王麗華曾文泓

羥氯喹聯(lián)合甲氨蝶呤對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠外周血中IL-1、IL-6和TNF-α的影響

王麗華①曾文泓②

目的：觀察羥氯喹聯(lián)合甲氨蝶呤對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠血清白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平變化的影響，探討羥氯喹治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床效果。方法：建立大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，將100只大鼠分為正常組、模型組、羥氯喹組、甲氨蝶呤組及羥氯喹聯(lián)合甲氨蝶呤組（聯(lián)合組），采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠外周血IL-1、IL-6和TNF-α的水平，并觀察大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度。結(jié)果：模型組、羥氯喹組、甲氨蝶呤組及聯(lián)合組大鼠外周血IL-1、IL-6 和TNF-α水平均高于正常組，治療后羥氯喹組、甲氨蝶呤組及聯(lián)合組大鼠的IL-1、IL-6和TNF-α水平均低于模型組，聯(lián)合組IL-1、IL-6和TNF-α水平均低于羥氯喹組及甲氨蝶呤組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），羥氯喹組及甲氨蝶呤組大鼠IL-1、IL-6和TNF-α水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后與模型組比較，羥氯喹組、甲氨蝶呤組及聯(lián)合組大鼠的足趾腫脹程度均明顯減輕，聯(lián)合組足趾腫脹程度更低于羥氯喹組及甲氨蝶呤組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），羥氯喹組和甲氨蝶呤組大鼠足趾腫脹程度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：羥氯喹在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎方面具有較好的抗炎作用，能夠有效抑制和降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠外周血中IL-1、IL-6和TNF-α水平，且羥氯喹與甲氨蝶呤聯(lián)合用藥治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的效果更佳。

羥氯喹； 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎； 白細(xì)胞介素-1； 白細(xì)胞介素- 6； 腫瘤壞死因子-α

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，多表現(xiàn)慢性進(jìn)行性病變，逐漸破壞關(guān)節(jié)軟骨最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能損失而致殘［1］。RA作為一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，至今尚無特效藥，常規(guī)治療多以抗炎、鎮(zhèn)痛治療為主［2］。研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在RA的病理過程中起到了重要作用，因此通過抑制IL-1、IL-6及TNF-α活性，可能控制RA病情發(fā)展［3］。本研究對(duì)羥氯喹聯(lián)合甲氨蝶呤治療RA大鼠外周血中的IL-1、IL-6及TNF-α的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠100只，4周齡，體重180～200 g，平均（182.12±18.57）g，包括54只雄性大鼠和46只雌性大鼠，均購買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司。

1.2主要藥品及實(shí)驗(yàn)材料 硫酸羥氯喹片（由長(zhǎng)沙鴻德醫(yī)藥貿(mào)易有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20090258），甲氨蝶呤片（由廣東祥康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H22022674）；牛Ⅱ型膠原（BCⅡ）、不完全弗氏佐劑（IFA）（均由美國Chondrex公司采購）；IL-1、IL-6和TNF-α試劑盒（均采購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司）。

1.3模型建立與判定 取適量BCⅡ溶于0.1 mol/L的冰醋酸中，配成濃度為4 mg/mL的BCⅡ溶液，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存過夜后，取等量IFA與BCⅡ溶液混合，振蕩充分乳化，制成濃度為2 mg/mL的BCⅡ乳劑，置于4 ℃冰箱保存。按照200 μg BCⅡ/只的劑量對(duì)造模組大鼠進(jìn)行尾根部皮下免疫，并于1周后進(jìn)行二次免疫，劑量調(diào)整為100 μg BCⅡ/只；正常組注射5 mL生理鹽水進(jìn)行尾根部皮下假免疫。判定標(biāo)準(zhǔn)：觀察每只大鼠免疫后的足趾關(guān)節(jié)，至少1個(gè)關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫的大鼠，即為造模成功［4-5］。

1.4分組及給藥方法 隨機(jī)選取15只大鼠為正常對(duì)照組，對(duì)剩余85只大鼠進(jìn)行造模，其中成功60只，失敗25只，將60只成功造模的大鼠隨機(jī)分為模型組、羥氯喹組、甲氨蝶呤組及聯(lián)合組，每組15只。羥氯喹組、甲氨蝶呤組及聯(lián)合組分別于免疫后21 d開始灌胃給藥，羥氯喹組給予4 mg/（kg·d），每周1次，連用24周；甲氨蝶呤組給予1.2 mg/kg，每周1次，連用24周；聯(lián)合組為羥氯喹4 mg/（kg·d），甲氨蝶呤組1.2 mg/kg，每周1次，連用24周；模型組灌胃給予等量0.9%氯化鈉注射，1次/周，連用24周。

1.5樣本采集 眼眶取血2 mL靜置2 h后，放入低溫離心機(jī)內(nèi)4 ℃條件下3000 r/min，離心10 min，取上清液冰凍保存?zhèn)溆靡詸z測(cè)IL-1、IL-6及TNF-α水平［4］。

1.6觀察指標(biāo) 足趾腫脹度采用足趾容積測(cè)量?jī)x對(duì)各組大鼠左后足趾容積進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量無毛區(qū)以下的足趾容積，觀察足趾的腫脹程度。測(cè)量時(shí)間分別為免疫后21 d（治療前），8周及24周［6-7］。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組治療前后大鼠足趾腫脹程度比較 與正常組比較，治療前后模型組、羥氯喹組、甲氨蝶呤組及聯(lián)合組大鼠足趾腫脹程度均明顯嚴(yán)重于正常組（P＜.0.05）；治療前模型組、羥氯喹組、甲氨蝶呤組及聯(lián)合組間大鼠足趾腫脹程度無明顯差異（P＞0.05）；治療后，羥氯喹組、甲氨蝶呤組及聯(lián)合組在第8、24周大鼠足趾腫脹程度均明顯改善（P＜0.05），聯(lián)合組的改善情況優(yōu)于羥氯喹組及甲氨蝶呤組（P＜0.05），見表1。

2.2第24周各組大鼠外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平比較 模型組、羥氯喹組、甲氨蝶呤組及聯(lián)合組大鼠外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平均高于正常組（P＜0.05）；與模型組比較，羥氯喹組、甲氨蝶呤組及聯(lián)合組大鼠外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平均明顯降低（P＜0.05），且聯(lián)合組大鼠外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平明顯低于羥氯喹組和甲氨蝶呤組（P＜0.05），見表2。

表1　各組治療前后大鼠足趾腫脹程度比較（） mL

表1　各組治療前后大鼠足趾腫脹程度比較（） mL

*與正常組比較，P＜0.05；△與模型組比較，P＜0.05；#與治療前比較，P＜0.05；▲與羥氯喹組及甲氨蝶呤組比較，P＜0.05

組別　治療前　 第8周　 第24周羥氯喹組（n=15）　4.67±0.31*　3.59±0.42*△#　2.34±0.62*△#甲氨蝶呤組（n=15） 4.63±0.29*　3.62±0.38*△#　2.32±0.598*△#聯(lián)合組（n=15）　4.68±0.34*　2.59±0.43*△#▲　1.84±0.26*△#▲模型組（n=15）　4.66±0.31*　4.73±0.42*　4.85±0.53*正常組（n=15）　1.13±0.34　1.24±0.41　1.27±0.36

表2　第24周各組大鼠外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平比較（） pg/mL

表2　第24周各組大鼠外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平比較（） pg/mL

*與正常組比較，P＜0.05；△與模型組比較，P＜0.05；#與羥氯喹組及甲氨蝶呤組比較，P＜0.05

組別　 IL-1　 IL-6　 TNF-α羥氯喹組（n=15）150.32±6.31*△63.99±8.73*△12.58±2.36*△甲氨蝶呤組（n=15）151.29±6.28*△64.28±8.75*△12.49±2.34*△聯(lián)合組（n=15） 112.94±5.84*△#32.59±2.17*△#8.32±1.85*△#模型組（n=15） 252.67±32.25*136.46±9.87*　23.67±3.81*正常組（n=15） 66.45±9.27　 18.54±9.28　 4.51±0.79

3　討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是慢性自身免疫性疾病，病程長(zhǎng)，在患病早期主要以滑膜炎為主，發(fā)展到后期會(huì)造成骨質(zhì)與軟骨破壞，嚴(yán)重者將致殘，給患者造成巨大的傷害和痛苦［8］。Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型（CIA模型）其關(guān)節(jié)局部病變、自身免疫情況與RA與諸多相似之處，是公認(rèn)的RA動(dòng)物模型，因此可以通過CIA模型進(jìn)行RA的相關(guān)基礎(chǔ)研究［9］。

雖然目前RA的發(fā)病原因及病理機(jī)制尚未明確，但是大量研究表明細(xì)胞因子的異常及相互作用在RA的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)RA病灶局部有大量的自身反應(yīng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)，并分泌大量的白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子［10］。IL-1是RA炎癥的主要細(xì)胞因子之一，通過刺激軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞釋放細(xì)胞毒素，加快軟骨及骨質(zhì)的侵蝕破壞進(jìn)程［11-12］；IL-6也是一種促炎的細(xì)胞因子，通過增加能夠放大IL-1β、TNF-α的生物效應(yīng)的細(xì)胞因子，誘導(dǎo)肝臟合成急性期蛋白和類風(fēng)濕因子，推動(dòng)RA的病情發(fā)展［13］；TNF-α產(chǎn)生于RA的滑膜巨噬細(xì)胞中，是一種炎癥遞質(zhì)，同時(shí)也是破壞性細(xì)胞因子，不僅能夠造成關(guān)節(jié)畸形而且可損傷血管，造成局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫［14-15］。Stagakis等［16］研究指出TNF-α水平過高可破壞局部關(guān)節(jié)組織，加劇病情。由于TNF-α與IL-1往往是同時(shí)合成和分泌的，兩者可以協(xié)調(diào)進(jìn)行骨侵蝕，通過刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞釋放前列腺素E2、膠原酶，大量的蛋白多糖酶破壞軟骨基質(zhì)，可見TNF-α與IL-1的相互作用加劇了RA病情的進(jìn)一步發(fā)展［17］。

在RA的治療方面，尚無特效藥，多以抗炎、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫為主，甲氨蝶呤是目前在RA治療中應(yīng)用較多的藥物，具有較強(qiáng)的抗炎和免疫抑制作用［18］。但是臨床證實(shí)，甲氨蝶呤具有較強(qiáng)的副作用，服用后可引起惡心、嘔吐甚至?xí)?dǎo)致肝功能損害，因此在服用甲氨蝶呤治療RA時(shí)需要定期檢測(cè)肝腎功能，較強(qiáng)的副作用給RA患者造成巨大的痛苦。羥氯喹是4-氨基喹諾酮類抗瘧藥，主要通過抑制抗原遞呈細(xì)胞的遞呈功能和組織IL-21的釋放，起到抑制纖維細(xì)胞增殖，減少炎性滲出的作用，在治療RA方面效果顯著［19］。張舸等［20］通過觀察羥氯喹治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的臨床效果發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑液局部的IL-1α和IL-6水平均明顯降低。本研究結(jié)果表明，模型組CIA大鼠的外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平均明顯高于正常大鼠，給予藥物治療后，羥氯喹組與甲氨蝶呤組的大鼠的外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平均明顯降低，且兩組的水平相近，這表明羥氯喹在治療RA方面與甲氨蝶呤一樣具有較好的抗炎作用，因此證實(shí)了羥氯喹在治療RA方面具有明顯的臨床效果。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，羥氯喹聯(lián)合甲氨蝶呤使用，在降低CIA大鼠外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平方面的效果更優(yōu)于單獨(dú)使用羥氯喹和甲氨蝶呤。

綜上所述，羥氯喹能夠有效降低CIA大鼠外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平，在治療RA的過程中通過抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生及相互作用，能夠有效起到抗炎和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用，在治療RA方面具有顯著效果。同時(shí)，羥氯喹聯(lián)合甲氨蝶呤也是治療RA的不錯(cuò)方案，起效快，效果更佳，但是由于本研究樣本量小、時(shí)間短，其安全性還有待進(jìn)一步觀察。

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Effect of Hydroxychloroquine Combined Methotrexate on Rheumatoid Arthritis in Rat Peripheral Blood IL-1，IL-6 and TNF-α/

WANG Li-hua，ZENG Wen-hong.//Medical Innovation of China，2016，13（26）：024-027

Objective：To observe the influence of Hydroxychloroquine combined Methotrexate for rheumatoid arthritis in rats serum IL-1，IL-6 and TNF-α level change，to investigate the effect of Hydroxychloroquine in the treatment with rheumatoid arthritis.Method：Rats model of rheumatoid arthritis were established，100 rats were divided into the normal group，model group，Hydroxychloroquine group，Methotrexate group and combined methotrexate hydroxychloroquine group（combination group），the rats peripheral blood IL-1，IL-6 and TNF-α level were detected by enzyme linked immunosorbent assay，the degree of joint swelling in rats were observed.Result：The model group，Hydroxychloroquine group，Methotrexate group and combination group rat peripheral blood IL-1，IL-6 and TNF-α level were all higher than the normal group，after treatment，the Hydroxychloroquine group，Methotrexate group and combination group rats IL-1，IL-6 and TNF-α levels were all lower than the model group，the differences were statistically significant（P＜0.05），there were no statistically significants in the Hydroxychloroquine group and Methotrexate group of IL-1，IL-6 and TNF-α（P＞0.05）.Compared with the model group after treatment，the Hydroxychloroquine group，Methotrexate group and combination group rats joint swelling degree were significantly reduced，the combination group joint swelling degree was lower than the Hydroxychloroquine group and Methotrexate group，the differences were statistically significant（P＜0.05），there were no statistically significants in the degree of joint swelling in Hydroxychloroquine group and Methotrexate group（P＞0.05）. Conclusion：Hydroxychloroquine in the treatment with rheumatoid arthritis has good anti-inflammatory effect，it can effectively restrain and reduce rheumatoid arthritis rat peripheral blood IL-1，IL-6 and TNF-α level，theHydroxychloroquine combined Methotrexate in the treatment with rheumatoid arthritis results are better.

Hydroxychloroquine； Rheumatoid arthritis； Interleukin 1； Interleukin 6； Tumor necrosis factor-α

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.26.007

2016-05-03） （本文編輯：李穎）

①江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 江西 南昌 330006

②江西中醫(yī)藥大學(xué)

曾文泓

First-author’s address：The Affiliated Hospital of J iangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China