蔡之軍李金軍周德銀富昊偉

（1. 浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（所），嘉興 314016；2. 江蘇省興化市農(nóng)業(yè)委員會(huì)，興化 225700）

利用分子標(biāo)記技術(shù)改良粳稻不育系的柱頭外露率

蔡之軍1李金軍1周德銀2富昊偉1

（1. 浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（所），嘉興 314016；2. 江蘇省興化市農(nóng)業(yè)委員會(huì)，興化 225700）

提高粳稻不育系的柱頭外露率是提高雜交粳稻制種產(chǎn)量最有效途徑。通過(guò)雜交、回交等常規(guī)手段將秈稻中控制柱頭外露率的QTLs（qPES3、qPES9及qPES12）導(dǎo)入粳稻，通過(guò)系譜選育和分子檢測(cè)技術(shù)試圖選育高柱頭外露率粳稻不育系，旨在探索利用分子標(biāo)記技術(shù)改良粳稻不育系柱頭外露率的可行性。研究結(jié)果表明，試驗(yàn)中獲得的2個(gè)粳稻不育系為攜帶qPES3+qPES12的雙聚體，其柱頭外露率及異交結(jié)實(shí)率表型值顯示：調(diào)控秈稻高柱頭外露率QTLs能夠在粳稻背景中表達(dá)，但存在基因型差異；分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)是改良粳稻不育系柱頭外露率的有效手段。

粳稻不育系；柱頭外露；分子標(biāo)記

在20世紀(jì)80年代我國(guó)雜交粳稻出現(xiàn)了迅速發(fā)展，但其種植面積所占粳稻總面積的比例僅3%左右，遠(yuǎn)小于雜交秈稻所占的70%［1］。近年來(lái)，雖然出于國(guó)家糧食安全的需要，國(guó)家及科研單位加大力度研究和推廣，但雜交粳稻的發(fā)展速度仍然緩慢，究其原因雜交粳稻的低制種產(chǎn)量嚴(yán)重影響了其產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展［2］。

粳稻不育系的異交結(jié)實(shí)率低是制約雜交粳稻制種產(chǎn)量的主要因素。田大成等［3］研究認(rèn)為，柱頭外露穎花與非外露穎花異交能力存在巨大差異，前者結(jié)實(shí)率比后者一般高3-4倍，依靠柱頭外露穎花開(kāi)花當(dāng)天及以后接受花粉受精結(jié)實(shí)是異交結(jié)實(shí)的重要途徑，開(kāi)花當(dāng)天異交結(jié)實(shí)一般不到總粒數(shù)的50%，而開(kāi)花第2天后一般可占50%。李慶榮［4］認(rèn)為柱頭外露穎花的結(jié)實(shí)率占制種異交結(jié)實(shí)的 70%-80%，是構(gòu)成制種產(chǎn)量的主體。楊保漢等［5］研究認(rèn)為，在自然條件下，不育系柱頭外露率每提高1%，結(jié)實(shí)率可提高0.74%-0.92%，每公頃可增產(chǎn)47-68 kg。林建榮等［6］研究表明保持系柱頭外露與不育系柱頭外露存在著極著的遺傳關(guān)系。由浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育的晚粳稻嘉58，其對(duì)應(yīng)的BT型不育系嘉58A，不育性穩(wěn)定、不育度高，綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良，具有良好的配合力，但柱頭外露低（約為1.0%），利用嘉58A配制的雜交粳稻（組合）皆因制種產(chǎn)量低而影響在生產(chǎn)上的應(yīng)用。本研究試圖將控制水稻柱頭外露率的QTL導(dǎo)入嘉58A，探索利用分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行人工創(chuàng)制高柱頭外露率粳稻不育系的技術(shù)可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

以天津市農(nóng)科院提供的高柱頭外露率育種材料T60B（來(lái)自50S，秈型，柱頭總外露率73%）為父本，浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（所）三系粳稻保持系嘉58B（柱頭總外露約為1.0%）為母本進(jìn)行雜交和回交，嘉隆17B和嘉隆43B是嘉58B高柱頭外露率基因?qū)胂?。試?yàn)在浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（所）試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行，群體及系圃均采用單本植，插植規(guī)格為23.0 cm×16.7 cm，水肥管理及病蟲(chóng)害防治按一般生產(chǎn)用田。

1.2 方法

1.2.1 考察柱頭外露率 2014年6月，種植嘉隆17A、B系，嘉隆43A、B系和嘉58A、B系鑒定圃（各1 000株），待不育系穗楊花期隨機(jī)選取100個(gè)單株的主莖穗，通過(guò)目測(cè)調(diào)查每穗的總穎花數(shù)、單邊柱頭外露穎花數(shù)和雙邊柱頭外露穎花數(shù)，計(jì)算單邊柱頭外露率和雙邊柱頭外露率及總外露率。

1.2.2 分子標(biāo)記檢測(cè) 50S攜帶的柱頭外露的QTLs連鎖標(biāo)記為SSR標(biāo)記。檢測(cè)目標(biāo)QTL的水稻DNA采用趙國(guó)珍等［7］提法提取，PCR反應(yīng)體系為：DNA模板2 μL，滅菌水20 μL和混合物16 μL。其中混合物為：滅菌水8.0 μL，dNTP 2.8 μL，Buffer 4.0 μL，左右引物各0.5 μL，Taq酶0.2 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 4 min；25℃ 1 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 考察異交結(jié)實(shí)率 2014年6月至10月在浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（所）農(nóng)場(chǎng)，用花時(shí)中等偏早的秈粳交恢復(fù)系HR511為父本，嘉隆43A、嘉隆17A和嘉58A為母本，進(jìn)行大田小區(qū)制種。根據(jù)不育系的始播歷期合理安排播種期。試驗(yàn)中父本HR511安排在6月13日播種，母本安排在6月6日播種，使父母本均能在9月3日左右始穗。父母本行比為2∶4，行距23.0 cm，株距16.7 cm，單本植，每個(gè)不育系制種小區(qū)面積約為30 m2，2次重復(fù)。父母本楊花后，每個(gè)小區(qū)從不育系中間2行選取整齊一致的穗子20個(gè)進(jìn)行掛牌，選其中10個(gè)穗，午后觀察柱頭外露情況，并對(duì)柱頭單雙外露的穎花用油筆做好記號(hào)，每天分2個(gè)時(shí)段（10：30-11：00，11：30-12：00）進(jìn)行人工輔助趕粉，直到父本的穎花開(kāi)完為止齊穗后25 d，同時(shí)選取非標(biāo)記穗10個(gè)，調(diào)查籽粒的柱頭外露粒的柱頭夾持及結(jié)實(shí)情況。采用DPS軟件對(duì)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 考察外露柱頭的結(jié)實(shí)率 采用延遲授粉法，使父本開(kāi)花時(shí)隔離，標(biāo)記每天開(kāi)的母本穎花（100粒），去除閉穎粒和未開(kāi)花粒，然后在同一天使標(biāo)記的穎花接受父本花粉，閉穎后開(kāi)花標(biāo)記粒的柱頭外露情況，用柱頭外露粒結(jié)實(shí)率作為衡量柱頭活性的大小。分別于開(kāi)花后0、1、2、3、4、5、6和7 d授粉計(jì)算柱頭外露粒結(jié)實(shí)率，計(jì)算公式為：某天外露柱頭結(jié)實(shí)率（%）=柱頭外露粒結(jié)實(shí)粒數(shù)/柱頭外露粒數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 柱頭外露QTL分子檢測(cè)及表型

利用分子檢測(cè)能夠?qū)⒄{(diào)控柱頭外露的QTL（圖1和表1）導(dǎo)入粳稻品系中（表2，部分導(dǎo)入系）。本試驗(yàn)中qPES3、qPES12連鎖標(biāo)記PSM377、RM270在T60B和嘉58B多態(tài)性顯著（圖2），導(dǎo)入系嘉隆11A、嘉隆13A導(dǎo)入了qPES3+qPES9，嘉隆17A、嘉隆43A和嘉隆47A入了qPES3+qPES12，嘉隆51A、嘉隆53A導(dǎo)入了qPES9+qPES12，嘉隆56、嘉隆62A導(dǎo)qPES3+qPES9+qPES12；嘉隆17B和嘉隆43B早實(shí)現(xiàn)綜合農(nóng)藝性狀的穩(wěn)定，株型特征親嘉58B，其不育系為嘉隆17A和嘉隆43A，經(jīng)多代分子檢測(cè)顯示嘉隆17B、嘉隆43B均攜帶qPES3和qPES12位點(diǎn)（圖3）。表2中列出的9個(gè)系表型值，有5系的柱頭外露率超過(guò)60.0%，2系在40.0%-50.0%，2系在30.0%-40.0%，較嘉58A均表現(xiàn)極顯著提高，且柱頭外露率（qPES3+qPES9+qPES12）＞柱頭外露率（qPES3 +qPES12或qPES3 +qPES9）。

圖1 幾個(gè)粳稻不育系的柱頭外露表現(xiàn)

表1 50S控制柱頭外露率的QTL定位［8］

圖2 PSM377和RM270在親本間多態(tài)性分析

圖3 柱頭外露QTL（qPES3和qPES12）的分子標(biāo)記檢測(cè)

2.2 柱頭外露粳稻不育系的異交結(jié)實(shí)率

本研究調(diào)查了嘉隆17A、嘉隆43A和嘉58A三個(gè)不育系的楊花期外露柱頭籽粒和柱頭發(fā)生夾持籽粒的結(jié)實(shí)情況。結(jié)果（表3和圖4）表明，嘉隆17A的柱頭單邊外露籽粒結(jié)實(shí)率為71.22%，柱頭雙邊外露籽粒為73.37%，占總結(jié)實(shí)粒的比率分別為64.01%和28.65%，二者對(duì)總結(jié)實(shí)率的貢獻(xiàn)率超過(guò)82.0%，嘉隆43A的柱頭單雙邊外露籽粒結(jié)實(shí)率分別為67.53%和62.69%，占其總結(jié)實(shí)粒比例53.75%和28.72%，對(duì)總結(jié)實(shí)粒的貢獻(xiàn)率超過(guò)81.0%。

表3同時(shí)表明，嘉隆17A單雙邊柱頭夾持率為99.65%和97.0%，嘉隆43A分別為99.0%和97.8%，單柱頭的夾持率略高于雙柱頭的夾持率，嘉58A柱頭不發(fā)生夾持現(xiàn)象，嘉隆17A單雙邊柱頭夾持粒結(jié)實(shí)率分別達(dá)75.16%和72.94%，占總結(jié)實(shí)粒的比超過(guò)85.0%，嘉隆43A表現(xiàn)類似規(guī)律；研究還表明嘉隆17A和嘉隆43A的夾持粒結(jié)實(shí)率均略高于其外露粒結(jié)實(shí)粒。

2.3 花后外露柱頭活性的動(dòng)態(tài)變化

圖5顯示，3個(gè)粳稻不育系的楊花當(dāng)天（花后0 d）柱頭活性最強(qiáng)，均接近80.0%的結(jié)實(shí)率，其中柱頭外露不育系嘉隆17A和嘉隆43A的柱頭略高于柱頭非外露不育系嘉58A，在花后1-6 d，嘉58A花后1 d后柱頭活性激劇下降，花后2 d后柱頭基本沒(méi)有活性，與嘉58A相比，嘉隆17A和嘉隆43A的柱頭在花后1.5-5 d仍有較高的授粉結(jié)實(shí)能力，柱頭活力下降幅度較平緩。其中花后1-5 d嘉隆43A柱頭活性高于嘉隆17A，這可能與嘉隆43A雙柱頭外露率高于嘉隆17A，表3中嘉隆17A和嘉隆43A的雙柱頭外露籽粒結(jié)實(shí)率均高于其對(duì)應(yīng)的單柱頭外露籽粒的結(jié)實(shí)率，進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論。

表2 柱頭外露QTLs部分導(dǎo)入系的A/B系柱頭外露表現(xiàn)

表3 不育系柱頭外露粒和夾持粒的結(jié)實(shí)情況

圖4 幾個(gè)粳稻不育系柱頭夾持情況

圖5 幾個(gè)粳稻不育系外露柱頭籽?；ê蠡钚詣?dòng)態(tài)

3 討論

李晨等利用栽培稻和野生稻的BC1群體，將2個(gè)控制水稻柱頭外露的QTL分別定位于第5染色體R2289-CT1553間和第8染色體的G1149-R1963間，且認(rèn)為在5號(hào)和8號(hào)染色體的QTL貢獻(xiàn)率達(dá)到10.9%和11.4%［9］；Miyata等［10］在第3條染色體的C53358-AL607101間定位了1個(gè)控制柱頭外露率QTL，并利用分子標(biāo)記進(jìn)行前景選擇和背景選擇，獲得含有IR24柱頭外露率主效基因的新品系，證明可以利用分子標(biāo)記輔助選擇柱頭外露主效QTL。鄧應(yīng)德等［11］利用秈粳交宜糯5號(hào)/優(yōu)B F2群體在第2、5和8染色體上定位到控制柱頭外露率的QTL。尹成［12］和沈圣泉等［13］在考慮到基因互作和GE互作的前提下，檢查出位于6號(hào)染色體貢獻(xiàn)率達(dá)到19.1%的主效QTL，雖然以上研究發(fā)現(xiàn)的水稻柱頭外露的QTL貢獻(xiàn)率都達(dá)到10%以上，但是對(duì)其應(yīng)用限制，還主要是對(duì)QTL的緊密連鎖的分子標(biāo)記發(fā)掘不夠，不能高效精確實(shí)現(xiàn)標(biāo)記輔助選擇。筆者試圖利用T60B攜帶控制柱頭外露的QTL連鎖標(biāo)記，將qPES3、qPES12成功導(dǎo)入粳稻背景中并獲得qPES3+qPES12的穩(wěn)定表達(dá)粳稻不育系，研究結(jié)果再次證明利用分子標(biāo)記可以有效輔助人工創(chuàng)制高柱頭外露率的粳稻不育系。本研究中的兩個(gè)不育系柱頭外露表現(xiàn)差異明顯，可能與人工選擇背景有關(guān)，即qPES3、qPES12表達(dá)存在基因型差異，與其保持系相比，不育系的柱頭外露率顯著高于對(duì)應(yīng)保持系，這可能因?yàn)樵诰颈尘跋驴刂浦^外露QTL也存在不育胞質(zhì)效應(yīng)，與秈稻中報(bào)道一致。

秈稻不育系的柱頭外露穎花在開(kāi)花當(dāng)天及其后的3 d內(nèi)都具有較強(qiáng)的受精能力，有花粉供給時(shí)柱頭外露率在60%以上，則結(jié)實(shí)率一般不低于60%，活性柱頭率98%以上，柱頭活性強(qiáng)的不育系能夠有效利用父本的非及時(shí)花粉提高不育系結(jié)實(shí)率［14］。筆者研究了粳稻不育系的楊花后柱頭活力的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明，粳稻不育系的柱頭活性在開(kāi)花當(dāng)天均表現(xiàn)較強(qiáng)，活性柱頭率80%左右，不育系間差異不顯著，但花后1-7 d，柱頭外露不育系的柱頭在花后1-5 d表現(xiàn)較強(qiáng)的接受花粉結(jié)實(shí)的能力，無(wú)柱頭外露不育系的花后2 d柱頭活性急劇下降、3 d后基本不具備活性，與柱頭外露的秈稻不育系相比，柱頭外露的粳稻不育系活性柱頭率表現(xiàn)較低，但柱頭的活性持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。本研究比較了粳稻不育系外露柱頭的夾持情況，結(jié)果認(rèn)為柱頭外露粒95%以上柱頭發(fā)生了夾持現(xiàn)象，粳稻不育系楊花閉穎時(shí)柱頭外露粒和籽粒蠟熟黃熟期柱頭夾持粒表現(xiàn)趨勢(shì)一致，在育種實(shí)踐中可通過(guò)考察籽粒的柱頭夾持率來(lái)選擇柱頭外露性狀的目的。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)分子標(biāo)記與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，有效改良了粳稻不育系的柱頭外露率，來(lái)自秈稻的QTLs能夠在粳稻中穩(wěn)定表達(dá)。研究結(jié)果證實(shí)了分子標(biāo)記技術(shù)在選擇水稻QTLs的可能性和有效性，同時(shí)表明要提高粳稻的異交特性仍然要通過(guò)利用秈稻的有利性狀來(lái)實(shí)現(xiàn)。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Improving the Percentage of Exerted Stigma in CMS Lines of Japonica Hybrid Rice by Molecular Marker-assisted Selection

CAI Zhi-jun1LI Jin-jun1ZHOU De-yin2FU Hao-wei1
（1. Jiaxing Academy of Agricultural Science Research of Zhejiang Province，Jiaxing 314016；2. Agricultural Commission of Xinghua City in Jiangsu Province，Xinghua 225700）

It is the most effective way to improve the yield of seed production of Japonica hybrid rice by enhancing the percentage of exerted stigma in its CMS lines. In this research，QTLs（qPES3，qPES9，qPES12），regulating the percentage of exerted stigma in indica rice，were transmitted into CMS lines of Japonica hybrid rice through crossing and backcrossing，aiming at selecting the CMS lines of Japonica hybrid rice with high percentage of exerted stigma by pedigree breeding and molecular detection technique，i.e.，exploring the feasibility of improving the percentage of exerted stigma in CMS lines of Japonica hybrid rice by molecular marker technique. The research results showed that Jialong17A and Jialong43A，two CMS lines developed in this study，carried both qPES3and qPES12. The phenotypic values of percentage of exerted stigma and outcrossing rate indicated that QTLs expressed in Japonica rice，but displaying difference in various genetic background. Conclusively，molecular marker-assisted selection（MAS）is an efficient method to improve the percentage of exerted stigma in CMS lines of Japonica hybrid rice.

CMS lines of Japonica hybrid rice；percentage of exerted stigma；molecular marker-assisted selection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.009

2015-10-06

浙江省重大項(xiàng)目（2010C1202），嘉興市重點(diǎn)項(xiàng)目（2012AZ1004），嘉興市中科專項(xiàng)（SQ2012010412）

蔡之軍，男，碩士，農(nóng)藝師，研究方向：雜交粳稻育種；E-mail：czj982002@126.com

李金軍，男，研究員，研究方向：常規(guī)、雜交粳稻新品種選育；E-mail：lijinjunjx@163.com