史曉磊

(上海德諾產(chǎn)品檢測有限公司，上海 200436)

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超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆芽中4-氯苯氧乙酸的含量

史曉磊

(上海德諾產(chǎn)品檢測有限公司，上海 200436)

[目的]采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立豆芽中4-氯苯氧乙酸的定性定量分析方法。[方法]樣品經(jīng)0.01 mol/L氫氧化鈉溶液提取，Oasis HLB固相萃取小柱凈化，C18色譜柱分離，乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，采用電噴霧離子源多反應(yīng)監(jiān)測模式下液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，基質(zhì)曲線外標(biāo)法定量。[結(jié)果]在最佳檢測條件下，4-氯苯氧乙酸在20～500 μg/L線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998 1，檢出限(S/N=3)為20 μg/kg。在加標(biāo)水平為20、60、100 μg/kg時(shí)的平均加標(biāo)回收率分別為87.62%、102.10%和100.00%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.48%、4.92%和6.59%。[結(jié)論]該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性良好、操作簡捷等的特點(diǎn)，能夠滿足殘留分析的要求。

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)；固相萃取(SPE)；豆芽；4-氯苯氧乙酸

4-氯苯氧乙酸，又稱對氯苯氧乙酸鈉，作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑，能有效地提高豆芽產(chǎn)量和質(zhì)量。很多不法商販為了利益，違法國家規(guī)定，在生產(chǎn)豆芽時(shí)繼續(xù)添加4-氯苯氧乙酸。目前，關(guān)于豆芽中4-氯苯氧乙酸的含量分析，大多采用高效液相色譜法[1-8]，該方法靈敏度高、分離效果好、定量準(zhǔn)確，已被證明是一種成熟的分析方法。然而采用液相色譜進(jìn)行分析時(shí)，被測物與干擾物在色譜柱中具有相同保留時(shí)間的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，對易污染的樣品易造成假陽性。近2年也有研究采用離子色譜法[9]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測定[10-12]。筆者利用目前國際上最為先進(jìn)和普遍采用的殘留檢測技術(shù)(LC/MS/MS)和固相萃取(SPE)樣品凈化前處理技術(shù)，建立了豆芽中4-氯苯氧乙酸殘留量的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC/MS/MS)檢測方法和陽性確證方法。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀配有電噴霧離子源(UPLC-MS/MS-ESI)(美國Waters公司)；Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm i.d.× 100 mm，1.7 μm)和Oasis HLB 固相萃取小柱(60 mg，3 mL)均購自美國Waters公司；電子分析天平(精度為0.0001 g，瑞士METTLER TOLEDO公司)；電子分析天平(精度為0.01 g，德國Sartorius ME公司)；高速勻漿機(jī)(德國IKA T18，3 500～24 000 r/min)；渦旋振蕩器(美國talboys 230V，500～2 500 r/min)；固相萃取儀(安譜公司)；冷凍離心機(jī)和超純水儀(美國Thermo Fisher公司)。4-氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)品購于Dr.Ehrenstorfer(德國)；甲醇(德國Merck KGaA公司)、乙腈(Sigma公司)、甲酸(Sigma公司)均為HPLC純；磷酸(H3PO4)、氫氧化鈉(NaOH)為分析純(中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司)；pH試紙(中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司)；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2樣品前處理

1.2.1樣品提取。稱量待測樣品5 g(精確至0.01 g)置于50 mL離心管中，加入10 mL 0.01 mol/L氫氧化鈉溶液，高速勻漿2 min提取，然后在8 000 r/min下離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中。殘?jiān)性偌尤?0 mL 0.01 mol/L氫氧化鈉溶液，按上述方法重復(fù)提取一次，合并2次提取溶液，用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液定容至刻度，混勻。準(zhǔn)確移取10.0 mL提取液，用50%磷酸溶液調(diào)節(jié)提取液pH為2.5±0.2，待凈化用。

1.2.2樣品凈化。將全部樣品提取液通過已活化(3 mL甲醇、3 mL水)的Oasis HLB固相萃取小柱，上樣后再用3 mL磷酸水溶液淋洗，淋洗后在固相萃取裝置上真空抽干水分10 min，經(jīng)4 mL甲醇洗脫，收集至10 mL玻璃試管中，40 ℃氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL 30 %甲醇水溶液，充分旋渦溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待LC-MS/MS分析。

1.3儀器條件

1.3.1色譜條件。流動(dòng)相的組成和梯度見表1。

1.3.2質(zhì)譜條件。采用1.0 mg/L 4-氯苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定其分子離子，并對儀器電離電壓、錐孔電壓、離子源溫、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

離子化模式：電噴霧電離(負(fù)離子模式)；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子源溫度：150 ℃；毛細(xì)管電壓：1.5 kV；脫溶劑溫度：400 ℃；脫溶劑氣流：800 L/h；碰撞氣：氬氣。4-氯苯氧乙酸的質(zhì)譜參數(shù)：母離子(m/z)185.1，子離子(m/z)126.9*、110.9，錐孔電壓-18、-18V，碰撞能量-16、-16V。

表1　流動(dòng)相的組成和梯度

2　結(jié)果與分析

2.1樣品的凈化根據(jù)豆芽基質(zhì)的特點(diǎn)，采用Oasis HLB固相萃取柱凈化，并對其凈化條件進(jìn)行試驗(yàn)，以達(dá)到Oasis HLB固相萃取柱對4-氯苯氧乙酸分離的最佳凈化效果。向空白豆芽基質(zhì)中加入一定濃度的4-氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并按優(yōu)化后的方法通過Oasis HLB固相萃取小柱，收集活化時(shí)所用的甲醇、水以及樣品流出液、淋洗液和洗脫液于不同試管中，分別檢測各流出液中4-氯苯氧乙酸的含量和回收率，以確定Oasis HLB固相萃取小柱對4-氯苯氧乙酸凈化的洗脫液最佳收集體積。由圖1可知，4-氯苯氧乙酸在Oasis HLB固相萃取小柱上在20 mL前完全流出。因此，選擇4 mL洗脫液可最大程度地除去豆芽基質(zhì)的干擾，同時(shí)保證4-氯苯氧乙酸的回收率符合檢測要求。

圖1　Oasis HLB固相萃取小柱洗脫曲線Fig.1　Elution curve of solid phase extraction of Oasis HLB

2.2色譜條件的優(yōu)化色譜柱的選擇：為了有利于色譜峰的分離及峰形的改善，分別比較2種色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱和Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱對4-氯苯氧乙酸分離程度和響應(yīng)值的影響。經(jīng)試驗(yàn)證明，使用C18色譜柱分離效果更好，4-氯苯氧乙酸響應(yīng)值更高。

流動(dòng)相的選擇：在流動(dòng)相中加入酸性物質(zhì)或者緩沖鹽，可以增強(qiáng)待測物在色譜柱上的保留效果，并提高分離度，有效改善峰形，比較4-氯苯氧乙酸在3種流動(dòng)相乙腈-甲酸銨、乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-乙酸銨中的分離效果，發(fā)現(xiàn)使用乙腈-0.1%甲酸水溶液做流動(dòng)相時(shí)能更好地將待測組分與豆芽基質(zhì)最大限度地分開。

4-氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)品和豆芽中添加4-氯苯氧乙酸標(biāo)樣的提取離子色譜見圖2。

圖2　4-氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)品(A)和樣品加標(biāo)(B)提取離子色譜圖Fig.2　Extraction ion chromatograms of 4-chlorophenoxyacetic acid standard substances(A)，blank bean sprouts sample(B)and fortified sample with 4-chlorophenoxyacetic acid(C)

2.34-氯苯氧乙酸的檢出限和線性范圍用空白豆芽樣品作為基質(zhì)溶液逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以驗(yàn)證方法的靈敏度，以信噪比(S/N)為3∶1時(shí)的濃度確定為檢出限(LOD)，并配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用上述色譜條件進(jìn)行測定，以定量離子的峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X(μg/L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，重復(fù)6次，取平均值。結(jié)果表明，該方法4-氯苯氧乙酸的最低檢出限為20 μg/kg，4-氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在20～500 μg/L與響應(yīng)值線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=6.635 66x+85.559，相關(guān)系數(shù)r=0.998 1。2.4方法的準(zhǔn)確度和精密度在不含4-氯苯氧乙酸的豆芽樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制20、60、100 μg/kg 3個(gè)水平的加標(biāo)樣品，按優(yōu)化后的提取方法和色譜條件進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3可知，在加標(biāo)水平為20、60、100 μg/kg時(shí)平均回收率分別為87.62%、102.10%和100.00%，其RSD分別為3.48%、4.92%和6.59%。表明該研究采用的提取、凈化、檢測方法具有較高的準(zhǔn)確度和較好的重復(fù)性，均可滿足4-氯苯氧乙酸在豆芽中殘留分析的要求。

表3豆芽中4-氯苯氧乙酸標(biāo)樣添加回收率

Table 3Average recovery rate of 4-chlorophenoxyacetic acid in bean sprouts

添加水平Spikedlevelμg/kg試驗(yàn)號Testcode檢測值Detectedvaluμg/kg回收率Recoveryrate%平均回收率Averagerecoveryrate∥%相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%20118.2391.1387.623.48218.2691.32317.2286.10416.9084.52517.5987.93616.9484.7160163.68106.13102.104.92257.7496.24362.78104.64460.82101.36557.7496.24664.78107.96100191.5091.50100.006.592101.73101.733102.45102.45492.1992.195106.85106.856105.26105.26

2.5樣品分析應(yīng)用該方法對市面上購買的20組豆芽樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果其中2組含有4-氯苯氧乙酸，殘留量分別為40.97和29.36 μg/kg。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分別培育10組不含目標(biāo)化合物的黃豆芽、綠豆芽樣品，采用該方法進(jìn)行檢測，未發(fā)現(xiàn)有4-氯苯氧乙酸殘留，證明該方法在實(shí)踐中具有可操作性。

3　結(jié)論

該研究采用氫氧化鈉溶液提取，經(jīng)Oasis HLB固相萃取柱凈化，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定，最終建立了固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆芽中4-氯苯氧乙酸殘留量的方法。經(jīng)驗(yàn)證該方法能夠有效地檢測4-氯苯氧乙酸在豆芽樣品中的殘留，并具有靈敏度高、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性良好、操作簡捷等特點(diǎn)，滿足豆芽樣品中4-氯苯氧乙酸殘留分析的要求，同時(shí)為4-氯苯氧乙酸在其他植物源食品中的殘留分析提供參考。

[1] 北京市海淀區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所(國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心).豆芽中4-氯苯氧乙酸 6-芐基腺嘌呤 2，4-滴 赤霉素 福美雙的測定：DB11/T 379—2006[S].北京：北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，2006.

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Determination of 4-Chlorophenoxyacetic Acid in Bean Sprout by UPLC-MS/ MS

SHI Xiao-lei

(Shanghai DtsChina Co., Ltd., Shanghai 200436)

[Objective] To establish a qualitative and quantitative analysis method for 4-chlorophenoxyacetic acid in bean sprout by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS). [Method] The sample was extracted with 0.01 mol/L sodium hydroxide solution, and cleaned up with Oasis HLB. The separations were performed on a C18 column, with a mobile phase of 0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile and detected by positive-ion electrospray ionization mode and multi-reaction monitoring (MRM) mode. [Result] Under the optimal test condition, 4-chlorophenoxyacetic acid showed good linear relationship within the range of 20 -500 μg/L, with correlation coefficient of 0.998 1. The limit of detection(S/N=3) was 20.0 μg/kg. The average recovery rates at three spiked levels of 20, 60, 100 μg/kg were 87.62%, 102.10% and 100.00%, respectively. The relative standard deviations (RSD) were 3.48%、4.92%and 6.59%, respectively. [Conclusion] This method had the characteristics of high sensitivity and accuracy, which can meet the requirement of retention analysis.

UPLC-MS/MS; Solid phase extraction; Bean sprout; 4-Chlorophenoxyacetic acid

史曉磊(1988- )，男，黑龍江黑河人，助理工程師，碩士，從事質(zhì)譜分析研究。

2016-07-04

TS 207

A

0517-6611(2016)24-080-02