張文華

（包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，包頭 014030）

香菇多糖增強(qiáng)黃瓜幼苗對炭疽病菌抗性機(jī)理

張文華

（包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，包頭 014030）

旨在考察香菇多糖誘導(dǎo)黃瓜（Cucumis sativus L. cv. Jinfeng）幼苗葉片細(xì)胞產(chǎn)生防御響應(yīng)的效果。經(jīng)0.75 g/L香菇多糖處理后，葉片胞內(nèi)H2O2和水楊酸濃度迅速增加，分別在10 min和4 h達(dá)到峰值，隨后均逐漸下降至誘導(dǎo)前水平。經(jīng)香菇多糖誘導(dǎo)后，胞內(nèi)抗性相關(guān)蛋白β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和苯丙氨酸氨解酶比活性均顯著增加，96 h后酶活力仍然保持較高水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)香菇多糖誘導(dǎo)后，黃瓜對炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）抗性明顯增強(qiáng)。經(jīng)2.00 g/L香菇多糖處理后，葉片菌斑面積和數(shù)量分別顯著下降至對照水平的53.1%和51.3%，結(jié)果表明香菇多糖具有誘導(dǎo)黃瓜細(xì)胞產(chǎn)生防御響應(yīng)的作用。

香菇多糖；黃瓜；防御響應(yīng)；炭疽病菌

黃瓜（Cucumis sativus L.）是一種世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要經(jīng)濟(jì)作物，但是其產(chǎn)量易受病原微生物如炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）的影響而下降。盡管化學(xué)殺菌劑可以有效緩解病害損失，但是農(nóng)藥的大量使用加重了社會(huì)和生態(tài)負(fù)擔(dān)。

采用誘導(dǎo)劑激活植物細(xì)胞防御響應(yīng)以抵抗病原微生物侵染是一種較為理想的方法［1］。細(xì)胞防御響應(yīng)包含一系列的級聯(lián)過程，包括活性氧粒子的積累、信號分子濃度增加、苯丙素途徑強(qiáng)化以及病程相關(guān)蛋白的生成［2，3］。病程相關(guān)蛋白包含多種蛋白酶抑制劑及水解酶作用于外源微生物而起到防御作用。苯丙素類物質(zhì)除激活信號傳導(dǎo)以外，還能夠改變植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)以起到屏障作用［4］。

研究表明，β-葡聚糖能夠激活多種植物的防御響應(yīng)。如昆布多糖和熱凝膠寡糖分別被證實(shí)能夠?qū)煵莺婉R鈴薯產(chǎn)生誘導(dǎo)作用［5，6］。香菇多糖（Len-tinan，Ltn）是一種線性β-1，3-葡聚糖，具有潛在的激活植物防御響應(yīng)的活性，但是其對黃瓜細(xì)胞是否具有誘導(dǎo)活性仍需要進(jìn)一步研究。綜上所述，本研究通過對黃瓜葉片細(xì)胞內(nèi)信號分子濃度以及關(guān)鍵酶活性的測定，結(jié)合黃瓜對炭疽病菌抗性效果統(tǒng)計(jì)結(jié)果，對香菇多糖誘導(dǎo)黃瓜細(xì)胞防御響應(yīng)的效果進(jìn)行考察，旨在為黃瓜病害的生態(tài)防治提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黃瓜和菌種 黃瓜植株（C. sativus L. cv. Jinfeng）于無菌溫室中培養(yǎng)（培養(yǎng)溫度25℃，光照周期16 h/d）。炭疽病菌（C. orbiculare）購自廣東菌種保藏中心（廣州），菌種培養(yǎng)及孢子收集參照Zhang等［7］的方法。

1.1.2 試劑 香菇多糖，藍(lán)色幾丁質(zhì)（Chitin azure），反式肉桂酸，水楊酸購自Sigma公司（美國）；其余試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）。

1.1.3 儀器 液相色譜儀Hitachi CM5000 HPLC system（日本）；離心機(jī)Sigma 2K5S（美國）。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度香菇多糖對炭疽病菌侵染黃瓜幼苗的抑制 分別以0.25、0.75和2.00 g/L香菇多糖溶液均勻噴撒黃瓜幼苗葉片表面，以無菌去離子水作為空白對照（CK）。噴灑24 h后，以濃度為107孢子/mL C. orbiculare孢子懸液均勻噴灑葉片表面。培養(yǎng)168 h后對葉片病斑數(shù)量和病斑面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。每種處理采用10株馬鈴薯幼苗，所有植株培養(yǎng)條件一致。

1.2.2 香菇多糖對黃瓜的誘抗作用機(jī)理

1.2.2.1 黃瓜葉片處理與取樣 以0.75 g/L香菇多糖溶液噴撒培養(yǎng)6周的黃瓜幼苗葉片表面，以無菌去離子水作為空白對照（CK）。然后，分別于噴灑后剪取葉片用于胞內(nèi)H2O2和水楊酸（salicylic acid，SA）濃度測定或胞內(nèi)β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和苯丙氨酸氨解酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）比酶活測定。每項(xiàng)指標(biāo)測定均采用不同植株的葉片進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.2.2 各種誘抗物質(zhì)測定方法 （1）葉片胞內(nèi)H2O2和水楊酸濃度測定：H2O2與SA的提取及濃度測定分別采用Li等［8］和van Spronsen等［9］報(bào)道的方法。（2）胞內(nèi)蛋白提取方法：稱取200 mg黃瓜葉片并迅速于液氮中研磨成粉末，隨后加入1.0 mL蛋白提取溶液（含有50 mmol/L乙酸鈉緩沖液，5 mmol/L EDTA，2 mmol/L DTT，0.04% 硫代硫酸鈉，0.1%聚乙烯吡咯烷酮，pH5.5）并于4℃震蕩溶解10 min。然后將混合液于4℃，10 000×g離心30 min并收集上清，于-20℃保存。（3）β-1，3-葡聚糖酶活力測定：測定反應(yīng)體系包含200 μL 10 g/L昆布多糖溶液（溶于50 mmol/L乙酸鈉緩沖液，pH5.0），200 μL 50 mmol/L乙酸鈉緩沖液（pH5.0）和100 μL蛋白提取液。該反應(yīng)體系于37℃反應(yīng)2 h，隨后沸水浴10 min終止反應(yīng)。反應(yīng)體系中加入預(yù)先滅活的蛋白提取液作為空白對照。反應(yīng)體系中每1 min生成1 μg還原糖的酶量定義為1酶活單位（1 U）。（4）幾丁質(zhì)酶活力測定：幾丁質(zhì)酶活力測定采用Ippolito等［10］報(bào)道的方法。反應(yīng)體系包含140 μL 25 g/L藍(lán)色幾丁質(zhì)溶液（溶于50 mmol/L乙酸鈉緩沖液，pH5.0）和70 μL蛋白提取液。該反應(yīng)體系于37℃反應(yīng)2 h，隨后加入100 μL 2 mol/L HCl終止反應(yīng)。（5）苯丙氨酸氨解酶活力測定：PAL活力測定采用Wang等［11］報(bào)道的方法。反應(yīng)體系包含500 μL 20 mmol/L L-苯丙氨酸（溶于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.5），400 μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.5）和100 μL蛋白提取液。該反應(yīng)體系于37℃反應(yīng)2 h，隨后加入200 μL 6 mol/L HCl終止反應(yīng)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件（V-er. 18.0，SPSS Inc.，美國）。單因素方差分析（one-way ANOVA）用于各測定指標(biāo)不同處理組之間的比較。最小顯著差數(shù)法（least significant difference，LSD）用于測定指標(biāo)間顯著性分析（顯著性水平P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 香菇多糖提高黃瓜對炭疽病菌的抗性

三種濃度的Ltn溶液處理黃瓜葉片后對葉片上炭疽病菌侵染形成的菌斑數(shù)量和菌斑面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明經(jīng)Ltn處理后黃瓜植株對炭疽病抗性明顯增加，并且抗性效果隨著Ltn濃度增加而逐漸增強(qiáng)。Ltn濃度達(dá)到0.75 g/L后，葉片感染面積和病變數(shù)量與對照組相比均顯著性下降，而Ltn濃度提高至2.00 g/L時(shí)，與對照組相比抗性效力接近50%，表現(xiàn)出較為理想的效果。

表1 香菇多糖誘導(dǎo)黃瓜葉片對炭疽病的抗性效果

2.2 香菇多糖濃度對誘抗效果的影響

采用Ltn處理黃瓜葉片24 h后，胞內(nèi)SA濃度隨著Ltn濃度提高而迅速增加（圖1）。采用0.75 g/L Ltn處理葉片后，胞內(nèi)SA達(dá)到1.785 μg/g，而繼續(xù)提高Ltn濃度，胞內(nèi)SA水平保持穩(wěn)定。結(jié)果表明，Ltn濃度0.75 g/L是達(dá)到穩(wěn)定誘導(dǎo)效果的臨界水平，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在此水平條件下進(jìn)行。

圖1 香菇多糖處理黃瓜葉片24 h后胞內(nèi)水楊酸濃度變化

2.3 香菇多糖提高黃瓜胞內(nèi)信號分子濃度

測定經(jīng)Ltn誘導(dǎo)后黃瓜葉片細(xì)胞內(nèi)H2O2和SA濃度變化趨勢。結(jié)果（圖2）顯示，經(jīng)Ltn誘導(dǎo)后胞內(nèi)H2O2濃度急劇升高，至10 min后達(dá)到峰值，隨后迅速下降。盡管誘導(dǎo)30 min后H2O2濃度仍高于誘導(dǎo)前水平但是兩者之間無顯著性差異。60 min后胞內(nèi)H2O2濃度恢復(fù)至誘導(dǎo)前水平。胞內(nèi)SA濃度變化趨勢與H2O2類似。胞內(nèi)SA水平迅速增加至誘導(dǎo)4 h后達(dá)到峰值，隨后逐漸下降至120 h后恢復(fù)至誘導(dǎo)前水平。

圖2 香菇多糖處理后黃瓜葉片胞內(nèi)H2O2（A）和水楊酸（B）濃度變化曲線

2.4 香菇寡糖增強(qiáng)黃瓜胞內(nèi)抗性蛋白比活性

由圖3可知，與空白對照（CK）相比，經(jīng)0.75 g/L Ltn處理24 h后胞內(nèi)β-1，3-葡聚糖酶比酶活顯著增加至115 U/mg，誘導(dǎo)96 h后酶活下降至89 U/mg，但是仍顯著高于CK水平。另一方面，經(jīng)炭疽病菌（CO）處理后，胞內(nèi)β-1，3-葡聚糖酶的酶活水平同樣出現(xiàn)了顯著上升，但低于Ltn處理組的水平。經(jīng)Ltn和CO聯(lián)合處理（Ltn+CO）的葉片胞內(nèi)酶活與Ltn組處于同一水平。結(jié)果表明，Ltn處理能夠模擬炭疽病菌的侵染作用而提高胞內(nèi)β-1，3-葡聚糖酶的比酶活，且在96 h后仍然處于較高水平。測定表明，Ltn、CO和Ltn+CO組胞內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性相比于對照組均有了顯著增加，且3種處理方式間并無顯著性差異。該結(jié)果與β-1，3-葡聚糖酶測定結(jié)果一致，即Ltn能夠誘導(dǎo)胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白的表達(dá)。分別經(jīng)Ltn和CO處理后，黃瓜葉片胞內(nèi)PAL活性均產(chǎn)生了顯著的增加，且96 h后仍然保持較高活性。該結(jié)果與β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶測定結(jié)果一致。

圖3 處理方式對黃瓜葉片胞內(nèi)β-1，3-葡聚糖酶（A）、幾丁質(zhì)酶（B）和苯丙氨酸氨解酶（C）活力測定影響

3 討論

水楊酸（SA）作為胞內(nèi)信號分子在植物組織建立系統(tǒng)性的防御響應(yīng)過程中起到關(guān)鍵作用［12，13］。因此，以胞內(nèi)SA積累濃度作為評價(jià)指標(biāo)考察了香菇多糖（Ltn）濃度對黃瓜葉片組織誘抗效果的影響。植物細(xì)胞膜表面受體識別到誘導(dǎo)子后迅速激活氧代謝爆發(fā)產(chǎn)生活性氧中間體（ROI），如O2-和H2O2，并進(jìn)一步激活依賴ROI的防御響應(yīng)二級信使水楊酸和防御相關(guān)基因的表達(dá)以及抗菌代謝產(chǎn)物的合成［3，14］。因此，胞內(nèi)信號分子H2O2和SA積累水平產(chǎn)生顯著變化是確定細(xì)胞防御響應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵指標(biāo)。另一方面，胞內(nèi)一級和二級信號分子H2O2和SA，濃度分別在10 min和4 h時(shí)達(dá)到最高水平，表明胞內(nèi)信號放大存在一定的時(shí)間滯后效應(yīng)，該現(xiàn)象與前述研究結(jié)果一致［5，15］。胞內(nèi)SA濃度在4-96 h均顯著高于誘導(dǎo)前水平，表明Ltn處理能夠在較長時(shí)間內(nèi)對黃瓜葉片細(xì)胞的防御響應(yīng)產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。

為進(jìn)一步驗(yàn)證Ltn對黃瓜細(xì)胞防御抗性的誘導(dǎo)作用，本研究考察了經(jīng)Ltn處理后胞內(nèi)3種與防御相關(guān)的典型蛋白的酶活性的變化情況。葡聚糖酶因能夠水解致病性真菌細(xì)胞壁的主要組分β-1，3-葡聚糖而具有較高的抗真菌活性，屬于病程相關(guān)蛋白PR-2家族［16］。同時(shí)，β-1，3-葡聚糖水解后的寡糖能夠進(jìn)一步作為誘導(dǎo)子強(qiáng)化植物的防御響應(yīng)［17］。幾丁質(zhì)酶屬于病程相關(guān)蛋白PR-3、-4、-8和-11家族［16］，作用于病原菌細(xì)胞壁以保護(hù)植物自身組織［18］。苯丙氨酸氨解酶（PAL）催化L-苯丙氨酸脫氨基生成反式-肉桂酸，是苯丙素途徑的關(guān)鍵酶［19］。而苯丙素途徑的產(chǎn)物和中間物除作為物理和化學(xué)屏障以防御病原菌侵染外，還能夠激活局部信號通路以強(qiáng)化誘導(dǎo)基因的表達(dá)［4］。因此，PAL活性是評價(jià)植物防御響應(yīng)的重要指標(biāo)。分析表明，香菇多糖處理能夠顯著激活黃瓜胞內(nèi)抗性相關(guān)蛋白的活性。

測定結(jié)果表明，Ltn處理能夠顯著提高黃瓜葉片胞內(nèi)信號分子濃度，同時(shí)對細(xì)胞防御響應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)產(chǎn)生顯著促進(jìn)作用。采用Ltn處理黃瓜葉片后，胞內(nèi)防御相關(guān)蛋白的表達(dá)與經(jīng)炭疽病菌處理組具有相同水平。由此可知，預(yù)先采用Ltn處理黃瓜葉片具有增強(qiáng)植物防御炭疽病菌侵染的潛在作用。而炭疽病菌侵染實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)Ltn處理后葉片感染面積和病變數(shù)量與對照組相比均顯著性下降。

4 結(jié)論

香菇多糖Ltn處理能夠顯著提高黃瓜葉片胞內(nèi)信號分子濃度，對細(xì)胞防御響應(yīng)產(chǎn)生激活作用，能夠顯著激活黃瓜胞內(nèi)抗性相關(guān)蛋白的活性，并能顯著降低葉片被病原菌感染面積和病變數(shù)量。由上可知，香菇多糖預(yù)處理明顯提高黃瓜對炭疽病菌的抗性。作為一種環(huán)境安全性的生物多糖，香菇多糖具有發(fā)展成環(huán)境友好型生物農(nóng)藥的潛力，進(jìn)一步拓展了其應(yīng)用范圍。

［1］Jones JDG， Dangl JL. The plant immune system［J］. Nature， 2006，444（7117）：323-329.

［2］Kombrink E， Somssich IE. Defense responses of plants to pathogens［M］// Callow JHA， Inez CT， editor. Advances in Botanical Research：Academic Press， 1995：1-34.

［3］Mcdowell JM， Dangl JL. Signal transduction in the plant immune response［J］. Trends in Biochemical Sciences， 2000， 25（2）：79-82.

［4］Dixon RA， Achnine L， Kota P， et al. The phenylpropanoid pathway and plant defence-a genomics perspective［J］. Molecular Plant Pathology， 2002， 3（5）：371-390.

［5］Klarzynski O， Plesse B， Joubert JM， et al. Linear β-1， 3 glucans are elicitors of defense responses in tobacco［J］. Plant Physiology，2000， 124（3）：1027-1037.

［6］ Li J， Zhu L， Lu G， et al. Curdlan β-1， 3-Glucooligosaccharides induce the defense responses against Phytophthora infestans infection of potato（Solanum tuberosum L. cv. McCain G1）leaf cells［J］. PLoS One， 2014， 9（5）：e97197.

［7］ Zhang PY， Wang JC， Liu SH， et al. A novel burdock fructooligosaccharide induces changes in the production of salicylates， activates defence enzymes and induces systematic acquired resistance to Colletotrichum orbiculare in cucumber seedlings［J］. Journal of Phytopathology， 2009， 157：201-207.

［8］Li SJ， Zhu TH. Biochemical response and induced resistance against anthracnose（Colletotrichum camelliae）of camellia（Camellia pitardii）by chitosan oligosaccharide application［J］. Forest Pathology， 2013， 43：67-76.

［9］ van Spronsen PC， Tak T， Rood AM， et al. Salicylic acid inhibits indeterminate-type nodulation but not determinate-type nodulation［J］. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2003， 16（1）：83-91.

［10］Ippolito A， El Ghaouth A， Wilson CL， et al. Control of postharvest decay of apple fruit by Aureobasidium pullulans and induction of defense responses［J］. Postharvest Biology and Technology，2000， 19（3）：265-272.

［11］Wang JW， Wu JY. Involvement of nitric oxide in elicitor-induced defense responses and secondary metabolism of Taxus chinensis cells［J］. Nitric Oxide-Biology and Chemistry， 2004， 11（4）：298-306.

［12］Delaney TP， Uknes S， Vernooij B， et al. A central role of salicylic acid in plant disease resistance［J］. Science， 1994， 266（5188）：1247-1250.

［13］ Zhang ZG， Wang YC， Ji R， et al. The role of SA in the hypersensitive response and systemic acquired resistance induced by elicitor PB90 from Phytophthora boehmeriae［J］. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2004， 65（1）：31-38.

［14］ Jones JD， Dangl JL. The plant immune system［J］. Nature， 2006，444（7117）：323-329.

［15］El Modafar C， Elgadda M， El Boutachfaiti R， et al. Induction of natural defence accompanied by salicylic acid-dependant systemic acquired resistance in tomato seedlings in response to bioelicitors isolated from green algae［J］. Scientia Horticulturae， 2012， 138：55-63.

［16］Van Loon L， Van Strien E. The families of pathogenesis-related proteins， their activities， and comparative analysis of PR-1 type proteins［J］. Physiological and Molecular Plant Pathology， 1999，55（2）：85-97.

［17］Vigers AJ， Roberts W， Selitrennikoff CP. A new family of plant antifungal proteins［J］. Molecular Plant-Microbe Interactions，1991， 4（4）：315-323.

［18］Ku? J. Molecular aspects of plant responses to pathogens［J］. Acta Physiologiae Plantarum， 1997， 19（4）：551-559.

［19］Matsuda F， Morino K， Ano R， et al. Metabolic flux analysis of the phenylpropanoid pathway in elicitor-treated potato tuber tissue［J］. Plant and Cell Physiology， 2005， 46（3）：454-466.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Mechanism of Lentinan Enhancing the Resistance of Cucumber Seedlings to Colletotrichum orbiculare

ZHANG Wen-hua
（Baotou Light Industry Vocational Technical College，Baotou 014030）

This study is to investigate the inducing effect of lentinan on the defense responses of cucumber（Cucumis sativus L. cv. Jinfeng）seedling leaves. The seedlings were treated with 0.75 g/L of lentinan. The concentration of H2O2and salicylic acid in cells of leaves increased rapidly and reached the peak levels at 10 min and 4 h，respectively. Afterwards，the levels of both H2O2and salicylic acid gradually declined to the ones before treatment. Moreover，the activities of defense related proteins，including β-1，3-glucanase，chitinase，and phenylalanine ammonia lyase，significantly increased after lentinan induction，and still kept stable after 96 hours. In addition，the resistance of cucumber treated with lentinan to Colletotrichum orbiculare was notably enhanced after lentinan induction. Both the number and area of lesions on cucumber leaves significantly decreased to 53.1% and 51.3% in comparison with the control，respectively，which indicated that lentinan played a role in inducing the defense responses of cucumber cells.

lentinan；Cucumis sativus L. cv. Jinfeng；defense response；Colletotrichum orbiculare

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.015

2015-06-09

張文華，女，講師，研究方向：微生物技術(shù)與應(yīng)用；E-mail：1072418227@qq.com