蔣驕云田文斐馮龍曲憲成

（1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，桂林 541004；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命科學(xué)學(xué)院，上海 201306；3.桂林理工大學(xué)博文管理學(xué)院，桂林 541006；4.泗陽縣水產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站，泗陽 223700）

地高辛標(biāo)記的黃鱔F64基因cRNA探針的制備及其應(yīng)用

蔣驕云1田文斐3馮龍4曲憲成2

（1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，桂林 541004；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命科學(xué)學(xué)院，上海 201306；3.桂林理工大學(xué)博文管理學(xué)院，桂林 541006；4.泗陽縣水產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站，泗陽 223700）

以黃鱔F64基因序列為模板設(shè)計引物，擴增用于cRNA探針合成的模板，構(gòu)建F64/pGM-T重組質(zhì)粒并線性化，利用RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄合成正、反義cRNA探針，并對其進行地高辛標(biāo)記，利用原位雜交方法檢測F64基因在黃鱔性腺發(fā)育過程中的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示，正義探針未檢測到陽性信號，反義探針檢測到該基因在黃鱔性腺發(fā)育早期不表達(dá)，于V期性腺開始表達(dá)。研究結(jié)果表明，體外轉(zhuǎn)錄法可以有效合成cRNA探針，制備的cRNA探針可以準(zhǔn)確檢測F64基因的時空表達(dá)。

黃鱔F64基因；性腺發(fā)育；cRNA探針；原位雜交

黃鱔（Monopterus albus），隸屬硬骨魚綱（Osteichthyes）輻鰭亞綱（Actinopterygii）合鰓目（Synbranchiformes）合鰓科（Symbranchidae）黃鱔屬（Monopterus）。其整個發(fā)育史的表現(xiàn)是首先發(fā)育為雌性個體，待發(fā)育成熟，排卵后性逆轉(zhuǎn)為雄性個體，具有典型先雌后雄的性腺發(fā)育過程［1］，是研究魚類性別調(diào)控機制的良好模式動物。黃鱔因其性腺發(fā)育的特殊性，一直以來都是科研工作者的研究熱點之一。為了探知黃鱔性別調(diào)控機制，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量的研究。在內(nèi)分泌調(diào)控方面，周秋白等［2］分析了產(chǎn)卵和未產(chǎn)卵黃鱔雌二醇（E2）的變化特征，結(jié)果表明E2水平對黃鱔性腺發(fā)育起重要作用，濃度的降低是黃鱔啟動性逆轉(zhuǎn)的前提。郭威等［3］的研究結(jié)果顯示黃鱔血清E2在黃鱔間期性腺發(fā)育到雄性過程中顯著下降，而T（睪酮）則顯著上升，表明激素在黃鱔性腺發(fā)育中扮演重要角色。在分子調(diào)控機制方面，芳香化酶是生物體內(nèi)C19雄激素轉(zhuǎn)化為C18雌激素的關(guān)鍵條件因子［4］，與大多數(shù)硬骨魚類一樣，黃鱔中芳香化酶基因（CYP19）具有兩種不同的拷貝，分別為cyp19a1a和cyp19a1b，進一步分析表明這兩個基因在黃鱔性逆轉(zhuǎn)過程中呈現(xiàn)多態(tài)性表達(dá)，可能在黃鱔性逆轉(zhuǎn)過程中起到一定作用［5-7］。JUK1為促絲裂原活化蛋白激酶家族成員，Xiao等［8］研究表明該基因?qū)S鱔性逆轉(zhuǎn)起重要作用。WT1基因（wilms'tumor suppressor gene）和哺乳動物性腺發(fā)育相關(guān)，胡青等［9］克隆了黃鱔WT1基因并分析其在性腺發(fā)育過程中的表達(dá)，結(jié)果顯示該基因在黃鱔雌性、間性和雄性性腺中的表達(dá)量在各時期都有先升高后降低的表達(dá)趨勢。何智等［10］探究了黃鱔卵巢初次發(fā)育成熟及相關(guān)基因的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)amh基因可能與卵巢青春期啟動相關(guān)。

本實驗室之前的研究成功構(gòu)建了黃鱔性逆轉(zhuǎn)過程中抑制差減文庫［11］并對文庫中的部分基因進行了克隆和表達(dá)分析［12，13］，但均未取得突破性進展，黃鱔性逆轉(zhuǎn)相關(guān)機制尚未完全明確。進化史上魚類處于較為原始的地位，其遺傳力小于高等動物，因此探究黃鱔性別調(diào)控基因應(yīng)從其自身的基因組中尋找。F64基因作為抑制差減文庫篩選到的性別調(diào)控候選基因之一，同源性分析顯示，無同源性基因視為新報道基因［14］。此外，未見其他相關(guān)報道。因此，對該基因的表達(dá)情況分析具有重要意義，將為進一步探究其功能提供重要依據(jù)。本研究以已成功克隆的性別調(diào)控相關(guān)基因F64［14］部分序列為模板，構(gòu)建F64/pGM-T重組質(zhì)粒并線性化，用RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄合成正、反義地高辛標(biāo)記的cRNA探針，通過原位雜交方法檢測F64基因在黃鱔性腺發(fā)育過程中的表達(dá)情況，旨為明確該基因在黃鱔性逆轉(zhuǎn)過程中的功能奠定基礎(chǔ)，同時為類似研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 實驗用黃鱔購置于農(nóng)貿(mào)市場，用頸椎切斷法處死黃鱔，采集性腺（50-100 mg），液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 Trizol Regent購自Invitrogen公司；RT-PCR Kit、RNase inhibitor、Oligo（dT）18、Taq酶、Apa I內(nèi)切酶、Sac I內(nèi)切酶、T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶和DNase I 購自TaKaRa工程有限公司（日本）；pGM-T載體、DH5α感受態(tài)、TIANprep Midi Plasmid Kit和TIANquick Midi Purification Kit購自天根生化科技（北京）有限公司；DIG RNA labeling mix（10×）購自Roche公司（瑞士）；其他試劑為國產(chǎn)分析純；所需引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 F64引物 上游引物：5'-AGGACAGGTTTACGGGTGAG-3'；下游引物：5'-CCAGTATTCCCTCATAGACC-3'。

1.2 方法

1.2.1 性腺組織總RNA的提取 取-80℃保存的性腺樣本，于1.5 mL離心管，加入1 mL Trizol試劑，勻漿至無明顯組織顆粒，室溫靜置5 min；加入200 μL氯仿，充分混勻，4℃ 12 000 r/min離心15 min；取上清500 μL于新離心管，加入600 μL異丙醇，靜置10 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min；棄上清，75%乙醇洗滌；自然干燥，加適量DEPC-H2O，室溫自然溶解沉淀，檢測RNA含量及完整度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴增 以上一步提取的RNA，按照RT-PCR試劑盒說明書，合成cDNA第一鏈；根據(jù)已經(jīng)獲得的F64基因序列設(shè)計一對引物，用于cRNA探針模板的合成。PCR反應(yīng)體系為：cDNA第一鏈1 μL、上下游引物各1 μL、10×PCR buffer 2 μL、dNTP 1.6 μL、ddH2O 13.3 μL、Taq 0.1 μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58.5℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 3 min；4℃保存。

1.2.3 F64/pGM-T重組質(zhì)粒的制備 將PCR產(chǎn)物純化后與pGM-T載體 16℃連接過夜，連接體系為：DNA 2 μL、10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μL、T4DNA Ligase（3 U/μL）1 μL、pGM-T 1 μL、滅菌水5 μL；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有7 μL IPTG 和40 μL X-Gal的LB固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)過夜；于超凈工作臺上，挑取白色菌落接種于盛有約1 mL LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素，濃度為100 μg/mL）的2 mL離心管中，37℃，220 r/min搖床過夜培養(yǎng)；菌液PCR驗證為目的片段后，送上海生工測序；將陽性克隆菌液10 μL加入到50 mL LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。

1.2.4 質(zhì)粒提取及線性化 根據(jù)TIANprep Midi Plasmid Kit試劑盒說明書進行質(zhì)粒的提??；分別用Apa I和Sac I限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒線性化，體系為：DNA（質(zhì)粒）2.5 μg、內(nèi)切酶2.5 μL、buffer 5 μL、加滅菌水至50 μL，37℃中反應(yīng)2 h；按照TIANquick Midi Purification Kit試劑盒將線性化的質(zhì)粒純化。

1.2.5 cRNA探針的合成 向0.2 mL離心管中加入正、反義cRNA探針合成所需試劑，T7 RNA聚合酶反應(yīng)體系為：模板500 ng、10×T7 buffer 2 μL、DTT 2 μL、DIG RNA labeling mix（10 mmol/L）1 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、T7 RNA聚合酶1 μL、加DEPC-H2O至20 μL；SP6 RNA聚合酶反應(yīng)體系為：模板500 ng、10×SP6 buffer 2 μL、DTT 2 μL、0.1% BSA 2 μL、DIG RNA labeling mix（10 mmol/L）1 μL、Rnase Inhibitor 0.5 μL、SP6 RNA聚合酶1 μL、加DEPC-H2O至20 μL；將上述離心管混勻后，于37℃中哺育2 h；取1 μL進行電泳檢測；具體步驟按照T7和SP6 RNA聚合酶試劑盒的說明進行。對合成成功的RNA探針進行純化：于所合成的探針離心管中加入10 U（2 μL）的DNase I（RNase-free），37℃哺育30 min消化DNA模板；向上一步離心管中加1/10體積4 mol/L LiCl和1/4體積無水乙醇（在-20℃預(yù)冷），混合均勻，-20℃下靜置2 h；4℃條件下12 000 r/min離心15 min；吸凈上清，用70%乙醇（V/V，DEPC-H2O配置，-20℃預(yù)冷）清洗一次，12 000 r/min離心5 min；小心吸凈上清，倒置于干凈環(huán)境中至沉淀干燥；在RNA沉淀中加入30-50 μL DEPC-H2O讓沉淀自行溶解，加入1 μL RNA inhibitor（20 U）；電泳檢測RNA的完整性，分光光度計檢測濃度，分裝-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 F64原位雜交分析 黃鱔各期性腺樣本進行組織切片的制備并進行雜交前預(yù)處理；將地高辛標(biāo)記的cRNA探針和組織切片55℃雜交過夜；雜交后進行漂洗，滴加Anti-DIG-AP于切片上，處理2 h，最后每片切片覆蓋100 μL顯色液，黑暗環(huán)境下顯色2 h，封片，鏡檢分析，具體步驟參照之前研究［12］。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取及cRNA探針模板RT-PCR擴增

總RNA提取電泳結(jié)果（圖1）顯示，28S RNA和18S RNA條帶清晰，亮度比接近2∶1，無其他DNA污染條帶及明顯降解條帶，說明整個提取過程合理，RNA完整性較好。經(jīng)RT-PCR擴增，電泳結(jié)果（圖2）顯示600 bp左右的單一條帶，符合預(yù)期。

圖1 黃鱔性腺總RNA 1.2%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 cRNA探針模板PCR擴增電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒的提取及線性化

將驗證正確的陽性克隆擴大培養(yǎng)，用于質(zhì)粒的提取。結(jié)果（圖3）顯示，質(zhì)粒大部分為超螺旋狀態(tài)，處于2 000 bp左右，說明質(zhì)粒提取效果較好；限制性內(nèi)切酶酶切后均為單一條帶，片段長3 400 bp左右，線性化完全，結(jié)果符合預(yù)期。

2.3 體外轉(zhuǎn)錄合成F64 cRNA探針

以線性化的質(zhì)粒為模板，在T7和SP6 RNA聚合酶的作用下，用體外轉(zhuǎn)錄的方法，合成正義和反義探針；探針純化后均為單一條帶，長度在600 bp左右，符合預(yù)期大?。▓D4）。

圖3 重組質(zhì)粒及線性化電泳圖

圖4 體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA電泳圖

2.4 原位雜交分析

以正義探針為對照，反義探針雜交結(jié)果與前期研究結(jié)果一致［14］，該基因性腺發(fā)育早期不表達(dá)，IV期卵泡和早期卵泡均未檢測到陽性信號（圖5-B）；排卵的V期卵巢開始表達(dá)，V期卵泡和VI期卵泡均有F64基因表達(dá)；精卵巢表達(dá)量明顯高于排卵期卵巢，即隨精巢組織發(fā)育表達(dá)量有增高趨勢（圖5）。

3 討論

在脊椎動物系統(tǒng)進化中，魚類處于承前啟后的關(guān)鍵地位，其性別決定研究一直是繁殖生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。然而由于魚類的特殊生活方式，其性別決定機制十分復(fù)雜，目前為止只在少數(shù)魚類中，如青鳉魚（Oryzias latipes）發(fā)現(xiàn)了性別決定候選基因DMY［15］，大多數(shù)魚類還處于較模糊狀態(tài)。黃鱔具有先雌后雄的性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，其基因組較小，只有600 Mb，是研究魚類性別調(diào)控的良好模式動物。近些年來研究者開展了大量黃鱔性逆轉(zhuǎn)相關(guān)研究，但大部分研究者都是簡單的利用其他動物已知的基因去尋找魚類性別調(diào)控基因，均未取得突破性的進展，從魚類本身的基因組去篩選性別調(diào)控基因是最為有效的方法之一［16］。原位雜交技術(shù)是目前檢測基因表達(dá)最為有效的手段之一，相比寡核苷酸探針和 DNA 探針，cRNA探針具有更強的特異性［17］。cRNA探針合成最常用的方法是體外轉(zhuǎn)錄法，它具有以下優(yōu)點：以線性化質(zhì)粒DNA為模板可反復(fù)轉(zhuǎn)錄生成RNA探針，合成量大；較低水平的轉(zhuǎn)錄，也可與超大量的mRNA形成互補穩(wěn)定的雜交二聚體，探針活性高；轉(zhuǎn)錄起始于目的DNA上游啟動子，終止于限制性內(nèi)切酶酶切末端，定位精確；無需考慮外顯子和內(nèi)含子問題，方法簡單易行［18］。

我們致力于尋找黃鱔性逆轉(zhuǎn)過程中起關(guān)鍵作用的基因，本實驗室之前成功構(gòu)建了黃鱔性逆轉(zhuǎn)抑制差減文庫［11，19］，篩選到了部分與黃鱔性別調(diào)控相關(guān)基因。為進一步分析差異表達(dá)基因（F64）的功能，本研究體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA探針，并檢測其表達(dá)情況。結(jié)果顯示所合成探針均為單一條帶，且能有效檢測基因的表達(dá)，即該方法有效可行。原位雜交結(jié)果顯示F64基因于卵巢發(fā)育早期不表達(dá)，排卵的后期表達(dá)，間期性腺表達(dá)量有增高的趨勢，表明該基因可能隨著卵巢的敗育和精巢的發(fā)育啟動表達(dá)。Liu等［7］對黃鱔芳香化酶基因P45011β進行表達(dá)分析，該基因于卵巢不表達(dá)，精卵巢啟功表達(dá)，精巢表達(dá)量顯著提高；與之相反，P450arom基因主要于卵巢表達(dá)，精卵巢組織顯著降低，精巢組織微量表達(dá)。芳香化酶是生物體內(nèi)催化性激素合成的關(guān)鍵酶，其在硬骨魚類的性別調(diào)控中起重要作用。而本研究顯示F64基因的表達(dá)模式和芳香化酶基因具有類似情況，是否與黃鱔性腺發(fā)育激素調(diào)節(jié)相關(guān)，需要進一步分析。綜上所述，F(xiàn)64基因具有與黃鱔精巢組織發(fā)育正相關(guān)的表達(dá)模式，與黃鱔的性別調(diào)控相關(guān)，其具體功能需進一步研究。本研究為進一步探究F64的功能奠定基礎(chǔ)，同時為其他魚類研究提供參考。

4 結(jié)論

本研究體外轉(zhuǎn)錄合成了地高辛標(biāo)記cRNA探針，原位雜交結(jié)果顯示F64基因于卵巢發(fā)育早期不表達(dá)，后期啟動表達(dá)，與黃鱔性別調(diào)控相關(guān)。

圖5 F64基因原位雜交分析

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Preparation and Application of cRNA Probe Labeled with Digoxingenin for Gene F64 of Rice Field Eel

JIANG Jiao-yun1TIAN Wen-fei3FENG Long4QU Xian-cheng2
（1. College of Life Sciences，Guangxi Normal University，Guilin 541004；2. College of Fisheries and Life Sciences，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；3. Bowen College of Management，Guilin University of Technology，Guilin 541006；4. Siyang Fisheries Technical Service Center，Siyang 223700）

The specific gene primers were designed based on the sequences of gene F64 of rice field eel，then the templates for synthesizing the cRNA probe were amplified，then recombinant F64/pGM-T plasmids were constructed and linearized by restriction enzymes，further the sense and anti-sense cRNA probes were synthesized by in vitro transcription with RNA polymerase，and finally labeled with Digoxigenin. The expression changes of gene F64 during the gonadal development of rice field eel were detected by in situ hybridization. According to our results，the expression was only detected by the anti-sense F64 cRNA probe，and the earliest signal was observed in stage V of ovarian，but no more in early stage of ovarian formation. Our study indicated that the cRNA probes can be synthesized using in vitro transcription，and the cRNA probes prepared in this study can be used for accurately detecting the spatial and temporal expression of gene F64.

gene F64 of rice field eel；gonadal development；cRNA probe；in situ hybridization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.022

2015-06-10

廣西師范大學(xué)實驗室管理創(chuàng)新與技術(shù)革新項目（2014GJ02），上海高校知識服務(wù)平臺上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物遺傳育種中心基金資助項目（ZF1206）

蔣驕云，男，實驗師，研究方向：魚類性別調(diào)控分子機制；E-mail：jiangjiaoyun007@163.com

曲憲成，男，副教授，研究方向：水生動物生理學(xué)；E-mail：xcqu@shou.edu.cn