(zhì)更徹底，一次沉淀用異丙醇，DNA沉淀的得率高但雜質(zhì)較多，二次沉淀用無水乙醇，DNA沉淀得率相對較低，但雜質(zhì)少，注意在-20 ℃下沉淀1 h以上甚至過夜會得到較多DNA，如果離心后發(fā)現(xiàn)無任何沉淀，可以繼續(xù)放入冰箱沉淀或加大離心速度和時間。

野山參由于生長年份長、采集過程復雜、保存困難等原因致使樣品本身DNA降解較多，獲取的基因組DNA質(zhì)量不高。栽培參相對于野山參而言DNA提取較易，而且無論是野山還是栽培參各樣品間的DNA提取難易程度不一，表明人參樣品的采集、加工和保存等與DNA質(zhì)量關(guān)系密切。

[1] FU R Z, SUN Y R, JIA S R. Plant genetic transformation technical manuals[M].Beijing: China Science and Technology Publishing House, 1994:131.

[2]SCOTT O R, ARNOLD J B. Extraction of DNA from milligram amount s of fresh[J].Herbarium and mummified plant tissues plant molecular biology, 1985, 5: 69.

[3]GU H Y, QU L J, MING X T,0et al.plant genetic and molecular operation[M].Beijing: Peking University Press, 1995:19.

A Kind of Wild Ginseng Trace DNA Extraction Method

SUN Xue-jiao1, LUO Hong-mei2*

(1. Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang, Guizhou 550002; 2. The Second Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang, Guizhou 550001)

[Objective] The aim was to optimize CTAB method for DNA extraction from a small amount of fibrous roots of wild ginseng to keep the integrity form of wild ginseng. [Method] CTAB extraction method and other three kinds of DNA extraction method were comprehensively compared, CTAB method which is suitable for DNA extraction from a small amount of medicinal herbs was selected. [Result] DNA was extracted from 5 mg ginseng root, the concentration of cultivated ginseng DNA was 200-1 000 ng/μL, wild ginseng was 50-100 ng/μL, electrophoresis can detect clear strip, meet the requirements of the concentration and purity. [Conclusion] The improved high salt SDS method can extract high quality DNA from 5 mg trace ginseng fibril material. This method meet the requirements of the concentration and purity, and can be the reference method for extracting DNA from other medicinal materials.

Cultivated ginseng; Wild ginseng; DNA extraction

孫薛蛟(1990- )，男，重慶豐都人，碩士研究生，研究方向：中藥化學成分及中藥新藥研究。*通訊作者，副主任藥師，從事醫(yī)院藥學、醫(yī)院制劑研究。

2016-07-18

S 188

A

0517-6611(2016)24-155-02