涂 杜，羅 佳，徐志宏*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所，廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點開放實驗室，廣東廣州 510610)

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空間誘變后嗜酸乳酸菌對小鼠腸道功能的影響

涂 杜1，羅 佳2，徐志宏1*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所，廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點開放實驗室，廣東廣州 510610)

[目的]利用空間誘變技術處理嗜酸乳酸菌(Lactobacillusacidophilus)，探討空間誘變后菌株對小鼠腸道功能的影響。[方法]40只昆明小鼠適應性喂養(yǎng)7 d后隨機分為4組：誘變前菌株組(SBM組)、誘變后菌株組(SAM組)、合生元益生菌組(BP組)和空白對照組(NC組)，每組各10只。通過灌喂不同的菌懸液，探討其對小鼠腸道菌群、小腸運動功能和排便的影響。[結果]SAM組小鼠糞便中的雙歧桿菌和乳桿菌顯著高于誘變前菌株組和空白對照組(P<0.05)，腸球菌和腸桿菌顯著低于誘變前菌株組和空白對照組(P<0.05)，與合生元益生菌組無明顯差異(P>0.05)；誘變后菌株組小鼠的小腸運動功能和排便功能優(yōu)于誘變前菌株組和空白對照組(P<0.05)。[結論]空間誘變后的嗜酸乳酸菌改善小鼠胃腸道功能的效果優(yōu)于誘變前的乳酸菌，與市售合生元相當。

空間誘變；嗜酸乳酸菌；腸道菌群；小腸推進率

空間誘變育種是近年來興起的一種新型誘變技術?？臻g環(huán)境能夠影響微生物的生物學形態(tài)和表型，是微生物誘變育種的有效方法[1-2]。關于益生菌和益生元對人和動物健康的研究，尤其是調(diào)節(jié)機體腸道菌群、改善腸道環(huán)境以及提高免疫功能方面也已成為益生菌研究的核心和熱點問題。乳酸菌是人和動物腸道內(nèi)的正常菌群之一。大量研究表明，乳酸菌能夠通過競爭黏附、抑制病原菌生長、刺激免疫防御等作用維持著腸道菌群平衡。外源乳酸菌進入腸道后，可以迅速黏附于腸道上皮的吸附位點，其代謝產(chǎn)生的乳酸、二氧化碳使腸內(nèi)pH迅速降低，抑制了大腸桿菌、沙門菌、鏈球菌等病原菌及有害細菌的繁殖，從而起到預防感染和維持腸道內(nèi)菌群平衡的作用[3]。嗜酸乳酸菌(Lactobacillusacidophilus)具有良好的耐受胃酸及膽汁濃度的能力，并對致病性埃希氏大腸桿菌有抑制作用，因此成為乳酸菌家族中主要研發(fā)的菌株之一[4-5]。近年來，利用空間搭載技術已對多種微生物進行了誘變處理，并取得了豐富的成果，但對嗜酸乳酸菌株的篩選還只限于傳統(tǒng)的物理和化學方法誘變篩選，迄今為止利用空間誘變的研究報道較少。農(nóng)業(yè)部功能食品重點開放實驗室借助我國第22顆返回式科學與技術試驗衛(wèi)星，搭載了嗜酸乳酸桿菌進行空間誘變育種。筆者對誘變后嗜酸乳酸菌的腸道功能進行了初步研究，探討經(jīng)過空間誘變后嗜酸乳酸菌菌株的變化。

1　材料與方法

1.1菌株利用我國第22顆返回式科學與技術試驗衛(wèi)星在酒泉衛(wèi)星發(fā)射中心成功發(fā)射升空的搭載機會，廣東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所(現(xiàn)廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所)選送了嗜酸乳酸菌進行微生物菌種的空間誘變育種技術研究。按照發(fā)射中心的要求，實驗室貯藏的嗜酸乳酸菌以0.5 mL離心管甘油的保存方式搭載，共搭載2個平行試管。誘變后的菌株命名為突變菌株嗜酸乳酸菌，簡稱SAM(Strain after mutagenesis)菌株。對照菌株為選送空間誘變時同一條件下對照保存的原始菌株，簡稱SBM(Strain before mutagenesis)菌株。

2種菌株活化后，經(jīng)MRS培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，離心收集菌體，菌體用無菌生理鹽水洗滌3次后，用無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度為1×1010CFU/mL的菌懸液，置于-20 ℃冰箱中保存待用。

合生元兒童益生菌沖劑(廣州市合生元生物制品有限公司)，規(guī)格1.5/袋，批號1001038；使用前用無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度為1×1010CFU/mL的菌懸液，置于-20 ℃冰箱中保存待用。

1.2實驗動物昆明SPF純種小白鼠，體重18～22 g，雄性，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心，動物合格證號為2005A042/2006b008，光照周期為12 L∶12 D，室溫維持在22～25 ℃。

1.3主要儀器與試劑

1.3.1主要儀器。-80 ℃低溫冰箱(Thermo Electron，美國)；超凈工作臺(BCM-1000，蘇州)；721 型紫外分光光度計(Shimadzu，日本)；高壓蒸氣滅菌鍋(YXQ-LS-SⅡ，上海)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron，美國)；恒溫生化培養(yǎng)箱(Olympus，日本)；高速冷凍離心機(Sigma，德國)；電熱鼓風干燥箱(山東淄博儀表廠)等。

1.3.2主要試劑。 LBS 培養(yǎng)基、BBL培養(yǎng)基、腸球菌瓊脂(膽鹽 -七葉苷 - 疊氮鈉瓊脂)培養(yǎng)基、VRBDA 培養(yǎng)基、TSC(胰月示 -亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂基)(海博生物技術有限公司)；復方地芬諾脂片(河源市康泰制藥廠)；印度墨汁(海博生物技術有限公司)；其他常用生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.4方法

1.4.1動物分組與處理。40只昆明小鼠適應性喂養(yǎng)7 d后隨機分為4組：誘變前菌株組(SBM group)、誘變后菌株組(SAM group)、合生元益生菌組(BP group)和空白對照組(NC group)，每組各10只。從分組第1天開始，誘變前菌株組和誘變后菌株組小鼠按0.02 mL/g體重分別灌胃誘變前嗜酸乳酸菌懸液和誘變后嗜酸乳酸菌懸液，合生元益生菌組灌胃按0.02 mL/g體重比灌胃合生元菌懸液，空白對照組灌胃等量的生理鹽水，連續(xù)灌胃14 d，采集標本。

1.4.2小鼠腸道菌群分析。分別于試驗第1天和第14天無菌采集小鼠糞便約 0.1 g，置于已稱重的試管內(nèi)，4 h內(nèi)樣品進行10倍稀釋處理，取合適的稀釋度，分別傾注于各培養(yǎng)基(培養(yǎng)條件及方法見表1)中培養(yǎng)，測定腸道主要菌群。培養(yǎng)后，通過菌落形態(tài)、革蘭氏染色鏡檢、生化反應等鑒定計數(shù)菌落，計算出每克濕便中主要腸道菌群的數(shù)量，取對數(shù)后進行統(tǒng)計分析。

表1　腸道主要菌群的培養(yǎng)計數(shù)方法

1.4.3小鼠排便時間、糞便粒數(shù)和糞便重量的測定。小鼠排便時間、糞便粒數(shù)和糞便重量的測定參照文獻[6]。在第7天灌胃后禁食不禁水16 h，各組小鼠按10 mg/kgBW給予復方地芬諾脂灌胃，30 min后各組小鼠按0.01 mL/gBW給予墨汁灌胃，立即將小鼠放入鋪有濾紙的鼠籠內(nèi)，正常飲水進食。從灌墨汁開始準確及時，觀察記錄每只小鼠首粒排黑便時間，連續(xù)觀察6 h，記錄6 h內(nèi)小鼠排黑便粒數(shù)，同時記錄糞便性狀。

1.4.4小腸運動試驗。小腸運動試驗參照文獻[7]。在13 d灌胃后禁食不禁水，在第14天灌胃30 min后，各組小鼠按10 mg/kgBW灌胃復方地芬諾脂，再30 min后各組小鼠按0.01 mL/gBW給予墨汁灌胃。25 min后脫頸椎處死小鼠，打開腹腔分離腸系膜，剪去上端自幽門，下端至回盲部的腸管，置于托盤上，輕輕將小腸拉成直線，測定腸管長度為“小腸總長度”，從幽門至墨汁前沿的距離為“墨汁推進長度”，按下列公式計算小腸推進率(%)：小腸推進率(%)=墨汁推進長度(cm)/ 小腸總長度(cm)×100%。

1.4.5數(shù)據(jù)處理。對試驗數(shù)據(jù)進行兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用Duncan法。試驗結果以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2　結果與分析

2.1誘變前后嗜酸乳酸菌對小鼠腸道菌群的影響

2.1.1誘變前后嗜酸乳酸菌對小鼠腸道雙歧桿菌的影響。由表2可知，與正常小鼠(NC group)相比，灌胃不同的益生菌后小鼠糞便中的雙歧桿菌數(shù)量均顯著提高(P<0.05)。除空白對照組外，各試驗組灌胃14 d后，其糞便中的雙歧桿菌數(shù)均顯著高于第1天，其中誘變后菌株組小鼠雙歧桿菌數(shù)量增加顯著高于誘變前菌株組(P<0.05)，且與合生元益生菌組無顯著性差異(P>0.05)。

表2各試驗組小鼠糞便中雙歧桿菌數(shù)量的比較(n=10)

Table 2Bifidobacterium count of mice fecal in different experiment groups

組別Group雙歧桿菌數(shù)量Bifidobacteriumcount∥lgCFU/g第1天The1stday第14天The14thday誘變前菌株組SBMgroup8.61±0.16a9.06±0.22b誘變后菌株組SAMgroup8.66±0.12a9.41±0.14c*合生元益生菌組BPgroup8.70±0.12a9.49±0.15c*空白對照組NCgroup8.60±0.17a8.62±0.11a

注：同列不同小寫字母表示同一時間不同組別在0.05水平上差異顯著(P<0.05)；*表示與同一組別第1天測定結果差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercases in the same column indicated significant differences among different groups at the same time at 0.05 level(P<0.05);* indicated significant differences with the determined results on the first day in the same group at 0.05 level(P<0.05).

2.1.2誘變前后嗜酸乳酸菌對小鼠腸道乳桿菌的影響。由表3可知，除空白對照組外，各試驗組灌胃14 d后，其糞便中的乳桿菌數(shù)量均顯著高于第1天，其中誘變后菌株組小鼠雙歧桿菌數(shù)增加顯著高于誘變前菌株組(P<0.05)，與合生元益生菌組無顯著差異(P>0.05)。這說明空間誘變后的嗜酸乳酸菌對小鼠腸道微生物具有調(diào)節(jié)作用，且效果優(yōu)于誘變前的菌株。

2.1.3誘變前后嗜酸乳酸菌對小鼠腸道腸桿菌的影響。由表4可知，與正常小鼠(NC group)相比，灌胃不同的益生菌后小鼠糞便中的腸球菌數(shù)量均顯著降低(P<0.05)，說明益生菌對腸道致病菌腸球菌有明顯的抑制作用，除空白對照組外，各試驗組灌胃14 d后，其糞便中的腸球菌數(shù)均顯著低于第1天，其中誘變后菌株組小鼠糞便中腸球菌數(shù)要顯著低于誘變前菌株組(P<0.05)，與合生元益生菌組無顯著性差異(P>0.05)。

表3各試驗組小鼠糞便中乳桿菌數(shù)量的比較(n=10)

Table 3Lactobacillus counts of mice fecal in different experiment groups

組別Group乳桿菌數(shù)量Lactobacilluscounts∥lgCFU/g第1天The1stday)第14天The14thday誘變前菌株組SBMgroup7.86±0.18a8.74±0.26b*誘變后菌株組SAMgroup7.92±0.16a9.33±0.16c*合生元益生菌組BPgroup8.25±0.26a9.41±0.20c*空白對照組NCgroup7.94±0.17a8.13±0.20a

注：同列不同小寫字母表示同一時間不同組別在0.05水平上差異顯著(P<0.05)；*表示與同一組別第1天測定結果差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercases in the same column indicated significant differences among different groups at the same time at 0.05 level(P<0.05);* indicated significant differences with the determined results on the first day in the same group at 0.05 level(P<0.05).

表4各試驗組小鼠糞便中腸球菌數(shù)量的比較(n=10)

Table 4Enterococcus counts of mice fecal in different experiment groups

組別Group腸球菌數(shù)量Enterococcuscounts∥lgCFU/g第1天The1stday)第14天The14thday誘變前菌株組SBMgroup7.27±0.25a6.47±0.16b*誘變后菌株組SAMgroup7.20±0.20a5.22±0.15a*合生元益生菌組BPgroup7.26±0.18a5.13±0.18a*空白對照組NCgroup7.22±0.24a7.09±0.16c

注：同列不同小寫字母表示同一時間不同組別在0.05水平上差異顯著(P<0.05)；*表示與同一組別第1天測定結果差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercases in the same column indicated significant differences among different groups at the same time at 0.05 level(P<0.05);* indicated significant differences with the determined results on the first day in the same group at 0.05 level(P<0.05).

2.1.4誘變前后嗜酸乳酸菌對小鼠腸道腸桿菌的影響。由表5可知，與正常小鼠(NC group)相比，灌胃不同的益生菌后小鼠糞便中的腸桿菌數(shù)量均顯著降低(P<0.05)，除空白對照組外，各試驗組灌胃14 d后糞便中的腸桿菌數(shù)量均顯著低于第1天，其中誘變后菌株組小鼠糞便中腸桿菌數(shù)量顯著低于誘變前菌株組(P<0.05)，與合生元益生菌組無顯著差異(P>0.05)。

表5各試驗組小鼠糞便中腸桿菌數(shù)量的比較(n=10)

Table 5Enterobacter counts of mice fecal in different experiment groups

組別Group腸桿菌數(shù)量Enterobactercounts∥lgCFU/g第1天The1stday)第14天The14thday誘變前菌株組SBMgroup8.56±0.18a7.88±0.19b*誘變后菌株組SAMgroup8.47±0.16a6.55±0.13a*合生元益生菌組BPgroup8.54±0.22a6.49±0.15a*空白對照組NCgroup8.57±0.21a8.48±0.18c

注：同列不同小寫字母表示同一時間不同組別在0.05水平上差異顯著(P<0.05)；*表示與同一組別第1天測定結果差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercases in the same column indicated significant differences among different groups at the same time at 0.05 level(P<0.05);* indicated significant differences with the determined results on the first day in the same group at 0.05 level(P<0.05).

2.2誘變前后嗜酸乳桿菌對小鼠排便時間、糞便粒數(shù)和糞便重量的影響從表6可以看出，造模后的小鼠排便有明顯障礙，說明模型成功建立。與空白對照組相比，幾種菌液均有改善小鼠腸道便秘的功能，在改善腸道便秘狀況的能力從大到小依次為：合生元益生菌、誘變后嗜酸乳酸菌、誘變后嗜酸乳酸菌。合生元益生菌組小鼠糞便濕潤，粒數(shù)較多，基本達到正常小鼠正常糞便狀態(tài)，誘變后菌株組略差于百生元益生菌組，但無明顯差異(P>0.05)，且與誘變前菌株組和空白對照組有顯著差異(P<0.05)。

表6　各試驗組小鼠排便時間、糞便粒數(shù)和糞便重量的比較(n=10)

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercases indicated significant differences at 0.05 level(P<0.05).

圖1　誘變前后嗜酸乳桿菌對小鼠小腸推進率的影響(n=10)Fig. 1　The comparison of progradation rate of small intestine in different groups

2.3誘變前后嗜酸乳桿菌對小鼠小腸推進功能的影響從圖1可以看出，誘變后菌株組、誘變前菌株組和合生元益生菌組的小腸推進率顯著高于空白對照組(P<0.05)，其中誘變后菌株組小鼠的小腸推進率顯著高于誘變前菌株組(P<0.05)，且與合生元益生菌無顯著差異(P>0.05)，說明誘變后嗜酸乳桿菌對小鼠小腸的推進功能要優(yōu)于誘變前嗜酸乳桿菌。

3　討論與結論

與常規(guī)的誘變技術相比，空間誘變是微重力、空間輻射、粒子撞擊、高真空等因素綜合作用的結果[3]?？臻g誘變效率高，變異幅度大，已成為一種新的誘變方式，被應用于植物、微生物及動物細胞的誘變研究。人和動物腸道內(nèi)存在著大量細菌，它們由需氧菌、厭氧菌以及兼性厭氧菌共同組成了一個復雜的微生態(tài)系統(tǒng)。每克糞便(濕重)中約有1011～1012個細菌，約占糞便重量的1/3。腸道菌群可分為對機體健康有益和有害2大類，雙歧桿菌和乳桿菌是有益菌的典型代表，這類菌可以抑制病原菌的生長繁殖，激活巨噬細胞的吞噬作用，增強機體免疫力，提高抗病能力；腸球菌和腸桿菌等是有害菌的代表菌，它們可將食物中的一些成分變?yōu)槎喾N有害物質(zhì)，如吲哚和胺類物質(zhì)，從而引起某些腸道疾病[8]。一旦腸道中有益菌和有害菌數(shù)量平衡失調(diào)，有害菌增加，會引起機體各種疾病。研究表明，乳酸菌可以抑制腸道致病菌如腸球菌和腸桿菌的生長，改善腸道益生菌群，對保持腸道菌群的平衡具有調(diào)節(jié)作用，從而減少腸道內(nèi)疾病的發(fā)生，促進宿主的健康[9-10]。

Vukanti等[11]觀察大腸桿菌和金色葡萄球菌在模擬失重條件下的代謝速度發(fā)現(xiàn)，與正常重力條件下培養(yǎng)的細菌相比，其代謝更加旺盛。筆者通過給小鼠灌喂不同的菌懸液，發(fā)現(xiàn)誘變后的嗜酸乳酸菌可以明顯促進小鼠腸道菌群中的雙歧桿菌和乳桿菌的增殖，而且腸球菌和腸桿菌也明顯減少，效果顯著優(yōu)于誘變前，與市售合生元相當。

試驗前期對誘變前后菌株進行生理生化測定，結果發(fā)現(xiàn)誘變后的菌株對乳糖的利用能力有正突變效應，因此這可能一方面是由于誘變后的菌株產(chǎn)乳酸和乙酸的能力增強，進入腸道后產(chǎn)生大量乳酸，腸道內(nèi)pH降低，有利于雙歧桿菌和乳桿菌的生長，同時可以抑制腐敗菌的生長繁殖；另一方面，嗜酸乳桿菌代謝水平發(fā)生變化，分泌抗生物素類物質(zhì)(嗜酸乳菌素(Acidolin)、嗜酸桿菌素(Acidophilin)、乳酸菌素(Laeto-cidon)增多，而這些細菌素對腸道致病菌具有拮抗作用[12]。嗜酸乳酸菌進入腸道后產(chǎn)生的乳酸，可使蛋白質(zhì)發(fā)生水解，增加可溶性鈣、磷及某些B族維生素的數(shù)量，進而促進食物在宿主體內(nèi)的消化吸收和腸道的蠕動；腸道內(nèi)pH降低，還可以提高胃蛋白酶活性，增強胃腸道消化功能?？臻g誘變育種是一個有效的育種新途徑。但是，對其誘變機理方面的研究尚未透徹，且誘變后嗜酸乳酸菌發(fā)生變化的分子機制(如基因組變化、代謝水平的變化等)尚不清楚，有待進一步研究。

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Effects ofLactobacillusacidophilusafter Space Mutation on Gastrointestional Function in Mice

TU Du1, LUO Jia2, XU Zhi-hong1*

(1.Guangdong Key Laboratory of Animal Disease Prevention, Guangdong Open Laboratory of Veterinary Public Health , Institute of Animal Health, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, Guangdong 510640; 2. Key Laboratory of Functional Food, Ministry of Agriculture, Sericultural and Agri-Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, Guangdong 510610)

[Objective] To study the effect ofLactobacillusacidophilusafter space mutation on gastroenteric function in mice. [Method] 40 Kunming male rats were equally divided into four groups randomly after 7 d, which were strain before mutagenesis group (SBM group), strain after mutagenesis group (SAM group),Biostimeprobioticgroup (BP group) and normal control group (NC group). There were ten mice in each group. Through feeding different bacteria suspensions, we researched their effects on cacation, intestinal flora, and small intestine movement function of rats. [Result] The counts of bifidobacterium and lactobacillus in SAM group were significant higher than SBM group and NC group (P<0.05), the intestine movement function and defecation function were better than SBM group and NC group (P<0.05). [Conclusion] Compared with strain before mutagenesis,Lactobacillusacidophilusafter space mutation can significantly improve the gastrointestinal function in mice. Its efficacy is equivalent with biostime.

Space mutation;Lactobacillusacidophilus; Intestinal flora; Small intestine advance rate

廣東省科技計劃項目(2015A020209080)；廣州市民生科技重大專項(201604020138)。

涂杜(1990- )，女，湖北黃岡人，碩士研究生，研究方向：腸道營養(yǎng)與免疫功能研究。*通訊作者，研究員，碩士生導師，從事功能食品及營養(yǎng)制劑的研制。

2016-07-11

S 865.1

A

0517-6611(2016)24-102-04