尹珅 賀桂芳 賴方秾 謝鳳云 馬俊宇

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生殖科學(xué)研究院 動物生殖與種質(zhì)創(chuàng)新山東省高校重點實驗室 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，青島266109）

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)

尹珅 賀桂芳 賴方秾 謝鳳云 馬俊宇

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生殖科學(xué)研究院 動物生殖與種質(zhì)創(chuàng)新山東省高校重點實驗室 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，青島266109）

在細菌中發(fā)現(xiàn)的免疫系統(tǒng)CRISPR/Cas9，已經(jīng)成為最有效的基因工程編輯工具，甚至大有希望可以治療人類遺傳性疾病。但是CRISPR/Cas9系統(tǒng)在使用時會產(chǎn)生嚴重的脫靶問題，導(dǎo)致假表型和錯誤的解釋。提高與靶點結(jié)合的高效率，同時減少脫靶效應(yīng)，將是今后CRISPR/Cas9技術(shù)的挑戰(zhàn)。綜述關(guān)注與CRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)相關(guān)的內(nèi)容，總結(jié)了影響其靶點專一性的因素，減少CRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)的可行性方法和設(shè)計工具等，供大家學(xué)習(xí)討論。

脫靶；靶點專一性；CRISPR/Cas9

1987年，Ishino等首先在K12大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列［1，2］，2002年，這種序列被命名為成簇的規(guī)律間隔性短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）［3］。2005年，根據(jù)幾個實驗室的實驗結(jié)果推測，CRISPR及其相關(guān)蛋白CRISPR-associated protein 9（Cas9）與細菌的免疫機制有關(guān)，可以用來識別并降解外來的DNA，抵抗遺傳侵入［4-6］。隨后的研究證實了這一推測，CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種免疫防御機制，在細菌和古細菌基因組中是廣泛存在的，可以抵抗侵入的病毒和質(zhì)粒［7-11］。

釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes，Sp）來源的II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)利用核酸酶Cas9，與兩種非編碼RNA，即crRNA和tracrRNA來錨定目標DNA［12］。這兩種非編碼RNA可以進一步簡化融合成一段單鏈引導(dǎo)RNA（single guide RNA，SgRNA）。保守的間隔相鄰基序（Proto-spacer adjacent motif，PAM）位于基因組靶點的3'端，是Cas9識別靶點所必需的序列。如果PAM序列前17-20個核苷酸與SgRNA序列相同，那么Cas9/SgRNA復(fù)合體可以特異地結(jié)合到這段特定序列上。成功結(jié)合以后，Cas9的兩個獨立的核酸酶結(jié)構(gòu)域?qū)⒃赑AM序列前3個堿基處切斷DNA雙鏈，留下一個平末端的DNA雙鏈斷裂（DNA double stranded break，DSB）。這種DSB可以通過非同源末端侵入（non-homologous end joining，NHEJ）通路修復(fù)，也可以通過同源重組（homologous recombination，HR）進行修復(fù)［2，13，14］。

當作用機制被研究清楚后，科學(xué)家們短短幾年就將CRISPR/Cas9發(fā)展為全世界最熱和最有力的基因工程工具，各種研究性文章層出不窮［15-19］。CRISPR/Cas9成功用于多種植物和動物的基因敲除、基因插入、基因調(diào)控、基因修復(fù)和文庫篩選等，加速了農(nóng)作物的改良和動物育種，甚至逐漸走向臨床應(yīng)用，有望治療人類遺傳性疾病。然而CRISPR/Cas9并非沒有缺點，它也會引起嚴重的脫靶（Off-target）效應(yīng)［20-22］，產(chǎn)生假表型和錯誤的解釋，有時甚至?xí)a(chǎn)生嚴重的副作用。在應(yīng)用大文庫Cas9載體選擇性篩選特定表型的時候尤其需要著重考慮CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)，如果一個少見的脫靶突變恰好得到了目的基因突變的表型，就會影響整個試驗的準確性。唯一真正有效的驗證方法就是對得到的突變體進行全基因組深度測序［23］。顯而易見，這對大多數(shù)實驗室來說花費昂貴，且費時費力。所以在CRISPR/Cas9試驗開始之前，利用前人總結(jié)的經(jīng)驗、設(shè)計原則來提高CRISPR/Cas9特異性，這樣才能最大可能獲得真正想要的目地突變體，避免脫靶效應(yīng)的影響。本篇綜述僅關(guān)注CRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)相關(guān)問題，與大家共同探討。

1 影響Cas9/SgRNA靶點專一性的因素

1.1 PAM序列

細菌的種類不同，錨定靶點DNA的PAM序列也有所不同［24，25］，但所有PAM序列都嚴格位于靶點序列的3'端，被Cas9的獨特結(jié)構(gòu)域所識別［15，26］。目前應(yīng)用最廣的是釀膿鏈球菌Cas9（SpCas9），PAM典型序列是NGG，N可以是任何核苷酸，沒有差異。可以推測：如果第一位核苷酸明確限制為4種核苷酸中的任何一種，那么Cas9識別的目標就會減少到原來的1/4，明顯提高了識別靶點的專一性；如果PAM序列更長一些，變成4位或者5位核苷酸，那么同樣可以明顯減少Cas9識別的目標序列，使靶點位置更準確。值得注意的是，這種更長的PAM序列提高了靶點的專一性，可以減少脫靶效應(yīng)，但同時也減少了對于目標序列的可設(shè)計靶點數(shù)目。

1.2 Cas9/SgRNA的豐度

進行體外質(zhì)粒酶切操作時，如果核酸酶濃度過高，就會產(chǎn)生對質(zhì)粒的錯切。同樣可以推測，當Cas9/SgRNA復(fù)合體的有效濃度增高時，Cas9切割的專一性就會降低。體外實驗也表明，過多的Cas9/ SgRNA復(fù)合體存在會導(dǎo)致SgRNA錯配率的增加［21］。在細胞體內(nèi)試驗中，如果適當減少Cas9和SgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度，靶點的專一性會隨之增加［22］。如果增加Cas9蛋白質(zhì)濃度2.6倍，在全基因組范圍，錯配數(shù)目就會增加2.6倍［23］。在小鼠基因組中，當恒定Cas9蛋白濃度時，SgRNA的豐度就會決定錯配數(shù)目［27］。由上可見，Cas9/SgRNA的相對豐度可以決定靶點的專一性。任何改變Cas9或者SgRNA表達水平的變化都會影響脫靶數(shù)目。

1.3 SgRNA結(jié)構(gòu)

對于不同的SgRNA，錯配的數(shù)目、位置差別非常大。所以，SgRNA除了可以引導(dǎo)Cas9結(jié)合到特定靶點，其本身結(jié)構(gòu)也可以影響對靶點的專一性［20-22，28］。對SgRNA的3'端結(jié)構(gòu)區(qū)進行加長或者縮短修飾，都會改變SgRNA的轉(zhuǎn)錄效率或者穩(wěn)定性，進而改變SgRNA的表達水平［24］。例如，SgRNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)上有RNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄終止信號（4個連續(xù)的U-A配對），將最后一個突變?yōu)锳-U配對，改變了原有的終止信號，從而避免SgRNA轉(zhuǎn)錄的過早終止，增加了SgRNA的表達水平；對SgRNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)長度增加了5 bp，可以改進與Cas9的結(jié)合，形成更多有效的Cas9/SgRNA復(fù)合體［29］。所以，改變SgRNA結(jié)構(gòu)可以影響SgRNA的表達，以及SgRNA與Cas9的組裝效率，從而改變了有效Cas9/SgRNA的豐度，對靶點專一性產(chǎn)生影響。

1.4 SgRNA引導(dǎo)序列的長度

通常SgRNA上的引導(dǎo)序列是20個核苷酸，與基因組目標序列PAM前20個核苷酸序列互補形成RNA-DNA雙鏈。然而，并不是增加SgRNA的引導(dǎo)序列長度，就能提高靶點的專一性。例如，將5'引導(dǎo)序列增加到30個核苷酸，結(jié)果利用Northern Blot發(fā)現(xiàn)延長的5'端在體內(nèi)被剪切掉［30］。這表明長的SgRNA并不穩(wěn)定，Cas9蛋白只能保護大約20個核苷酸長度的引導(dǎo)序列。并且，如果SgRNA引導(dǎo)序列被剪短到17-18個核苷酸，那么靶點專一性會得到很大提高，可能因為開始的2-3個核苷酸對與靶點的結(jié)合沒有幫助，反而能增加與脫靶位點結(jié)合的可能性［31］。

1.5 種子區(qū)域序列

在細菌和哺乳動物中，PAM近端1-12位堿基發(fā)生錯配就可以導(dǎo)致靶點切割效率的降低甚至消失，所以PAM近端1-12位堿基可以定義為決定Cas9切割效率的種子區(qū)域（Seed）［32，33］。近來試驗表明PAM近端1-5位堿基序列可能是更精確的種子區(qū)域［27，34］。盡管不同試驗檢測到的序列長度有所不同，但是種子區(qū)域序列的確可以幫助決定靶點專一性。在哺乳動物基因組中，每個SgRNA有數(shù)以萬計的與種子區(qū)域結(jié)合的潛在位點。例如，在小鼠基因組中大約有一百萬個AAGGA（種子區(qū)域）+NGG（PAM）序列，而只有一萬個CGTCG+NGG序列，如果設(shè)計SgRNA引導(dǎo)序列時選擇豐度更高的AAGGA+NGG，很明顯會有更多的結(jié)合靶點，那么潛在的脫靶位點也隨之增高；如果選擇豐度更低的CGTCG+NGG，那么就會有更高的靶點專一性［27］。

1.6 染色質(zhì)特征的影響

此外，基因組DNA并不是簡單的、敞開所有空間結(jié)構(gòu)的線性雙鏈DNA。在細胞不同時期，基因組DNA折疊組裝成染色質(zhì)，進一步形成空間結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的染色體，種子區(qū)域+PAM序列被包埋在內(nèi)部，因此Cas9蛋白與染色質(zhì)種子區(qū)域序列的親和性（accessibility）也是必須要考慮的問題。更強的染色質(zhì)親和性可以讓Cas9更容易結(jié)合埋在內(nèi)部的種子區(qū)域+PAM序列，有一種Cas9的突變體，dCas9-VP64融合蛋白能夠結(jié)合染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)非開放區(qū)域序列，并且激活轉(zhuǎn)錄［35］。

靶點位置序列的CpG島甲基化狀態(tài)也與靶點專一性有關(guān)。CpG島甲基化與染色質(zhì)沉默相關(guān)，更多的甲基化狀態(tài)可以降低結(jié)合力，進而影響靶點的專一性［23］。由此也可以推測，染色質(zhì)除甲基化的其他表觀遺傳修飾，如組蛋白乙酰化程度也能影響靶點的專一性。

上面總結(jié)的影響Cas9/SgRNA靶點專一性的因素很可能是不完整的和偏差的，很多試驗只能發(fā)現(xiàn)一小部分的錯配位點或預(yù)測的假陽性結(jié)果，只有多項試驗結(jié)果結(jié)合在一起才可能對影響靶點專一性的因素有更廣泛和更深入的理解。例如，染色體免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）方法檢測Cas9結(jié)合位點，配合全基因組測序可以移除Cas9非依賴性的假陽性（如測序錯誤和ChIP偏差），獲得真實可靠的Cas9靶點。此外，由于靶點特異性高度依賴于目標基因序列，所以小樣本數(shù)量SgRNA也會引起偏差，這種產(chǎn)生偏差的試驗研究所得到的經(jīng)驗規(guī)則自然也是有偏差的。但是對于現(xiàn)在這些試驗，如ChIP、體外篩選、全基因組測序等，很難擴大試驗規(guī)模來減少偏差，所以只有利用偏差較少的試驗來幫助進行大數(shù)量SgRNA的研究［23］。因此發(fā)展高效、經(jīng)濟、定量評測脫靶效應(yīng)的試驗技術(shù)是目前迫切需要的。利用整合酶缺陷的慢病毒載體（integrase-defective lentiviral vectors，IDLVs）捕獲DSB結(jié)合測序可能是不錯的新方法。Cas9切割可以產(chǎn)生DSB，IDLVs可以通過NHEJ通路整合DSB進而發(fā)現(xiàn)全基因組切割位點［36］。同時利用沒有Cas9或者SgRNA處理的細胞做嚴格的對照，可以幫助剔除假陽性。

2 降低脫靶效應(yīng)的可行性策略

2.1 控制Cas9/SgRNA的豐度

如上所述，任何改變Cas9/SgRNA豐度的策略都會影響脫靶效應(yīng)。典型的Cas9/SgRNA復(fù)合體都是通過表達載體瞬時轉(zhuǎn)染細胞得到的，當增加質(zhì)粒濃度或者用強啟動子的時候，增加了Cas9/SgRNA復(fù)合體的豐度，增加了對正確靶點的結(jié)合效率，但隨之脫靶效應(yīng)也明顯增加。如果降低轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒濃度或者使用弱的啟動子，就會減少Cas9/SgRNA復(fù)合體的豐度，這樣就會增加靶點專一性，降低脫靶效應(yīng)。很明顯這也會降低對正確靶點的結(jié)合效率。最近，利用RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)來表達SgRNA，可以更好的控制SgRNA表達量［37］。此外，還可以直接注入重組Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的SgRNA，來代替細胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達方法［38，39］。由于這些外來的Cas9和SgRNA會很快降解，相當于降低了有效Cas9/SgRNA的豐度，這樣也可以減少脫靶效應(yīng)。

2.2 應(yīng)用單切口酶活性突變體dCas9

如果對Cas9切割雙鏈DNA結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵位點進行堿基突變，那么可以獲得只能切割一條DNA或者沒有切割能力的突變體dCas9蛋白［40，41］。如果用只有一個切口酶活性的突變體dCas9，配合一個SgRNA切開一條DNA鏈，然后dCas9再配合另一個SgRNA在相鄰區(qū)域的互補DNA鏈中也只切開一個切口，那么兩條鏈上臨近的兩個切口同樣會形成雙鏈斷裂，后面的試驗可以正常進行。如果一條SgRNA錯配，只會形成一個切口，不會形成雙鏈斷裂，很快就會被細胞修復(fù)正常。而兩條SgRNA同時錯配，形成雙鏈斷裂的脫靶機率很小，這樣就極大地提高了靶點專一性。

類似的策略還有利用突變體dCas9與核酸酶FokI形成二聚體來降低脫靶效應(yīng)。FokI只有在形成二聚體時才會發(fā)揮核酸酶活性切割雙鏈DNA［42］，所以融合蛋白dCas9-FokI單體配合兩條SgRNA才能完成正確切割。而兩條SgRNA在臨近區(qū)域同時錯配的機率很小，所以極大地降低了脫靶效應(yīng)［43，44］。

2.3 改變SgRNA的序列

改變SgRNA的結(jié)構(gòu)和序列長度，已經(jīng)被證明是可行的降低脫靶效應(yīng)的方法。例如，有一些SgRNA的5'端加上GG可以降低脫靶效應(yīng)［45］。將SgRNA的引導(dǎo)序列截短到17-18個核苷酸，而不是標準的20個核苷酸，在保證一定結(jié)合靶點效率的基礎(chǔ)上，也可以大大降低脫靶效應(yīng)［31］。如果不考慮與靶點結(jié)合的效率，那么應(yīng)用這種截短的SgRNA是簡易方便的降低脫靶效應(yīng)的方法。

2.4 新品種Cas9蛋白

SpCas9蛋白是最早研究和應(yīng)用最廣的Cas9，現(xiàn)在其他菌株中的Cas9也開始被鑒定并應(yīng)用到基因工程中。利用新菌株中的Cas9替代SpCas9蛋白質(zhì)和改變其蛋白質(zhì)構(gòu)象也會提高特異性。由于不同細菌來源的Cas9蛋白質(zhì)表現(xiàn)出不同的PAM序列［46］，所以影響了對靶點的專一性，通過檢測全基因組范圍的結(jié)合和切割效率，證明新的Cas9蛋白明顯提高了靶點專一性。還有通過體外蛋白質(zhì)工程改變晶體結(jié)構(gòu)，完全有可能設(shè)計出新的高特異性的Cas9蛋白。

3 降低脫靶效應(yīng)的設(shè)計工具

可以幫助尋找SgRNA潛在脫靶位點的在線工具，見表1。

表1 預(yù)測SgRNA潛在脫靶位點的在線工具

對于每個開發(fā)出來的設(shè)計SgRNA靶點的工具，首要考慮的就是如何在基因組上避免脫靶效應(yīng)，有些工具對給出的SgRNA還可以提供可能的脫靶位點［22，47-49，51］。通常用脫靶位點的數(shù)目，或者評價得分的加權(quán)和來評估設(shè)計結(jié)果的好壞。由于這些工具在具體算法上各自不同，預(yù)測出來的脫靶數(shù)目和位置結(jié)果也有所差異，但在設(shè)計序列時都力求最小的脫靶效應(yīng)。例如，根據(jù)靶點位置，有的工具注重考慮在引導(dǎo)過程中的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）和二級結(jié)構(gòu)［49］，對SgRNA選擇靶點的影響［53］，或者基因組本身特點如外顯子、CpG島對SgRNA效率的影響［47，51］；有的工具包含了已有的系統(tǒng)突變研究［22］，或者用戶輸入懲罰的數(shù)據(jù)（E-CRISP）［51］，在定位和錯配的基礎(chǔ)上分別計算脫靶效應(yīng)；有的工具對脫靶效應(yīng)的計算采用二進制標準，對整個引導(dǎo)區(qū)（Cas-OFFinder）［50］，或者確定的PAM臨近和遠端區(qū)域（CHOPCHOP，CasOT off-Targeter and Cas9 Design）［47-49］，錯配率小于一個具體數(shù)值；有時也并不考慮錯配的位置和數(shù)目，而是用Cas9切割位點的效率來計算和PAM錯配［21，22，30］。顯而易見，每種工具都有自己的優(yōu)勢和特色。需要注意的是，對于研究較少的生物，研究者挑選的設(shè)計CRISPR/Cas9靶點工具必須能夠接受用戶輸入基因組信息［48-50］，可選擇替換的PAM［47，48，50］，這樣才能得到自己的設(shè)計結(jié)果。

同時，CRISPR/Cas9的試驗?zāi)康囊彩且粋€重要的考慮因素，到底是追求與靶點結(jié)合的高效性，還是追求最小的脫靶效應(yīng)。例如，如果追求的是SgRNA的靶點高效性，不在意脫靶效應(yīng)，那么可以使用CHOPCHOP這類工具［47］。如果更關(guān)注脫靶效應(yīng)，則需要使用能夠定量預(yù)測脫靶效應(yīng)的工具，如CRISPR Design Tool 和E-CRISP［22，51］，獲得最小的脫靶效應(yīng)。總之，每種工具都有自己的特色，因此在實際設(shè)計過程中，可以將幾種工具結(jié)合使用，得到自己想要的理想結(jié)果。

4 展望

盡管已有很多研究，但是人們對決定Cas9/ SgRNA靶點專一性的重要因素和規(guī)則還是了解不夠，想要準確預(yù)測結(jié)合的具體位點還是有難度的。此外，人們對Cas9結(jié)合靶點之后的實際功能影響（如切割、突變和轉(zhuǎn)錄干擾）之間的關(guān)系也研究得不夠深入。甚至有些證據(jù)表明大多數(shù)的Cas9脫靶效應(yīng)是短暫的，并且對功能的沖擊很小。如轉(zhuǎn)錄組性能分析表明脫靶效應(yīng)對基因表達變化的影響可以忽略不計［35，40，41］，并且理論計算值表明Cas9結(jié)合對隨后基因表達的影響呈指數(shù)性衰減［54］。面對爭議，現(xiàn)在需要的是對全基因組范圍的結(jié)合、切割和轉(zhuǎn)錄組變化的數(shù)據(jù)進行對比，以此來驗證Cas9脫靶效應(yīng)究竟有多大的影響。

CRISPR/Cas9將在很長的一段時間里作為主流基因工程工具應(yīng)用到更多的研究領(lǐng)域，現(xiàn)在所用的減少脫靶效應(yīng)的可行性方法都在一定程度上犧牲了與靶點結(jié)合的效率。所以既要保證與靶點結(jié)合的效率，又要降低脫靶效應(yīng)，將是今后CRISPR/Cas9技術(shù)研究的一個熱點。

［1］ Ishino Y， Shinagawa H， Makino K， et al. Nucleotide sequence of the iap gene， responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli， and identification of the gene product［J］. J Bacteriol， 1987， 169（12）：5429-5433.

［2］ Hsu PD， Lander ES， Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering［J］. Cell， 2014， 157（6）：1262-1278.

［3］ Jansen R， Embden JD， Gaastra W， et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes［J］. Mol Microbiol， 2002， 43（6）：1565-1575.

［4］ Bolotin A， Quinquis B， Sorokin A， et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats（CRISPRs）have spacers of extrachromosomal origin［J］. Microbiology， 2005， 151（Pt 8）：2551-2561.

［5］ Mojica FJ， Diez-Villasenor C， Garcia-Martinez J， et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements［J］. J Mol Evol， 2005， 60（2）：174-182.

［6］ Pourcel C， Salvignol G， Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA， and provide additional tools for evolutionary studies［J］. Microbiology， 2005， 151（Pt 3）：653-663.

［7］ Marraffini LA， Sontheimer EJ. CRISPR interference：RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea［J］. Nat Rev Genet，2010， 11（3）：181-190.

［8］ Barrangou R， Marraffini LA. CRISPR-Cas systems：Prokaryotes upgrade to adaptive immunity［J］. Mol Cell， 2014， 54（2）：234-244.

［9］ Horvath P， Barrangou R. CRISPR/Cas， the immune system of bacteria and archaea［J］. Science， 2010， 327（5962）：167-170.

［10］ van der Oost J， Jore MM， Westra ER， et al. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes［J］. Trends Biochem Sci，2009， 34（8）：401-407.

［11］ Terns MP， Terns RM. CRISPR-based adaptive immune systems［J］. Curr Opin Microbiol， 2011， 14（3）：321-327.

［12］ Jinek M， Chylinski K， Fonfara I， et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity［J］. Science， 2012， 337（6096）：816-821.

［13］ Mali P， Esvelt KM， Church GM. Cas9 as a versatile tool for engineering biology［J］. Nat Methods， 2013， 10（10）：957-963.

［14］ Sander JD， Joung JK. CRISPR-Cas systems for editing， regulating and targeting genomes［J］. Nat Biotechnol， 2014， 32（4）：347-355.

［15］ Zhang Y， Ge X， Yang F， et al. Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells［J］. Sci Rep， 2014， 4：5405.

［16］ Xiao A， Wang Z， Hu Y， et al. Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish［J］. NucleicAcids Res， 2013， 41（14）：e141.

［17］ Liu D， Wang Z， Xiao A， et al. Efficient gene targeting in zebrafish mediated by a zebrafish-codon-optimized cas9 and evaluation of offtargeting effect［J］. J Genet Genomics， 2014， 41（1）：43-46.

［18］ Li J， Shou J， Guo Y， et al. Efficient inversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9［J］. J Mol Cell Biol， 2015， 7（4）：284-298.

［19］ Wang Y， Cheng X， Shan Q， et al. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew［J］. Nat Biotechnol， 2014， 32（9）：947-951.

［20］ Fu Y， Foden JA， Khayter C， et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells［J］. Nat Biotechnol， 2013， 31（9）：822-826.

［21］ Pattanayak V， Lin S， Guilinger JP， et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity［J］. Nat Biotechnol， 2013， 31（9）：839-843.

［22］ Hsu PD， Scott DA， Weinstein JA， et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases［J］. Nat Biotechnol， 2013， 31（9）：827-832.

［23］ Wu X， Kriz AJ， Sharp PA. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system［J］. Quant Biol， 2014， 2（2）：59-70.

［24］ Garneau JE， Dupuis ME， Villion M， et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA［J］. Nature， 2010， 468（7320）：67-71.

［25］ Zhang Y， Heidrich N， Ampattu BJ， et al. Processing-independent CRISPR RNAs limit natural transformation in Neisseria meningitidis［J］. Mol Cell， 2013， 50（4）：488-503.

［26］ Nishimasu H， Ran FA， Hsu PD， et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA［J］. Cell， 2014， 156（5）：935-949.

［27］ Wu X， Scott DA， Kriz AJ， et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells［J］. Nat Biotechnol， 2014， 32（7）：670-676.

［28］ Mali P， Yang L， Esvelt KM， et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9［J］. Science， 2013， 339（6121）：823-826.

［29］ Chen B， Gilbert LA， Cimini BA， et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system［J］. Cell， 2013， 155（7）：1479-1491.

［30］ Ran FA， Hsu PD， Lin CY， et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity［J］. Cell，2013， 154（6）：1380-1389.

［31］ Fu Y， Sander JD， Reyon D， et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs［J］. Nat Biotechnol，2014， 32（3）：279-284.

［32］ Jiang W， Bikard D， Cox D， et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems［J］. Nat Biotechnol， 2013，31（3）：233-239.

［33］ Cong L， Ran FA， Cox D， et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems［J］. Science， 2013， 339（6121）：819-823.

［34］ O'Geen H， Henry IM， Bhakta MS， et al. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture［J］. Nucleic Acids Res， 2015， 43（6）：3389-3404.

［35］ Perez-Pinera P， Kocak DD， Vockley CM， et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors［J］. Nat Methods， 2013， 10（10）：973-976.

［36］ Gabriel R， Lombardo A， Arens A， et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity［J］. Nat Biotechnol，2011， 29（9）：816-823.

［37］ Kiani S， Beal J， Ebrahimkhani MR， et al. CRISPR transcriptional repression devices and layered circuits in mammalian cells［J］. Nat Methods， 2014， 11（7）：723-726.

［38］ Kim S， Kim D， Cho SW， et al. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins［J］. Genome Res， 2014， 24（6）：1012-1019.

［39］ Ramakrishna S， Kwaku Dad AB， Beloor J， et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA［J］. Genome Res， 2014， 24（6）：1020-1027.

［40］ Cheng AW， Wang H， Yang H， et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on， an RNA-guided transcriptional activator system［J］. Cell Res， 2013， 23（10）：1163-1171.

［41］ Gilbert LA， Larson MH， Morsut L， et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes［J］. Cell，2013， 154（2）：442-451.

［42］ Bitinaite J， Wah DA， Aggarwal AK， et al. FokI dimerization is required for DNA cleavage［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1998，95（18）：10570-10575.

［43］ Guilinger JP， Thompson DB， Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification［J］. Nat Biotechnol， 2014， 32（6）：577-582.

［44］ Tsai SQ， Wyvekens N， Khayter C， et al. Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing［J］. Nat Biotechnol， 2014， 32（6）：569-576.

［45］ Cho SW， Kim S， Kim Y， et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases［J］. Genome Res， 2014， 24（1）：132-141.

［46］ Wang T， Wei JJ， Sabatini DM， et al. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system［J］. Science， 2014， 343（6166）：80-84.

［47］ Montague TG， Cruz JM， Gagnon JA， et al. CHOPCHOP：a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing［J］. Nucleic Acids Res， 2014， 42（Web Server issue）：W401-407.

［48］ Xiao A， Cheng Z， Kong L， et al. CasOT：a genome-wide Cas9/ gRNA off-target searching tool［J］. Bioinformatics， 2014， 30（8）：1180-1182.

［49］ Ma M， Ye AY， Zheng W， et al. A guide RNA sequence design platform for the CRISPR/Cas9 system for model organism genomes［J］. Biomed Res Int， 2013.doi：10.1155120131270805.

［50］ Bae S， Park J， Kim JS. Cas-OFFinder：a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases［J］. Bioinformatics， 2014， 30（10）：1473-1475.

［51］ Heigwer F， Kerr G， Boutros M. E-CRISP：fast CRISPR target site identification［J］. Nat Methods， 2014， 11（2）：122-123.

［52］ Shen B， Zhang W， Zhang J， et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects［J］. Nat Methods， 2014， 11（4）：399-402.

［53］ Makarova KS， Haft DH， Barrangou R， et al. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems［J］. Nat Rev Microbiol，2011， 9（6）：467-477.

［54］ Mali P， Aach J， Stranges PB， et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering［J］. Nat Biotechnol， 2013， 31（9）：833-838.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Off-target of CRISPR/Cas9 System

YIN Shen HE Gui-fang LAI Fang-nong XIE Feng-yun MA Jun-yu
（Institute of Reproductive Science，Key Laboratory of Animal Reproduction and Germplasm Enhancement in Universities of Shandong，College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109）

As an adaptive immune system discovered in bacteria，clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated protein 9（Cas9）technology has been used as the most effective genome-editing tool. By now，CRISPR/Cas9 has shown a great promise in healing human genetic diseases，however，off-target is a critical issue while applying it. The off-target of CRISPR/Cas9 leads to the false phenotype and wrong interpretation. Optimization of on-target activity and minimizing off-target activity will be challenges while CRISPR/Cas9 is applied in the future. In this review，we focused on the off-target related issues，including factors involved in the target specificity，strategies and tools of minimizing the off-target of CRISPR/Cas9.

off-target；target specificity；CRISPR/Cas9

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.006

2015-06-02

國家自然科學(xué)基金項目（31401276）；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金（6631115025）

尹珅，博士，教授，研究方向：生殖生物學(xué)；E-mail：syin@qau.edu.cn

馬俊宇，博士，副教授，研究方向：生殖生物學(xué)；E-mail：jyma@qau.edu.cn